Vurdering av lokalisering av submitochondrialprotein i spirende gjær saccharomyces cerevisiae

Summary

Til tross for nylige fremskritt forblir mange gjær mitokondrieproteiner fortsatt med sine funksjoner helt ukjente. Denne protokollen gir en enkel og pålitelig metode for å bestemme sendokondrie lokalisering av proteiner, som har vært grunnleggende for belysning av deres molekylære funksjoner.

Abstract

Til tross for nylige fremskritt i karakteriseringen av gjær mitokondrieproteom, forblir den submitochondriale lokaliseringen av et betydelig antall proteiner unnvikende. Her beskriver vi en robust og effektiv metode for å bestemme suborganellar lokalisering av gjær mitokondrieproteiner, som regnes som et grunnleggende skritt under mitokondrieproteinfunksjonsbelystelse. Denne metoden innebærer et innledende trinn som består av å skaffe seg svært rene intakte mitokondrier. Disse mitokondriepreparatene blir deretter utsatt for en subfraksjonsprotokoll som består av hypotonisk sjokk (hevelse) og inkubasjon med proteinase K (protease). Under hevelse blir den ytre mitokondriemembranen selektivt forstyrret, slik at proteinase K kan fordøye proteiner i det intermembrane romrommet. Parallelt, for å få informasjon om topologien til membranproteiner, blir mitokondriepreparatene i utgangspunktet sonikert, og deretter utsatt for alkalisk ekstraksjon med natriumkarbonat. Til slutt, etter sentrifugering, analyseres pellets og supernatante fraksjoner fra disse forskjellige behandlingene av SDS-PAGE og vestlig blot. Submitochondrial lokalisering samt membrantopologien til proteinet av interesse oppnås ved å sammenligne sin vestlige blotprofil med kjente standarder.

Introduction

Mitokondrier er essensielle organeller av eukaryote celler som spiller avgjørende roller i bioenergi, cellulær metabolisme og ^signalveier1. For å utføre disse oppgavene riktig, er mitokondrier avhengige av et unikt sett med proteiner og lipider som er ansvarlige for deres struktur og funksjon. Den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae har blitt mye brukt som et modellsystem for undersøkelser av mitokondrieprosesser, så vel som for andre ^organeller2. Mitokondriegenomkodene for bare åtte proteiner i gjær; De aller fleste mitokondrieproteiner (~ 99%) er kodet av kjernegener, som oversettes på cytosoliske ribosomer, og deretter importeres til deres riktige submitochondrialrom av sofistikerte proteinimportmaskiner3,4,5. Dermed avhenger mitokondriebiogenese av det koordinerte uttrykket av både nukleære og mitokondriegenomer6,7. Genetiske mutasjoner som forårsaker defekter i mitokondriebiogenese er forbundet med menneskelige ^{sykdommer8,9,10}.

I løpet av de siste to tiårene har proteomiske studier med høy gjennomstrømning rettet mot svært rensede mitokondrier resultert i en omfattende karakterisering av gjær mitokondrieproteom, som har blitt anslått å bestå av minst 900 proteiner11,12,13,14. Selv om disse studiene ga verdifull informasjon, er det fortsatt nødvendig med suborganellar lokalisering av hvert protein i de fire mitokondrieunderkomponentene, nemlig den ytre membranen (OM), intermembrane plass (IMS), indre membran (IM) og matrise. Dette spørsmålet ble delvis tatt opp med proteomiske studier av de to mindre mitokondrie-subcompartments (OM og IMS)^15,16. Mer nylig gjorde Vögtle og samarbeidspartnere et stort skritt fremover ved å generere et globalt kart av høy kvalitet over submitochondrial proteinfordeling i gjær. Ved hjelp av en integrert tilnærming som kombinerer SILAC-basert kvantitativ massespektrometri, forskjellige submitochondrial fraksjoneringsprotokoller og datasettet fra OM- og IMS-proteomene, tildelte forfatterne 818 proteiner i de fire mitokondrie-subcompartments13.

Til tross for fremskrittene som oppnås av disse proteomiske studiene med høy gjennomstrømning, er vår kunnskap om den innsendingsorienterte proteomsammensetningen langt fra komplett. Faktisk, blant 986 proteiner rapportert av Vögtle og samarbeidspartnere som lokalisert til gjær mitokondrier, kunne 168 ikke tildeles i noen av de fire submitochondrialrom13. Videre ga forfatterne ikke informasjon om membrantopologien til proteiner som ble spådd å være perifert festet til perifert perifert av mitokondriemembraner. For eksempel er det ikke mulig å vite om et protein som ble tildelt som perifert festet til den indre membranen, vender mot matrisen eller intermembranerommet. Bortsett fra disse manglende dataene fra de proteome-brede studiene, er det motstridende informasjon om suborganellar lokalisering av et betydelig antall mitokondrieproteiner. Et eksempel er protease Prd1, som har blitt tildelt som et intermembrane romprotein i de vanlige databasene som Saccharomyces Genome Database (SGD) og Uniprot. Overraskende nok viste Vögtle og samarbeidspartnere tydelig at Prd1 er et ekte ^{matriseprotein13} ved hjelp av en subfraksjonsprotokoll som ligner den som er beskrevet her. Som nevnt ovenfor må submitochondrial lokalisering av mange mitokondrieproteiner belyses eller revurderes. Her tilbyr vi en enkel og pålitelig protokoll for å bestemme suborganellar lokalisering av gjær mitokondrieproteiner. Denne protokollen ble utviklet og optimalisert av ulike forskningsgrupper og har rutinemessig blitt brukt til å bestemme submitochondrial lokalisering, samt membrantopologien til mange mitokondrieproteiner.

Protocol

1. Vekst av gjærceller Isoler enkeltkolonier av interessestammen ved å strekke en liten del av cellene fra en -80 °C glyserolbestand på en YPD (1% gjærekstrakt, 2% peptone, 2% glukose) agarplate. Inkuber platen ved 30 °C i 2-3 dager.MERK: S. cerevisiae-stammen som brukes i denne protokollen er avledet fra BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; møtte15Δ0; ura3Δ0). Med unntak av auxotrofiske markørgener inneholder de…

Representative Results

Suksessen til submitochondrial fraksjoneringsprotokoll avhenger av å skaffe svært rensede intakte mitokondrier. For dette er det viktig at organellenes intakthet under gjærcellelysene forblir nesten helt bevart. Dette oppnås ved å bruke en cellelysprotokoll som kombinerer den enzymatiske fordøyelsen av celleveggen etterfulgt av fysisk forstyrrelse av plasmamembranen ved hjelp av en Dounce homogenisator. Mitokondrieinnholdet samles deretter inn ved differensial sentrifugering. Denne subcellulære fraksjoneringen gir…

Discussion

Protokollen som presenteres her har blitt vellykket brukt og kontinuerlig optimalisert i lang tid for å bestemme proteinlokaliseringen i submitochondrial-rommene13,14,18,21,22,23. Påliteligheten og reproduserbarheten til denne protokollen er sterkt avhengig av renheten og integriteten til mitokondriepreparater18.<sup class=…

Materials

Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast extract	BD	212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A7030	Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815	Component of DDT buffer
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Proteinase K	Sigma-Aldrich
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma-Aldrich	T6399
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, Irvine, CA	320921	Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast