Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés

Summary

Nous présentons ici des protocoles de détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés biologiquement pertinents à l’aide de tests basés sur la chimiluminescence avec une sensibilité élevée.

Abstract

L’activité de l’oxyde nitrique (NO) in vivo est le résultat combiné de ses effets directs, de l’action de ses dérivés générés par l’autoxidation du NO et des effets des composés nitrosés. La mesure des métabolites du NO est essentielle pour étudier l’activité du NO à la fois au niveau vasculaire et dans d’autres tissus, en particulier dans les milieux expérimentaux où le NO exogène est administré. Les tests de chimiluminescence à base d’ozone permettent de mesurer avec précision les métabolites du NO et du NO dans les fluides (y compris le plasma, les homogénats tissulaires, les cultures cellulaires) et les mélanges gazeux (p. ex., l’haleine expirée). Le NO réagit avec l’ozone pour générer du dioxyde d’azote dans un état excité. L’émission de lumière qui en résulte permet la photodétection et la génération d’un signal électrique reflétant la teneur en NO de l’échantillon. Les aliquotes du même échantillon peuvent être utilisées pour mesurer des métabolites spécifiques du NO, tels que le nitrate, le nitrite, les S-nitrosothiols et les complexes fer-nitrosyle. En outre, le NO consommé par l’hémoglobine sans cellules est également quantifié avec une analyse de chimiluminescence. Une illustration de toutes ces techniques est fournie.

Introduction

Depuis que Salvador Moncada et les lauréats du prix Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro et Ferid Murad ont identifié l’oxyde nitrique (NO) comme le facteur de relaxation dérivé de l’endothélium (EDRF) précédemment connu, le rôle central du NO a été établi dans plusieurs mécanismes clés couvrant la biologie vasculaire, les neurosciences, le métabolisme et la réponse de l’hôte 1,2,3,4,5,6,7 . L’administration exogène de gaz NO est devenue un traitement établi pour l’insuffisance respiratoire due à l’hypertension pulmonaire chez le nouveau-né⁸. Le gaz d’oxyde nitrique a également été étudié pour le traitement de l’infection par le virus respiratoire syncytial (VRS), du paludisme et d’autres maladies infectieuses, des lésions d’ischémie-reperfusion et pour la prévention des lésions rénales aiguës chez les patients subissant une chirurgie cardiaque ^9,10,11,12. La nécessité de techniques de mesure précises pour évaluer les niveaux de NO, ses métabolites et ceux de ses protéines et composés cibles découle d’études mécanistes et interventionnelles.

En raison de sa forte réactivité, le NO peut subir des réactions différentes selon la matrice biologique dans laquelle il est produit et/ou libéré. En l’absence d’hémoglobine (Hb) ou d’autres oxy-hémoprotéines, le NO est oxydé presque complètement en nitrite (NO₂^–).

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

N₂O₃ + H₂O → NO₂^– + H⁺

Le NO subit d’abord une autoxidation avec de l’oxygène moléculaire (_O2) pour produire du dioxyde d’azote (NO₂) et réagit avec le NO₂ lui-même pour générer du trioxyde de diazote (N_2O3). Une molécule de_N2O3réagit avec l’eau (_H2O) pour former deux molécules de NO₂^– et un proton (H⁺)¹³. Dans le sang total^14,15, le NO et le NO₂^– sont rapidement convertis en nitrate (NO₃^–) car ces molécules réagissent avidement avec les groupes hémiques oxydés de Hb [Hb-Fe²⁺–_O2 ou oxyhémoglobine (oxyHb)] pour donner no₃^–. Cette réaction est couplée à la transition du groupe hème à l’état ferrique [Hb-Fe³⁺ ou méthémoglobine (metHb)]:

Hb-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^–

La barrière des globules rouges (GR) et l’espace immédiatement adjacent à l’endothélium sont les principaux facteurs limitant cette réaction et permettant à une petite partie du NO libéré par l’endothélium d’agir comme EDRF^16,17. En fait, l’Hb sans cellules dans la circulation est connue pour perturber la vasodilatation dans les contextes expérimentaux et cliniques^17,18. Dans les globules rouges, en fonction de l’oxygénation et de ^{la concentration de} NO₂,, une portion de NO réagit avec la désoxyhémoglobine (Hb-Fe²⁺) pour former du fer-nitrosyl Hb (Hb-Fe²⁺-NO ou HbNO) :

Hb-Fe²⁺ + NO → Hb-Fe²⁺-NO

Dans le RBC^15,17, le NO 2^– peut former de l’Hb-Fe³⁺ en réduisant l’Hb-Fe²⁺ conduisant à la libération de NO, qui à son tour lie Hb-Fe²⁺–_O2 (préférentiellement) ou Hb-Fe²⁺.

