नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae में Submitochondrial प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन
Summary
हाल की प्रगति के बावजूद, कई खमीर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन अभी भी अपने कार्यों के साथ पूरी तरह से अज्ञात हैं। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन के सबमिटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है, जो उनके आणविक कार्यों के स्पष्टीकरण के लिए मौलिक रहा है।
Abstract
खमीर माइटोकॉन्ड्रियल proteome के लक्षण वर्णन में हाल ही में प्रगति के बावजूद, प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण संख्या के submitochondrial स्थानीयकरण मायावी रहता है। यहां, हम खमीर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के सबऑर्गनेलर स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत और प्रभावी विधि का वर्णन करते हैं, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन फ़ंक्शन स्पष्टीकरण के दौरान एक मौलिक कदम माना जाता है। इस विधि में एक प्रारंभिक चरण शामिल है जिसमें अत्यधिक शुद्ध बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त करना शामिल है। इन माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी को तब हाइपोटोनिक शॉक (सूजन) और प्रोटीनेज के (प्रोटीज) के साथ इनक्यूबेशन से मिलकर एक सबफ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल के अधीन किया जाता है। सूजन के दौरान, बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को चुनिंदा रूप से बाधित किया जाता है, जिससे प्रोटीनेज के को इंटरमेम्ब्रेन स्पेस डिब्बे के प्रोटीन को पचाने की अनुमति मिलती है। समानांतर में, झिल्ली प्रोटीन की टोपोलॉजी के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी को शुरू में सोनिकेटेड किया जाता है, और फिर सोडियम कार्बोनेट के साथ क्षारीय निष्कर्षण के अधीन किया जाता है। अंत में, centrifugation के बाद, इन विभिन्न उपचारों से गोली और supernatant अंशों SDS-PAGE और पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. सबमिटोकोंड्रियल स्थानीयकरण के साथ-साथ ब्याज के प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी ज्ञात मानकों के साथ अपने पश्चिमी धब्बा प्रोफ़ाइल की तुलना करके प्राप्त की जाती है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आवश्यक ऑर्गेनेल हैं जो बायोएनर्जेटिक्स, सेलुलर चयापचय और सिग्नलिंग मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन कार्यों को ठीक से निष्पादित करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया उनकी संरचना और कार्य के लिए जिम्मेदार प्रोटीन और लिपिड के एक अद्वितीय सेट पर भरोसा करते हैं। नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae व्यापक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं पर जांच के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है, साथ ही साथ अन्य organelles2 के लिए। खमीर में केवल आठ प्रोटीन के लिए माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम कोड; माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के विशाल बहुमत (~ 99%) परमाणु जीन द्वारा एन्कोडेड होते हैं, जिन्हें साइटोसोलिक राइबोसोम पर अनुवादित किया जाता है, और बाद में परिष्कृत प्रोटीन आयात मशीनरी 3,4,5 द्वारा उनके सही सबमिटोकोंड्रियल डिब्बों में आयात किया जाता है। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम 6,7 दोनों की समन्वित अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस में दोष पैदा करने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन मानव रोगों 8,9,10 से जुड़े हुए हैं।
