Bedömning av inochondriell proteinlokalisering i spirande jäst sackaromyces cerevisiae

Summary

Trots de senaste framstegen finns många jäst mitokondriella proteiner fortfarande kvar med sina funktioner helt okända. Detta protokoll ger en enkel och pålitlig metod för att bestämma den inochondriella lokaliseringen av proteiner, vilket har varit grundläggande för att klargöra deras molekylära funktioner.

Abstract

Trots de senaste framstegen i karakteriseringen av jäst mitokondriellt proteom, är den inochondriella lokaliseringen av ett betydande antal proteiner fortfarande svårfångad. Här beskriver vi en robust och effektiv metod för att bestämma suborganellar lokalisering av jäst mitokondriella proteiner, som anses vara ett grundläggande steg under mitokondriell protein funktion klarering. Denna metod innebär ett första steg som består av att erhålla mycket ren intakt mitokondrier. Dessa mitokondriella preparat utsätts sedan för ett subfractionationsprotokoll bestående av hypoton chock (svullnad) och inkubation med proteinas K (proteas). Under svullnad störs det yttre mitokondriella membranet selektivt, vilket gör det möjligt för proteinaset K att smälta proteiner i det intermembrana rymdutrymmet. Parallellt, för att få information om topologin av membranproteiner, soniskas först mitokondriella preparat och utsätts sedan för alkalisk extraktion med natriumkarbonat. Slutligen, efter centrifugering, analyseras pellet- och supernatantfraktionerna från dessa olika behandlingar av SDS-PAGE och western blot. Den submitochondriella lokaliseringen samt membrantopologin hos proteinet av intresse erhålls genom att jämföra dess västra fläckprofil med kända standarder.

Introduction

Mitokondrier är viktiga organeller av eukaryota celler som spelar avgörande roller i bioenergetik, cellulär metabolism och signaleringsvägar1. För att korrekt utföra dessa uppgifter förlitar sig mitokondrier på en unik uppsättning proteiner och lipider som ansvarar för deras struktur och funktion. Den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har använts i stor utsträckning som modellsystem för undersökningar av mitokondriella processer, liksom för andra ^organeller2. Mitokondriellt genom kodar för endast åtta proteiner i jäst; De allra flesta mitokondriella proteiner (~99%) kodas av nukleära gener, som översätts på cytosola ribosomer, och därefter importeras till sina korrekta inochondriella fack av sofistikerade proteinimportmaskiner3,4,5. Således är mitokondriell biogenes beroende av det samordnade uttrycket av både det nukleära och mitokondriella ^genomet6,7. Genetiska mutationer orsakar defekter i mitokondriell biogenes är associerade med mänskliga sjukdomar8,9,10.

Under de senaste två decennierna har proteomiska studier med hög genomströmning riktade mot högrenade mitokondrier resulterat i en omfattande karakterisering av jäst mitokondriell proteom, som har uppskattats bestå av minst 900 proteiner11,12,13,14. Även om dessa studier gav värdefull information, krävs suborganellar lokalisering av varje protein i de fyra mitokondriella underparterna, nämligen det yttre membranet (OM), intermembrane space (IMS), inre membran (IM) och matris, fortfarande. Denna fråga behandlades delvis med proteomisk-omfattande studier av de två mindre mitokondriella underparterna (OM och IMS)^15,16. På senare tid har Vögtle och samarbetspartners tagit ett stort steg framåt genom att ta fram en högkvalitativ global karta över inochondriell proteindistribution i jäst. Med hjälp av en integrerad metod som kombinerar SILAC-baserad kvantitativ masspektrometri, olika inochondriella fraktioneringsprotokoll och datauppsättningen från OM- och IMS-proteomerna, tilldelade författarna 818 proteiner till de fyra mitokondriella ^{underparterna13}.

Trots de framsteg som uppnåtts av dessa proteomiska studier med hög genomströmning är vår kunskap om den inochondriella proteomkompositionen långt ifrån fullständig. Bland 986 proteiner som rapporterats av Vögtle och kollaboratörer som lokaliserade till jäst mitokondrier, kunde 168 inte tilldelas i något av de fyra submitochondrial ^facken13. Dessutom gav författarna inte information om membran topologin av proteiner som förutspåddes vara perifert fäst vid periferin av mitokondriella membran. Det är till exempel inte möjligt att veta om ett protein som tilldelades som perifert fäst vid det inre membranet är vänd mot matrisen eller det intermembrana utrymmet. Bortsett från dessa saknade data från de proteomomfattande studierna finns det motstridig information om suborganellar lokalisering av ett betydande antal mitokondriella proteiner. Ett exempel är proteasen Prd1, som har tilldelats som ett intermembran rymdprotein i de gemensamma databaserna som Saccharomyces Genome Database (SGD) och Uniprot. Överraskande, med hjälp av ett subfractionation protokoll som liknar det som beskrivs här, visade Vögtle och kollaboratörer tydligt att Prd1 är en äkta ^{matrisprotein13}. Som nämnts ovan måste den inochondriella lokaliseringen av många mitokondriella proteiner klargöras eller omvärderas. Här tillhandahåller vi ett enkelt och tillförlitligt protokoll för att bestämma suborganellar lokalisering av jäst mitokondriella proteiner. Detta protokoll utvecklades och optimerades av olika forskargrupper och har rutinmässigt använts för att bestämma den inochondriella lokaliseringen, liksom membrantopologin hos många mitokondriella proteiner.

Protocol

1. Tillväxt av jästceller Isolera enstaka kolonier av intressestammen genom att strimla en liten del av cellerna från en -80 °C glycerolbuljong på en YPD (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos) agarplatta. Inkubera plattan vid 30 °C i 2-3 dagar.OBS: S. cerevisiae-stammen som används i detta protokoll härrör från BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Med undantag för de auxotrofa markörgenerna…

Representative Results

Framgången för submitochondrial fraktionering protokoll beror på att erhålla högt renade intakt mitokondrier. För detta är det viktigt att under jästcelllysen förblir organellernas intakthet nästan helt bevarad. Detta uppnås genom att använda ett celllysprotokoll som kombinerar cellväggens enzymatiska matsmältning följt av fysisk störning av plasmamembranet med hjälp av en Dounce homogenisator. Mitokondriellt innehåll samlas sedan in genom differentiell centrifugering. Denna subcellulära fraktionering …

Discussion

Protokollet som presenteras här har framgångsrikt använts och kontinuerligt optimerats under lång tid för att bestämma proteinlokaliseringen i de inochondriella facken13,14,18,21,22,23. Tillförlitligheten och reproducerbarheten av detta protokoll är starkt beroende av renheten och integriteten hos mitokondriella <sup …

Materials

Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast extract	BD	212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A7030	Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815	Component of DDT buffer
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Proteinase K	Sigma-Aldrich
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma-Aldrich	T6399
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, Irvine, CA	320921	Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast