Summary
여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
생체 내에서 산화질소(NO) 활성은 그의 직접적인 효과, NO autoxidation으로부터 생성된 그의 유도체의 작용, 및 니트로화 화합물의 효과의 조합된 결과이다. NO 대사산물을 측정하는 것은 혈관 수준과 다른 조직, 특히 외인성 NO가 투여되는 실험 환경에서 NO 활성을 연구하는 데 필수적입니다. 오존 기반 화학발광 분석은 유체(플라즈마, 조직 균질물, 세포 배양물 포함) 및 가스 혼합물(예: 내뿜는 호흡) 모두에서 NO 및 NO 대사산물의 정밀한 측정을 가능하게 합니다. NO는 오존과 반응하여 흥분 상태에서 이산화질소를 생성합니다. 결과적으로 발광은 광검출 및 샘플의 NO 함량을 반영하는 전기 신호의 생성을 허용합니다. 동일한 샘플로부터의 분취량은 특정 NO 대사산물, 예컨대 질산염, 아질산염, S-니트로소티올, 및 철-니트로실 착물을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 무세포 헤모글로빈에 의해 소비된 NO는 또한 화학발광 분석으로 정량화된다. 이러한 모든 기술에 대한 그림이 제공됩니다.
Introduction
살바도르 몬카다와 노벨상 수상자인 로버트 푸르치고트, 루이 이그나로, 페리드 무라드가 산화질소(NO)를 이전에 알려진 내피 유래 이완인자(EDRF)로 확인했기 때문에, NO의 중심 역할은 혈관 생물학, 신경과학, 대사 및 숙주 반응전반에 걸친 몇 가지 주요 메커니즘에서 확립되었다 1,2,3,4,5,6,7 . NO 가스의 외인성 투여는 신생아8에서 폐 고혈압으로 인한 호흡 부전에 대한 확립된 치료법이 되었다. 산화 질소 가스는 또한 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염, 말라리아 및 기타 감염성 질환, 허혈 재관류 손상의 치료 및 심장 수술을받는 환자의 급성 신장 손상 예방 9,10,11,12에 대해 조사되었습니다. NO, 그 대사 산물 및 표적 단백질 및 화합물의 수준을 평가하기위한 정확한 측정 기술의 필요성은 기계론적 및 중재적 연구 모두에서 비롯됩니다.
그것의 높은 반응성으로 인해, NO는 그것이 생성 및/또는 방출되는 생물학적 매트릭스에 따라 상이한 반응을 겪을 수 있다. 헤모글로빈 (Hb) 또는 다른 옥시헤모단백질의 부재하에, NO는 아질산염 (NO2-)으로 거의 완전히 산화된다.
2NO + O2 →2NO2
NO2 + NO →N2O3
N2O3+H2O →NO2- + H+
NO는 먼저 분자 산소(O2)와 상호 작용하여 이산화질소(NO2)를 생성하고,NO2 자체와 반응하여 삼산화이질소(N2O3)를생성한다. N2O3의 한 분자는 물(H2O)과 반응하여 NO2- 및 양성자(H+)13의2분자를 형성한다. 전혈14,15 내에서, NO와 NO2-는 이들 분자가 Hb의 산화된 헴기[Hb-Fe2+-O2 또는 옥시헤모글로빈(oxyHb)]와 격렬하게 반응하여 질산염(NO3-)으로 빠르게 전환되어 NO3-를 생성한다. 이 반응은 헴기가 페릭 상태로의 전이와 결합된다 [Hb-Fe3+ 또는 메트헤모글로빈 (metHb)]:
Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ +NO3-
적혈구 (RBC) 장벽과 내피에 바로 인접한 공간은 이러한 반응을 제한하는 주요 요인이며 내피에 의해 방출되는 NO의 작은 부분이 EDRF16,17로 작용할 수 있도록합니다. 실제로, 순환에서 무세포 Hb는 실험 및 임상 설정(17,18)에서 혈관확장을 방해하는 것으로 알려져 있다. RBC 내에서, 산소화 및NO2-농도에 따라, NO의 일부는 데옥시헤모글로빈(Hb-Fe2+)과 반응하여 철-니트로실 Hb(Hb-Fe2+-NO 또는 HbNO)를 형성한다:
Hb-Fe2++ NO → Hb-Fe2+-NO
RBC15,17에서, NO2-NO의 방출을 유도하는 Hb-Fe2+를 감소시킴으로써 Hb-Fe3+를 형성할 수 있고, 이는 차례로 Hb-Fe2+-O2 (우선적으로) 또는 Hb-Fe2+에 결합한다.