La génération de dérivés du NO ne doit pas être considérée comme strictement unidirectionnelle, car le NO peut être régénéré à partir du NO₂ ^et du NO₃ ^dans divers tissus et par différentes enzymes (par exemple, par des bactéries intestinales ou dans les mitochondries, en particulier dans des conditions hypoxiques)^19,20.

Une quantité variable de NO produite (ou administrée) conduit à la génération en aval de S-nitrosothiols, principalement par transnitrosation de thiol à partir de_N2O3 en présence d’un nucléophile créant un intermédiaire donneur de NO⁺ (Nuc-NO⁺-NO₂^–) :

N₂O₃ + RS^– → RS-NO + NO₂^–

Une autre possibilité pour la génération de S-nitrosothiols est la nitrosylation des thiols oxydés (NO réagissant avec un thiol oxydé):

RS• + PAS de → RS-NO

Ce mécanisme et l’oxydation directe du thiol par le NO₂ pourraient n’être possibles que dans des conditions très spécifiques qui sont décrites ailleurs²¹. Les S-nitrosothiols vont des molécules légères comme le S-nitrosoglutathion aux grandes protéines contenant du thiol. La S-nitrosohémoglobine (S-NO-Hb) est formée par nitrosation d’un groupe thiol d’un résidu de cystéine conservé dans la chaîne β (β93C)²².

La génération et le métabolisme des S-nitrosothiols font partie d’importants mécanismes de régulation. Les exemples incluent la régulation du glutathion, des caspases, du N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et des récepteurs de la ryanodine 23,24,25,26,27,28. Auparavant considérée comme un médiateur majeur de la biologie du NO in vivo, l’albumine nitrosée (S-nitroso-albumine) semble être un transporteur de NO/NO⁺ sans activité biologique supplémentaire spécifique²⁹.

Lors de la mesure de la concentration de NO et de ses dérivés à partir d’un échantillon biologique spécifique dans une matrice biologique, il est important de prendre en compte des caractéristiques telles que l’acidité, l’oxygénation, la température et la présence de réactifs. Les exemples incluent les donneurs de NO exogènes administrés et, dans le cadre d’une inflammationaiguë, le peroxyde d’hydrogène (_{H2O 2}) réagissant avec le NO₂ conduisant à la génération d’une concentration surnormale de radicaux libres comme le peroxynitrite (ONOO^–)²¹. En plus de la méthode analytique utilisée, la phase préanalytique de la préparation et du stockage des échantillons est fondamentale. Les réactions en aval qui ne représentent pas l’activité in vivo du NO doivent être prédites, prises en compte et bloquées. Un exemple valable est l’instabilité du S-NO-Hb, nécessitant un traitement dédié des échantillons de sang lorsqu’il est ciblé pour la mesure²².

Les tests basés sur la chimiluminescence sont la référence absolue pour détecter les niveaux de NO et de ses principaux métabolites [NO₂^–, NO₃^–, S-NO et complexes fer-nitrosyle (Fe-NO)] dans tout fluide biologique, y compris les homogénats tissulaires^30,31. Ces méthodes s’appuient sur le détecteur de chimiluminescence (CLD), un dispositif qui abrite la réaction du NO avec l’ozone (O₃), générant le NO₂ à l’état excité (NO₂•). La relaxation du NO₂• provoque l’émission d’un photon de lumière détecté par un tube photomultiplicateur, générant un signal électrique directement proportionnel à la teneur en NO du mélange gazeux échantillonné³². Un schéma simplifié du CLD est représenté.

Figure 1 : Schéma simplifié d’un détecteur de chimiluminescence pour le gaz d’oxyde nitrique. La détection d’oxyde nitrique (NO) basée sur la chimiluminescence est la génération stœchiométrique d’un photon par molécule de gaz NO introduite dans le détecteur de chimiluminescence (CLD). La réaction de chimiluminescence est obtenue dans une chambre désignée alimentée en ozone (O3) à partir d’un générateur interne, qui est maintenu à pression négative par connexion avec une pompe externe, permettant un afflux continu et constant de gaz d’échantillonnage. La génération d’O₃ nécessite de l’oxygène diatomique (_O2) qui est alimenté par un réservoir O₂ dédié connecté au CLD (d’autres fabricants fournissent des CLD fonctionnant avec de l’air ambiant). Dans la chambre de réaction, chaque molécule de GAZ NO contenue dans le gaz échantillonné réagit avec l’oxygène pour produire une molécule de dioxyde d’azote à l’état activé (NO₂*). En revenant à son état fondamental, chaque molécule de NO₂* émet un photon qui est détecté par un tube photomultiplicateur (PMT) situé à côté de la chambre de réaction. Le PMT avec l’amplificateur associé et l’unité centrale de traitement produit un signal proportionnel au nombre de photons et au nombre de molécules de NO dans la chambre de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’entrée d’échantillon du CLD peut être connectée à un système de verrerie contenant une chambre de réaction pour les échantillons liquides. Le système est continuellement purgé avec un gaz inerte tel que l’azote, l’hélium ou l’argon, transférant le NO de la chambre de réaction au CLD. Des échantillons en phase liquide sont injectés à travers une membrane dédiée dans le récipient de purge.

Figure 2 : Structure d’un récipient de purge pour la détection par chimiluminescence du gaz d’oxyde nitrique Le récipient de purge (à droite) permet la détection du gaz d’oxyde nitrique (NO) ou de tout autre composé qui peut être facilement converti en gaz NO lorsqu’il est libéré d’un réactif en phase liquide. L’entrée de gaz inerte est reliée à une source (réservoir) d’un gaz inerte tel que l’argon, le xeon ou l’azote diatomique (N₂). La valve à aiguille (s’ouvre à gauche) est utilisée pour le contrôle de la pression dans le récipient de purge et peut être complètement retirée pour nettoyer le récipient. L’orifice d’injection est recouvert d’un capuchon avec un septum membranaire pour l’injection d’échantillons. La membrane doit être remplacée souvent. Une veste chauffante entoure la chambre de réaction et est reliée à un bain d’eau chaude pour effectuer le test VCl₃ en HCl. La sortie du récipient de purge est connectée au détecteur de chimiluminescence (CLD) ou au piège NaOH (requis pour VCl₃ dans les tests HCl). Pour drainer le contenu de la chambre de réaction, fermez d’abord les robinets d’arrêt à l’entrée de gaz inerte et à la sortie du récipient de purge, fermez la vanne à aiguille, retirez le bouchon à l’orifice d’injection et enfin ouvrez le robinet d’arrêt au niveau du drain. Le piège NaOH (à gauche) doit être placé en ligne entre le récipient de purge et le CLD si le test VCl₃ dans HCl est effectué en raison de la corrosivité du HCl. La connexion au CLD nécessite toujours qu’un filtre diélectrique à champ intense (IFD) soit placé entre le CLD et la sortie du récipient de purge (ou du piège NaOH, le cas échéant). Le filtre IFD élimine les particules en suspension dans l’air et empêche le liquide de passer à travers le récipient de purge. PTFE = polytétrafluoroéthylène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En conséquence, tout composé pouvant être converti en NO par une réaction chimique spécifique et contrôlée peut être détecté avec une sensibilité élevée dans tout fluide biologique et homogénat tissulaire²⁴. La mesure directe du NO en phase gazeuse par chimiluminescence est effectuée dans des contextes expérimentaux et cliniques. Ces techniques sont largement décrites ailleurs 33,34,35. La mesure du NO₂^–, des S-nitrosothiols, des protéines S-nitrosées et des Fe-NO peut être effectuée en ajoutant des échantillons dans un mélange réactionnel avec du triiodure (_I3^–), qui libère stœchiométriquement du GAZ NO de tous ces composés:

I₃^– → I₂ + I^–

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +2H₂O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

tandis que I₃^– ne réagit pas avec NO ^3-15. Des mesures précises de chaque composé sont rendues possibles par le prétraitement des aliquotes d’échantillons avec du sulfanilamide acidifié (AS) avec ou sans chlorure mercurique (HgCl₂). Plus précisément, le prétraitement avec AS élimine toute la_teneur ^{en NO} 2. En conséquence, la teneur en NO mesurée par le CLD ne reflète que la somme des concentrations de S-NO et de Fe-NOs. L’injection de HgCl₂ dans une aliquote d’échantillon avant l’injection de SA provoque la libération de NO₂^– par S-NO. Le traitement par AS (conduisant à ^{l’élimination du} NO₂) garantit que la teneur en NO mesurée ne reflète que la concentration de Fe-NO. Une série de soustractions entre les évaluations permet de calculer la concentration précise des trois dérivés du NO²².

