Generazione di transgenici e knockout in specie di Strongyloides mediante microiniezione

Summary

Il toolkit genomico funzionale per i nematodi parassiti Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti comprende transgenesi, mutagenesi mediata da CRISPR/Cas9 e RNAi. Questo protocollo dimostrerà come utilizzare la microiniezione intragonennale per introdurre transgeni e componenti CRISPR in S. stercoralis e S. ratti.

Abstract

Il genere Strongyloides è costituito da più specie di nematodi penetranti nella pelle con diverse gamme di ospiti, tra cui Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti. S. stercoralis è un nematode umano-parassitario, penetrante nella pelle che infetta circa 610 milioni di persone, mentre il parassita del ratto S. ratti è strettamente correlato a S. stercoralis ed è spesso usato come modello di laboratorio per S. stercoralis. Sia S. stercoralis che S. ratti sono facilmente suscettibili alla generazione di transgenici e knockout attraverso la tecnica di somministrazione esogena di acido nucleico della microiniezione intragonadiale e, come tali, sono emersi come sistemi modello per altri elminti parassiti che non sono ancora suscettibili a questa tecnica.

Gli adulti parassiti di Strongyloides abitano l’intestino tenue del loro ospite e rilasciano la progenie nell’ambiente attraverso le feci. Una volta nell’ambiente, le larve si sviluppano in adulti che vivono liberi, che vivono nelle feci e producono progenie che deve trovare e invadere un nuovo ospite. Questa generazione ambientale è unica per la specie Strongyloides e abbastanza simile nella morfologia al modello di nematode a vita libera Caenorhabditis elegans che le tecniche sviluppate per C. elegans possono essere adattate per l’uso con questi nematodi parassiti, compresa la microiniezione intragonadiale. Utilizzando la microiniezione intragonadiale, un’ampia varietà di transgeni può essere introdotta in Strongyloides. I componenti CRISPR/Cas9 possono anche essere microiniettati per creare larve mutanti di Strongyloides . Qui, viene descritta la tecnica di microiniezione intragonennale in Strongyloides, compresa la preparazione di adulti liberi, la procedura di iniezione e la selezione della progenie transgenica. Sono incluse immagini di larve transgeniche di Strongyloides create utilizzando la mutagenesi CRISPR/Cas9. Lo scopo di questo documento è quello di consentire ad altri ricercatori di utilizzare la microiniezione per creare Strongyloides transgenici e mutanti.

Introduction

Strongyloides stercoralis è stato a lungo trascurato come un importante agente patogeno umano rispetto agli anchilostomi più ampiamente riconosciuti e al nematode Ascaris lumbricoides¹. Precedenti studi sul carico di vermi spesso hanno gravemente sottovalutato la prevalenza di S. stercoralis a causa della bassa sensibilità dei metodi diagnostici comuni per S. stercoralis². Negli ultimi anni, studi epidemiologici basati su strumenti diagnostici migliorati hanno stimato che la vera prevalenza delle infezioni da S. stercoralis è molto più alta di quanto precedentemente riportato, circa 610 milioni di persone in tutto il mondo².

Sia S. stercoralis che altre specie di Strongyloides, tra cui il parassita di ratto strettamente correlato e il comune modello di laboratorio S. ratti, hanno un ciclo di vita insolito che è vantaggioso per gli studi genomici sperimentali perché consiste di generazioni sia parassitarie che libere viventi (ambientali)³ (Figura 1). In particolare, sia S. stercoralis che S. ratti possono attraversare un’unica generazione di vita libera. La generazione a vita libera è costituita da larve post-parassitarie che si sviluppano in maschi e femmine adulti che vivono liberi; tutta la progenie degli adulti che vivono liberi si sviluppa in larve infettive, che devono infettare un ospite per continuare il ciclo di vita. Inoltre, questa generazione ambientale o di vita libera può essere manipolata sperimentalmente in laboratorio. Poiché gli adulti Strongyloides a vita libera e gli adulti C. elegans condividono una morfologia simile, tecniche come la microiniezione intragonennale originariamente sviluppate per C. elegans possono essere adattate per l’uso con Strongyloides ^4,5 adulti a vita libera. Mentre il DNA viene generalmente introdotto nelle femmine adulte che vivono liberamente, sia i maschi che le femmine di Strongyloides possono essere microiniettati⁶. Pertanto, sono disponibili strumenti genomici funzionali per interrogare molti aspetti della biologia di Strongyloides. Altri nematodi parassiti mancano di una generazione di vita libera e, di conseguenza, non sono così facilmente suscettibili alle tecniche genomiche funzionali³.