NO 유도체의 생성은 NO가 다양한 조직 및 상이한 효소에 의해 (예를 들어, 장내 박테리아 또는 미토콘드리아 내에서, 특히 저산소 조건 하에서) NO2- 및NO3-로부터 재생될 수 있기 때문에 엄격하게 단방향성으로 간주되어서는 안 된다.19,20.
가변량의 NO 생성(또는 투여)은 주로 친핵체의 존재하에N2O3로부터 티올 트랜스니트로화에 의해 N-니트로소티올의 하류 생성을 유도하여 NO+ 공여체 중간체(Nuc-NO+-NO2-)를 생성한다:
N2O3+ RS-→ RS-NO + NO2-
S-니트로소티올스 생성에 대한 또 다른 가능성은 산화된 티올의 니트로실화(산화된 티올과 반응하는 NO)이다:
RS• + 아니오 → RS-아니오
NO2에 의한 이러한 메카니즘 및 직접적인 티올 산화는 다른 곳에서 설명되는 매우 특정한 조건에서만 가능할 수 있다(21). S-니트로소티올은 S-니트로소글루타티온과 같은 광분자에서 큰 티올 함유 단백질에 이르기까지 다양합니다. S-니트로소헤모글로빈(S-NO-Hb)은 β쇄(β93C)22 내에 보존된 시스테인 잔기의 티올기의 니트로화에 의해 형성된다.
S-니트로소티올의 생성과 신진 대사는 중요한 조절 메커니즘의 일부입니다. 그 예로는 글루타티온, 카스파제, N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA), 및 리아노딘 수용체 23,24,25,26,27,28의 조절이 포함된다. 이전에 생체내에서 NO 생물학의 주요 매개체로서 고려되었던 니트로화 알부민(S-nitroso-albumin)은 어떠한 특정한 추가적인 생물학적 활성도 없이 NO/NO+ 수송체인 것으로 보인다(29).
생물학적 매트릭스 내의 특정 생물학적 샘플로부터 NO 및 그 유도체의 농도를 측정할 때, 산도, 산소화, 온도 및 시약의 존재와 같은 특성을 고려하는 것이 중요하다. 그 예로는 외인성 NO 공여체 투여를 포함하고, 급성 염증의 설정에서, 과산화수소(H2O2)가NO2와 반응하여 퍼옥시아질산염(ONOO-)21과 같은 초정상 농도의 자유 라디칼의 생성을 유도한다. 사용되는 분석 방법 외에도 샘플 준비 및 저장의 사전 분석 단계가 기본입니다. 생체내 NO 활성을 나타내지 않는 하류 반응은 예측, 고려, 차단되어야 한다. 유효한 예는 S-NO-Hb의 불안정성이며, 측정22를 목표로 할 때 혈액 샘플의 전용 처리가 필요합니다.
화학발광-기반 분석은 조직 균질물30,31을 포함하는 임의의 생물학적 유체에서 NO 및 그의 주요 대사산물 [NO2-,NO3-, S-NO 및 철-니트로실 착물 (Fe-NO)]의 수준을 검출하기 위한 황금 표준이다. 이러한 방법은 NO와 오존(O3)의 반응을 수용하여 여기된 상태(NO2•)에서NO2를 생성하는 장치인 화학발광 검출기(CLD)에 의존합니다. NO2•의 이완은 광승수 튜브에 의해 검출되는 광자의 발광을 야기하여, 샘플링된 가스 혼합물(32)의 NO 함량에 직접적으로 비례하는 전기 신호를 생성한다. CLD의 단순화된 개략도가 표현된다.
그림 1: 산화질소 가스에 대한 화학발광 검출기의 단순화된 회로도. 화학발광 기반 산화질소(NO)의 검출은 화학발광 검출기(CLD)에 도입되는 NO 가스 분자당 하나의 광자의 화학량론적 생성이다. 화학 발광 반응은 내부 발전기에서 오존 (O3)이 공급되는 지정된 챔버에서 얻어지며, 외부 펌프와의 연결로 음압으로 유지되어 샘플 가스의 지속적이고 지속적인 유입을 허용합니다. O3의 생성에는 CLD와 연결된 전용 O2 탱크에 의해 공급되는 규원자 산소(O2)가 필요합니다(다른 제조업체는 주변 공기로 작동하는 CLD를 제공합니다). 반응 챔버 내에서, 샘플링된 가스에 포함된 NO 가스의 각 분자는 산소와 반응하여 활성화 상태의 이산화질소(NO2*) 한 분자를 산출한다. 그의 기저 상태로 되돌아감으로써, 각각의NO2* 분자는 반응 챔버에 인접해 위치한 광승수 튜브(PMT)에 의해 검출되는 하나의 광자를 방출한다. 증폭기 및 중앙 처리 유닛과 연관된 PMT는 반응 챔버 내의 광자 수 및 NO 분자의 수에 비례하는 신호를 생성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CLD의 샘플 입구는 액체 샘플용 반응 챔버를 함유하는 유리 시스템에 연결될 수 있다. 이 시스템은 질소, 헬륨 또는 아르곤과 같은 불활성 가스로 연속적으로 퍼징되어 NO를 반응 챔버에서 CLD로 전달합니다. 액상 샘플은 전용 멤브레인을 통해 정화 용기로 주입됩니다.
