माइक्रोइंजेक्शन द्वारा स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियों में ट्रांसजेनिक्स और नॉकआउट उत्पन्न करना
Summary
परजीवी नेमाटोड स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्टरकोरलिस और स्ट्रॉन्गिलॉइड्स रत्ती के लिए कार्यात्मक जीनोमिक टूलकिट में ट्रांसजेनेसिस, सीआरआईएसपीआर / यह प्रोटोकॉल प्रदर्शित करेगा कि ट्रांसजेन और सीआरआईएसपीआर घटकों को एस स्टरकोरलिस और एस रत्ती में पेश करने के लिए इंट्रागोनाडल माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग कैसे किया जाए।
Abstract
जीनस स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में विभिन्न मेजबान श्रेणियों के साथ त्वचा-मर्मज्ञ नेमाटोड की कई प्रजातियां होती हैं, जिनमें स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्टरकोरलिस और स्ट्रॉन्गिलॉइड्स रत्ती शामिल हैं। एस स्टरकोरलिस एक मानव-परजीवी, त्वचा-मर्मज्ञ सूत्रकृमि है जो लगभग 610 मिलियन लोगों को संक्रमित करता है, जबकि चूहा परजीवी एस रत्ती एस स्टरकोरलिस से निकटता से संबंधित है और अक्सर एस स्टरकोरलिस के लिए प्रयोगशाला मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। रत्ती दोनों इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन की बहिर्जात न्यूक्लिक एसिड डिलीवरी तकनीक के माध्यम से ट्रांसजेनिक्स और नॉकआउट की पीढ़ी के लिए आसानी से उत्तरदायी हैं, और इस तरह, अन्य परजीवी हेल्मिंथ के लिए मॉडल सिस्टम के रूप में उभरे हैं जो अभी तक इस तकनीक के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।
परजीवी स्ट्रॉन्गिलॉइड्स वयस्क अपने मेजबान की छोटी आंत में निवास करते हैं और मल के माध्यम से पर्यावरण में संतान को छोड़ते हैं। एक बार पर्यावरण में, लार्वा मुक्त रहने वाले वयस्कों में विकसित होता है, जो मल में रहते हैं और संतान पैदा करते हैं जिन्हें एक नए मेजबान को ढूंढना और आक्रमण करना चाहिए। यह पर्यावरणीय पीढ़ी स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियों के लिए अद्वितीय है और मॉडल मुक्त-जीवित सूत्रकृमि केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस के लिए आकृति विज्ञान में काफी समान है कि सी एलिगेंस के लिए विकसित तकनीकों को इन परजीवी सूत्रकृमि के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन भी शामिल है। इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करके, विभिन्न प्रकार के ट्रांसजेन को स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में पेश किया जा सकता है। कैस 9 घटकों को उत्परिवर्ती स्ट्रॉन्गिलॉइड्स लार्वा बनाने के लिए माइक्रोइंजेक्ट भी किया जा सकता है। यहां, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन की तकनीक, जिसमें मुक्त रहने वाले वयस्कों की तैयारी, इंजेक्शन प्रक्रिया और ट्रांसजेनिक संतान का चयन शामिल है, का वर्णन किया गया है। कैस 9 उत्परिवर्तजन का उपयोग करके बनाए गए ट्रांसजेनिक स्ट्रॉन्गिलॉइड्स लार्वा की छवियां शामिल हैं। इस पेपर का उद्देश्य अन्य शोधकर्ताओं को ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती स्ट्रॉन्गिलॉइड्स बनाने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करने में सक्षम बनाना है।
Introduction
स्ट्रॉन्गाइलॉइड्स स्टरकोरलिस को लंबे समय से अधिक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त हुकवर्म और राउंडवॉर्म एस्केरिस लुम्ब्रिकोइड्स की तुलना में एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ के रूप में अनदेखा किया गया है। कृमि के बोझ के पिछले अध्ययनों ने अक्सर एस स्टरकोरलिस के लिए सामान्य नैदानिक तरीकों की कम संवेदनशीलता के कारण एस स्टरकोरलिस के प्रसार को गंभीर रूप से कम करके आंका। हाल के वर्षों में, बेहतर नैदानिक उपकरणों के आधार पर महामारी विज्ञान के अध्ययन ने अनुमान लगाया है कि एस स्टरकोरलिस संक्रमण का वास्तविक प्रसार पहले की रिपोर्ट की तुलना में बहुत अधिक है, दुनिया भर में लगभग 610 मिलियन लोग2.
स्टरकोरलिस और अन्य स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियां, जिनमें बारीकी से संबंधित चूहा परजीवी और सामान्य प्रयोगशाला मॉडल एस रत्ती शामिल हैं, में एक असामान्य जीवन चक्र है जो प्रयोगात्मक जीनोमिक अध्ययनों के लिए फायदेमंद है क्योंकि इसमें परजीवी और मुक्त-जीवित (पर्यावरण) दोनों पीढ़ियां3 (चित्रा 1) शामिल हैं। विशेष रूप से, एस स्टरकोरलिस और एस रत्ती दोनों एक एकल मुक्त रहने वाली पीढ़ी के माध्यम से चक्र कर सकते हैं। मुक्त रहने वाली पीढ़ी में पोस्ट-परजीवी लार्वा होते हैं जो मुक्त रहने वाले वयस्क पुरुषों और महिलाओं में विकसित होते हैं; मुक्त रहने वाले वयस्कों की सभी संतान संक्रामक लार्वा में विकसित होती हैं, जिन्हें जीवन चक्र को जारी रखने के लिए एक मेजबान को संक्रमित करना चाहिए। इसके अलावा, इस पर्यावरणीय या मुक्त रहने वाली पीढ़ी को प्रयोगशाला में प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर किया जा सकता है। क्योंकि मुक्त रहने वाले स्ट्रॉन्गिलॉइड्स वयस्क और सी एलिगेंस वयस्क समान आकृति विज्ञान साझा करते हैं, इंट्रागोनैडल माइक्रोइंजेक्शन जैसी तकनीकें जो मूल रूप से सी एलिगेंस के लिए विकसित की गई थीं, उन्हें मुक्त रहने वाले वयस्क स्ट्रॉन्गिलॉइड्स 4,5 के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि डीएनए को आम तौर पर मुक्त रहने वाली वयस्क महिलाओं में पेश किया जाता है, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स के पुरुषों और महिलाओं दोनों को माइक्रोइंजेक्ट किया जा सकता है6. इस प्रकार, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स के जीव विज्ञान के कई पहलुओं से पूछताछ करने के लिए कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण उपलब्ध हैं। अन्य परजीवी सूत्रकृमि में मुक्त रहने वाली पीढ़ी की कमी होती है, और परिणामस्वरूप, कार्यात्मक जीनोमिकतकनीकों के लिए आसानी से उत्तरदायी नहीं होते हैं 3.
चित्र 1: स्ट्रॉन्गिलॉइड्स स्टरकोरलिस जीवन चक्र। स्टरकोरलिस परजीवी मादाएं अपने स्तनधारी मेजबानों (मनुष्य, गैर-मानव प्राइमेट, कुत्तों) की छोटी आंत में निवास करती हैं। परजीवी मादाएं पार्थेनोजेनेसिस द्वारा प्रजनन करती हैं और छोटी आंत के भीतर अंडे देती हैं। अंडे मेजबान के अंदर पोस्ट-परजीवी लार्वा में अभी भी हैच करते हैं, जो तब मल के साथ पर्यावरण में पारित होते हैं। यदि पोस्ट-परजीवी लार्वा नर हैं, तो वे मुक्त रहने वाले वयस्क पुरुषों में विकसित होते हैं। यदि पोस्ट-परजीवी लार्वा मादा हैं, तो वे या तो मुक्त-जीवित वयस्क महिलाओं (अप्रत्यक्ष विकास) या तीसरे चरण के संक्रामक लार्वा (आईएल 3 एस; प्रत्यक्ष विकास) में विकसित हो सकते हैं। मुक्त रहने वाले नर और मादा संतान बनाने के लिए यौन प्रजनन करते हैं जो आईएल 3 बनने के लिए विवश होते हैं। कुछ शर्तों के तहत, एस स्टरकोरलिस भी ऑटोइंफेक्शन से गुजर सकता है, जिसमें कुछ पोस्ट-परजीवी लार्वा मल में पर्यावरण में जाने के बजाय मेजबान आंत के अंदर रहते हैं। ये लार्वा मेजबान के अंदर ऑटोइंफेक्टिव लार्वा (एल 3 ए) में विकसित हो सकते हैं, आंतों की दीवार के माध्यम से प्रवेश कर सकते हैं, शरीर