पिछले दो दशकों में, अत्यधिक-शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करने वाले उच्च-थ्रूपुट प्रोटिओमिक अध्ययनों के परिणामस्वरूप खमीर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम का एक व्यापक लक्षण वर्णन हुआ, जिसे कम से कम 900 प्रोटीन 11,12,13,14 से बना होने का अनुमान लगाया गया है। यद्यपि इन अध्ययनों ने मूल्यवान जानकारी प्रदान की, चार माइटोकॉन्ड्रियल उप-घटकों में प्रत्येक प्रोटीन का सबऑर्गनेलर स्थानीयकरण, अर्थात्, बाहरी झिल्ली (ओएम), इंटरमेम्ब्रेन स्पेस (आईएमएस), आंतरिक झिल्ली (आईएम), और मैट्रिक्स, अभी भी आवश्यक है। इस प्रश्न को आंशिक रूप से दो छोटे माइटोकॉन्ड्रियल उप-घटकों (ओएम और आईएमएस) 15,16 के प्रोटिओमिक-वाइड अध्ययनों के साथ संबोधित किया गया था। हाल ही में, Vögtle और सहयोगियों ने खमीर में submitochondrial प्रोटीन वितरण का एक उच्च गुणवत्ता वाला वैश्विक नक्शा उत्पन्न करके एक बड़ा कदम आगे बढ़ाया। SILAC-आधारित मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, विभिन्न submitochondrial फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल, और OM और IMS proteomes से सेट किए गए डेटा के संयोजन के एक एकीकृत दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, लेखकों ने 818 प्रोटीन को चार माइटोकॉन्ड्रियल उप-घटकों में सौंपा।
इन उच्च-थ्रूपुट प्रोटिओमिक अध्ययनों द्वारा प्राप्त प्रगति के बावजूद, सबमिटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम संरचना के बारे में हमारा ज्ञान पूरा होने से बहुत दूर है। दरअसल, खमीर माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानीयकृत होने के रूप में Vögtle और सहयोगियों द्वारा रिपोर्ट किए गए 986 प्रोटीनों में से, 168 को चार सबमिटोकोंड्रियल डिब्बों में से किसी में भी असाइन नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, लेखकों ने प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी के बारे में जानकारी प्रदान नहीं की थी, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की परिधि से परिधीय रूप से जुड़े होने की भविष्यवाणी की गई थी। उदाहरण के लिए, यह जानना संभव नहीं है कि क्या एक प्रोटीन जिसे आंतरिक झिल्ली से परिधीय रूप से जुड़ा हुआ सौंपा गया था, मैट्रिक्स या इंटरमेम्ब्रेन स्पेस का सामना कर रहा है। proteome-व्यापक अध्ययनों से इन लापता डेटा के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण संख्या के suborganellar स्थानीयकरण के बारे में परस्पर विरोधी जानकारी हैं। एक उदाहरण प्रोटीज Prd1 है, जिसे Saccharomyces जीनोम डेटाबेस (SGD) और Uniprot जैसे सामान्य डेटाबेस में एक इंटरमेम्ब्रेन स्पेस प्रोटीन के रूप में असाइन किया गया है। हैरानी की बात है, यहां वर्णित के समान एक सबफ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, Vögtle और सहयोगियों ने स्पष्ट रूप से दिखाया कि Prd1 एक वास्तविक मैट्रिक्स प्रोटीन 13 है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, कई माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के सबमिटोकोंड्रियल स्थानीयकरण को स्पष्ट या पुनर्मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। यहां, हम खमीर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के सबऑर्गनेलर स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न शोध समूहों द्वारा विकसित और अनुकूलित किया गया था और नियमित रूप से सबमिटोकोंड्रियल स्थानीयकरण, साथ ही साथ कई माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है और सबमिटोकोंड्रियल डिब्बों में प्रोटीन स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए लंबे समय तक लगातार अनुकूलित किया गया है13,14,18,21,22,23।<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ ए Tzagoloff (कोलंबिया विश्वविद्यालय) submitochondrial मार्कर प्रोटीन साइट के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए धन्यवाद. b2, αKGD, और Sco1. हम इस प्रोटोकॉल की स्थापना के दौरान उपयोगी चर्चा और टिप्पणियों के लिए डॉ मारियो हेनरिक डी बैरोस (Universidade de Sao Paulo) को भी धन्यवाद देते हैं।
इस काम Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) (अनुदान 2013/07937-8) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित था।
फर्नांडो गोम्स और हेलेना तुरानो भी FAPESP द्वारा समर्थित हैं, क्रमशः 2017/09443-3 और 2017/23839-7 अनुदान देते हैं। Angélica Ramos भी Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) द्वारा समर्थित है।
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
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