그림 2 : 화학 발광 기반 산화 질소 가스 검출을위한 정화 용기의 구조 퍼지 용기 (오른쪽)는 액상 시약에서 방출 될 때 NO 가스로 쉽게 전환 될 수있는 산화 질소 (NO) 가스 또는 기타 화합물의 검출을 허용합니다. 불활성 가스 유입구는 아르곤, 제온, 또는 이원자성 질소(N2)와 같은 불활성 기체의 소스(탱크)에 연결된다. 바늘 밸브 (왼쪽으로 열림)는 퍼지 용기 내의 압력 제어에 사용되며 용기를 청소하기 위해 완전히 제거 할 수 있습니다. 주입 포트는 샘플 주입을위한 막 중격이있는 캡으로 덮여 있습니다. 멤브레인은 자주 교체해야합니다. 가열된 재킷은 반응 챔버를 둘러싸고 온수 욕조에 연결되어 HCl 분석에서VCl3을 수행한다. 퍼지 용기 출구는 화학발광 검출기 (CLD) 또는 NaOH 트랩에 연결된다 (HCl 분석에서VCl3에 필요함). 반응 챔버 함량을 배출하려면 먼저 불활성 가스 입구와 퍼지 용기 출구에서 스톱콕을 닫고 바늘 밸브를 닫은 다음 주입구에서 캡을 제거한 다음 마지막으로 드레인에서 스톱콕을 엽니 다. NaOH 트랩 (왼쪽)은 HCl의 부식성 때문에 HCl 분석에서VCl3이 수행되는 경우 정화 용기와 CLD 사이에 인라인으로 배치해야합니다. CLD에 연결하려면 CLD와 퍼지 용기의 출력(또는 사용되는 경우 NaOH 트랩) 사이에 항상 강렬한 전계 유전체(IFD) 필터가 배치되어야 합니다. IFD 필터는 공기 중 입자를 제거하고 액체가 퍼지 용기를 통과하는 것을 방지합니다. PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
결과적으로, 특이적이고 조절된 화학 반응을 통해 NO로 전환될 수 있는 임의의 화합물은 임의의 생물학적 유체 및 조직 균질액(24)에서 높은 감도로 검출될 수 있다. 화학발광을 통한 기상NO의 직접 측정은 실험 및 임상 설정 모두에서 수행된다. 이들 기술은 다른 곳에서도 광범위하게 설명된다(33,34,35). NO2-, S-니트로소티올, S-니트로소티올, S-니트로화 단백질 및 Fe-NOs의 측정은 이들 모든 화합물로부터 NO 가스를 화학량론적으로 방출하는 트리요오다이드(I3-)와의 반응 혼합물에 샘플을 첨가함으로써 수행될 수 있다:
I3- → I2 + I-
2NO2 - +2I- +4H + → 2NO + I 2 +2H2 O
I3 - + 2RS-NO → 3I - + RSSR + 2NO +
2NO + + 2I - → 2NO + I2
반면 I 3-은 NO 3-15와 반응하지 않습니다. 각 화합물의 정확한 측정은 수은 염화물 (HgCl2)의 유무에 관계없이 산성화 된 설파 닐 아미드 (AS)로 샘플 분취량을 전처리함으로써 가능합니다. 구체적으로, AS로 전처리하면NO2-함량이 모두 제거된다. 결과적으로, CLD에 의해 측정된 NO 함량은 S-NOs 및 Fe-NOs 농도의 합만을 반영한다. AS 주입 전에 샘플 분취량에 HgCl2를 주입하면NO2-가 S-NO에 의해 방출됩니다. AS로 처리(NO2-제거로 이어짐)는 측정된 NO 함량이 Fe-NOs의 농도만을 반영하도록 보장한다. 평가 사이의 일련의 감산은 세 개의 NO 유도체(22)의 정확한 농도를 계산할 수있게한다.