Figure 3 : Étapes de préparation de l’échantillon pour le test de chimiluminescence de l’acide acétique_I3^– dans l’acide acétique. Les étapes séquentielles de préparation du test de chimiluminescence de l’acide_I3^– dans l’acide acétique sont illustrées. L’utilisation de tubes centrifuges protégés contre la lumière est requise. Les tubes 1, 2 et 3 sont ceux utilisés pour préparer le test. Une autre aliquote d’échantillon (tube 4) est nécessaire pour le test VCl₃ dans HCl si la mesure du nitrate (NO₃^–) est requise. Les étapes sont indiquées par des chiffres en rouge. Préremplir (étape 1) comme indiqué avec une solution saline tampon phosphate (PBS) ou HgCl₂ avant d’ajouter le volume de l’échantillon. Ajouter le volume de l’échantillon (2) comme indiqué, vortex, et incuber pendant 2 min à température ambiante (RT). Ajouter (3) pbS ou sulfanilamide (AS) acidifié comme indiqué, vortex, et incuber pendant 3 min à TA. Exécuter le test (4). La concentration mesurée par le dosage est la somme de la concentration des composés rapportée sous chaque tube. Le tube numéro 1 permettra de mesurer les nitrites (NO₂^–), les S-nitrosothiols (S-NO) et les complexes fer-nitrosyle (Fe-NO) en un seul signal. Pour la mesure des nitrates (NO₃^–), les échantillons doivent être traités avec à la fois_I3^– dans l’acide acétique et VCl3 dans les dosages HCl, et la valeur obtenue à partir du tube 1 doit être soustraite de celle obtenue à partir du tube 4. *quantités suggérées à utiliser pour l’analyse de l’Hb pour la détermination du NO ^2-résiduel, de la S-nitrosomémoglobine et de l’hémoglobine fer-nitrosyl. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour ^{la mesure du} NO₃, le chlorure de vanadium (III) (VCl₃) dans l’acide chlorhydrique (HCl) est utilisé pour la conversion du NO₃^– en NO dans le récipient de purge afin de mesurer le NO₃^– stœchiométriquement avec le CLD:

2 NO₃^–+ 3V⁺³ + 2H₂O → 2NO + 3VO₂⁺ + 4H⁺

Pour obtenir une conversion suffisamment rapide, la réaction doit être effectuée à 90-95 °C. La réduction de NO₃^– à NO₂^– est couplée à une réduction de NO₂^– à NO par HCl. Le vanadium métal réduit également les S-NO libérant leur fraction NO^22,36. La concentration finale obtenue par CLD avec_VCl3 dans HCl reflète la concentration globale de NO₃^–, NO₂ et d’autres composés nitrosés. La soustraction de cette dernière valeur de la concentration obtenue avec CLD avec I₃^– permet de calculer la concentration de NO₃^{– 36,37} (Figure 3).

Dans le test de consommation de NO, la libération continue de NO dans le récipient de purge par des donneurs de NO comme (Z)-1-[2-(2-aminoéthyl)-N-(2-ammonioéthyl)amino]diazène-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) génère un signal stable permettant de quantifier l’oxyHb sans cellule dans les échantillons injectés. La quantité de NO consommée dans le récipient de purge est en relation stœchiométrique avec la quantité d’oxyHb dans l’échantillon³⁸.

Les protocoles de mesure des NO₂^, NO₃^, S-nitrosothiols, des complexes fer-nitrosyle et de LA CONSOMMATION DE NO par Hb sans cellules dans des échantillons de plasma sont illustrés. Les études sur le NO dans l’environnement RBC nécessitent un traitement spécifique de l’échantillon suivi d’une chromatographie d’exclusion pour mesurer les S-NO-Hb et Hb-NO extrêmement fragiles couplés à la détermination de la concentration totale ^{d’Hb 15,22}. La préparation des échantillons joue un rôle déterminant dans la correction de la mesure. La préexistence du NO₂^– dans_H2Oet la libération du NO₂^– pendant le test peuvent conduire à la mesure de concentrations artificiellement plus élevées de dérivés du NO tels que le S-NO-Hb^14,39. Des aspects importants de la préparation des échantillons sont également présentés.

Protocol

Les procédures indiquées dans ce protocole sont conformes au comité d’examen du Massachusetts General Hospital. Les échantillons de sang utilisés avaient été prélevés lors d’une étude précédente et ont été anonymisés aux fins actuelles18. REMARQUE: Voir les instructions du fabricant pour des conseils spécifiques concernant les connexions optimales entre les tubes et la verrerie constituant le récipient de purge, le lavage et l’entretien général….

Representative Results

La consommation de NO par dosage de l’Hb sans cellules a été utilisée dans des échantillons contenant des concentrations connues d’oxyHb sans cellules (figure 4). Comme un hème d’oxyHb libère stœchiométriquement une molécule de NO dans le test, l’oxyHb purifié sans cellule est utilisé pour construire la courbe d’étalonnage pour le test (figure supplémentaire 3). La relation dose-réponse entre l’Hb sans cellules (mesurée …

Discussion

En raison de la sensibilité élevée, les tests à base de chimiluminescence pour la détermination du NO et des composés apparentés présentent un risque élevé ^{de contamination par} le NO₂. Chaque réactif (en particulier la ^{solution bloquant le} NO₂) et chaque diluant (y compris le ddH₂O) utilisé dans l’expérience doivent être testés pour sa teneur en NO₂^– afin de corriger le signal de fond. Le nitrite est extrêmement réactif avec u…

Materials

Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL – liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL – liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL – liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g – solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g – solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g – crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software – Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% – 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g – powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g – solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g – crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump – Bundled with analyzer
Sodium Heparin – BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg – pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g – powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g – crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g – solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g – solid – Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155