के माध्यम से पलायन कर सकते हैं, और अंततः प्रजनन वयस्क बनने के लिए आंत में लौट सकते हैं। एस रत्ती का जीवन चक्र समान है, सिवाय इसके कि एस रत्ती चूहों को संक्रमित करता है और इसमें एक ऑटोइंफेक्टिव चक्र नहीं होता है। पर्यावरण यी पीढ़ी आनुवंशिक अध्ययन के लिए स्ट्रॉन्गिलॉइड्स प्रजातियों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। मुक्त रहने वाली वयस्क महिलाओं (पी0) को माइक्रोइंजेक्ट किया जा सकता है; उनकी संतान, जो सभी आईएल 3 एस बन जाएंगी, संभावित एफ1 ट्रांसजेनिक्स हैं। इस आंकड़े को कास्टेलेटो एट अल से संशोधित किया गया है। 3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
स्टरकोरलिस मेजबान आक्रमण और मेजबान प्रतिरक्षा मॉडुलन सहित अन्य गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल मानव-परजीवी नेमाटोड के साथ अपने जीव विज्ञान के कई पहलुओं को साझा करता है। उदाहरण के लिए, जेनेरा नेकेटर और एन्सिलोस्टोमा में मानव-परजीवी हुकवर्म भी त्वचा के प्रवेश से संक्रमित होते हैं, शरीर के माध्यम से समान रूप से नेविगेट करते हैं, और अंततः छोटी आंत में परजीवी वयस्कों के रूप में रहते हैं7. इस प्रकार, कई गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल नेमाटोड संभवतः सामान्य संवेदी व्यवहार और प्रतिरक्षा अपवंचन तकनीकों का उपयोग करते हैं। नतीजतन, स्ट्रॉन्गिलॉइड्स से प्राप्त ज्ञान अन्य कम आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल नेमाटोड में निष्कर्षों का पूरक होगा और इन जटिल और महत्वपूर्ण परजीवियों की अधिक पूर्ण समझ का कारण बनेगा।
यह माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती संतान बनाने के लिए स्ट्रॉन्गिलॉइड्स मुक्त रहने वाली वयस्क महिलाओं में डीएनए पेश करने की विधि को रेखांकित करता है। माइक्रोइंजेक्शन के लिए वयस्क कीड़े के विकास के समय और ट्रांसजेनिक संतानों के संग्रह सहित तनाव रखरखाव आवश्यकताओं का वर्णन किया गया है। प्रोटोकॉल और पूर्ण माइक्रोइंजेक्शन तकनीक का प्रदर्शन, संवर्धन और स्क्रीनिंग ट्रांसजेनिक संतान के लिए प्रोटोकॉल के साथ, सभी आवश्यक उपकरणों और उपभोग्य सामग्रियों की सूची के साथ शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल ट्रांसजेनेसिस और सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता उत्परिवर्तन के लिए एस स्टरकोरलिस और एस रत्ती में निर्माण शुरू करने के तरीकों का विवरण देता है। रत्ती, इंजेक्शन …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पीपीवी 540 और पीपीवी 402 पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में डॉ जेम्स लोक से दयालु उपहार थे। हम पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए एस्ट्रा ब्रायंट को धन्यवाद देते हैं। इस काम को रोग के रोगजनन पुरस्कार में बरोज-वेलकम फंड जांचकर्ताओं, हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट फैकल्टी स्कॉलर अवार्ड और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ आर 01 डीसी 017959 (ई.ए.एच.) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
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