Figura 1: Il ciclo di vita di Strongyloides stercoralis. Le femmine parassitarie di S. stercoralis abitano l’intestino tenue dei loro ospiti mammiferi (umani, primati non umani, cani). Le femmine parassitarie si riproducono per partenogenesi e depongono le uova all’interno dell’intestino tenue. Le uova si schiudono mentre sono ancora all’interno dell’ospite in larve post-parassitarie, che vengono poi passate nell’ambiente con le feci. Se le larve post-parassitarie sono maschi, si sviluppano in maschi adulti che vivono liberamente. Se le larve post-parassitarie sono femmine, possono svilupparsi in femmine adulte a vita libera (sviluppo indiretto) o larve infettive di terzo stadio (iL3s; sviluppo diretto). I maschi e le femmine che vivono liberi si riproducono sessualmente per creare progenie che sono costretti a diventare iL3. In determinate condizioni, S. stercoralis può anche subire l’autoinfezione, in cui alcune delle larve post-parassitarie rimangono all’interno dell’intestino ospite piuttosto che passare nell’ambiente nelle feci. Queste larve possono svilupparsi in larve autoinfettive (L3a) all’interno dell’ospite, penetrare attraverso la parete intestinale, migrare attraverso il corpo e alla fine tornare all’intestino per diventare adulti riproduttivi. Il ciclo di vita di S. ratti è simile, tranne che S. ratti infetta i ratti e non ha un ciclo autoinfettivo. La generazione ambientale è la chiave per l’utilizzo delle specie di Strongyloides per studi genetici. Le femmine adulte a vita libera (P₀) possono essere microintetate; la loro progenie, che diventerà tutta iL3, sono i potenziali transgenici F₁. Questa figura è stata modificata da Castelletto et al. ³. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

S. stercoralis condivide molti aspetti della sua biologia con altri nematodi gastrointestinali parassiti umani, tra cui l’invasione dell’ospite e la modulazione immunitaria dell’ospite. Ad esempio, gli anchilostomi umani-parassiti nei generi Necator e Ancylostoma infettano anche la penetrazione della pelle, navigano in modo simile attraverso il corpo e, infine, risiedono come adulti parassiti nell’intestino tenue⁷. Pertanto, molti nematodi gastrointestinali probabilmente utilizzano comportamenti sensoriali comuni e tecniche di evasione immunitaria. Di conseguenza, le conoscenze raccolte da Strongyloides completeranno i risultati in altri nematodi meno trattabili geneticamente e porteranno a una comprensione più completa di questi parassiti complessi e importanti.

Questo protocollo di microiniezione delinea il metodo per introdurre il DNA nelle femmine adulte viventi libere di Strongyloides per produrre progenie transgenica e mutante. Vengono descritti i requisiti di mantenimento del ceppo, compresi i tempi di sviluppo dei vermi adulti per le microiniezioni e la raccolta della progenie transgenica. Sono inclusi protocolli e una dimostrazione della tecnica completa di microiniezione, insieme ai protocolli per la coltura e lo screening della progenie transgenica, insieme a un elenco di tutte le attrezzature e i materiali di consumo necessari.

Protocol

NOTA: I gerbilli erano usati per passare S. stercoralis, e i ratti erano usati per passare S. ratti. Tutte le procedure sono state approvate dall’UCLA Office of Animal Research Oversight (Protocollo n. 2011-060-21A), che aderisce agli standard AAALAC e alla Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. Le seguenti attività devono essere completate almeno un giorno prima della microiniezione: coltura di vermi, preparazione di microiniezione, creazione di costrutti per il mix di microiniezione …

Representative Results

Se l’esperimento ha avuto successo, le larve F1 esprimeranno il fenotipo transgenico e/o mutante di interesse (Figura 4). Tuttavia, i tassi di trasformazione sono molto variabili e dipendono dai costrutti, dalla salute dei vermi, dalle condizioni di coltura post-iniezione e dall’abilità dello sperimentatore. In generale, un esperimento di successo produrrà >15 F1 larve per femmina iniettata e un tasso di trasformazione di >3% per i marcatori fluorescenti. Se il numero…

Discussion

Questo protocollo di microiniezione descrive in dettaglio i metodi per introdurre costrutti per la transgenesi e la mutagenesi mediata da CRISPR / Cas9 in S. stercoralis e S. ratti. Sia per S. stercoralis che per S. ratti, la sopravvivenza post-iniezione e il tasso di transgenesi o mutagenesi sono soggetti a diverse variabili che possono essere messe a punto.

La prima considerazione critica per una transgenesi di successo è come sono costruiti i transgeni …

Materials

(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth)	VWR	470121-790	C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE	Phenix	RBA-500	agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh	Ebonex	n/a	charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh	Reade	bonechar10x28	charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator	Narishige	MMN-1	coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Fisher	07-200-385	microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness	Brain Research Lab	4860-1	coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter	VWR	82050-918	10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod	Fisher	12-000-101	stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips	VWR	89009-310	for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads	Fisher	14-206-62	bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings	Fisher	14-050CQ	Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe	McMaster-Carr	7541A51	glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors	Fisher	15-235-101	bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence	Leica	M165 FC	GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder	Tritech	MINJ-4	microinjection needle holder
microINJECTOR system	Tritech	MINJ-1	microinjection system
Mongolian Gerbils	Charles River Laboratories	213-Mongolian Gerbil	gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch	Thomas Scientific	1233S72	platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W)	VWR	62505-007	wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches	Newco	999589	techboard
Stainless steel raised wire floor	Ancare	R20SSRWF	wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000	Office Depot	9587303	spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm	Carolina (Science)	741012	watch glasses (small, round)
Stereomicroscope	Motic	K-400 LED	dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite	Grainger	53GN16	plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller	Sutter	P-30/P	needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses	Fisher	S34826	watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps	Fisher	05-769-2Q	funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator	Narishige	MM0-4	fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps	Fisher	S99422	Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter)	Tritech Research	T3308P	6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers	VWR	82003-820	lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in	Carolina (Science)	742300	watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter	Fisher	09-805B	filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter	Fisher	09-805D	filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade	Office Depot	238816	X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	n/a	inverted microscope