도 3: I3-아세트산 화학발광 분석에서I3-용 시료 제조 단계. 아세트산 화학발광 분석에서 I3-의 제조를 위한 순차적 단계가 예시된다. 광 보호 원심 분리 튜브의 사용이 필요합니다. 튜브 1, 2, 및 3은 분석을 준비하기 위해 사용되는 것들이다. 또 다른 샘플 분취량 (튜브 4)은 질산염 (NO3-)의 측정이 필요한 경우 HCl 분석에서VCl3에 필요합니다. 단계는 빨간색으로 숫자로 표시됩니다. 샘플 부피를 첨가하기 전에 포스페이트 버퍼 식염수(PBS) 또는 HgCl2로 표시된 바와 같이 예비충전(단계 1). 지시된 바와 같이 샘플 부피 (2)를 첨가하고, 볼텍스하고, 실온 (RT)에서 2분 동안 인큐베이션한다. 지시된 바와 같이 (3) PBS 또는 산성화된 설파닐아미드 (AS)를 첨가하고, 볼텍스하고, RT에서 3분 동안 인큐베이션한다. 분석법에 의해 측정된 농도는 각 튜브 하에서보고된 화합물의 농도의 합이다. 튜브 번호 1은 단일 신호로서 아질산염(NO2-), S-니트로소티올(S-NO) 및 철-니트로실 착물(Fe-NOs)의 측정을 허용한다. 질산염 (NO3-) 측정을 위해, 샘플은 HCl 분석에서 아세트산의 I3-와 VCl3 둘 다로 실행되어야하며, 튜브 1로부터 얻은 값은 튜브 4로부터 얻은 값에서 뺄 수 있어야합니다. *잔류NO2-, S-니트로소헤모글로빈 및 철-니트로실헤모글로빈의 결정을 위해 Hb 분석에 사용되는 제안된 양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NO3-측정을 위해, 염산(HCl) 중의 바나듐(III) 클로라이드(VCl3)는 CLD를 사용한 NO3-화학량론적으로 측정하기 위해 퍼지 용기 내의NO3-로의 NO로의 전환에 사용된다:
2 NO3- + 3V + 3 +2H2O→ 2NO + 3VO2 + + 4H +
충분히 빠른 전환을 달성하기 위해, 반응은 90-95°C에서 수행될 필요가 있다. NO3-에서 NO2-로의 환원은 HCl에 의한 NO2-내지 NO의 환원과 결합된다. 바나듐 금속은 또한 그들의 NO 모이어티22,36을 해방시키는 S-NOs를 감소시킨다. HCl 중의 VCl3을 갖는 CLD에 의해 수득된 최종 농도는NO3-, NO2, 및 다른 니트로화 화합물의 응집체 농도를 반영한다. I3-를 사용한 CLD로 수득된 농도로부터 후자의 값을 뺀 것은NO3-농도 36,37의 계산을 허용한다(도 3).
NO 소비 분석에서, NO 공여체에 의한 퍼지 용기 내의 NO의 연속 방출은 (Z)-1-[2-(2-아미노에틸)-N-(2-암모니오에틸)아미노]디아젠-1-륨-1,2-디올레이트(DETA-NONOate)와 같은 NO 공여체에 의해 주입된 샘플에서 무세포 옥시Hb를 정량화할 수 있게 하는 안정한 신호를 생성한다. 퍼지 용기에서 소비되는 NO의 양은 샘플(38) 중의 oxyHb의 양과 화학양론적 관계에 있다.
혈장 샘플에서 무세포 Hb에 의한NO2-, NO3-, S-니트로소티올, 철-니트로실 착물, 및 NO 소비의 측정을 위한 프로토콜이 예시된다. RBC 환경에서 NO에 대한 연구는 총 Hb 농도15,22의 결정과 결합 된 매우 취약한 S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하기 위해 특정 샘플 처리 후 배제 크로마토그래피가 필요합니다. 샘플 준비는 측정을 교정하는 데 도움이됩니다. 분석 동안 H2O에서 NO2-의 사전 존재 및NO2-방출은 S-NO-Hb14,39와 같은 인위적으로 더 높은 농도의 NO 유도체의 측정을 유도할 수 있다. 샘플 준비의 중요한 측면도 제시됩니다.
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Protocol
이 프로토콜에 표시된 절차는 매사추세츠 종합 병원의 검토위원회에 따라 결정됩니다. 사용된 혈액 샘플은 이전 연구 동안 수집되었고, 현재의 목적(18)을 위해 비확인되었다.
주: 퍼지 용기, 세척 및 일반 유지 보수를 구성하는 튜브와 유리 제품 간의 최적 연결에 대한 구체적인 지침은 제조업체의 지침을 참조하십시오. 연결은 유리 제품을 손상시키지 않도록 단단하고 신중하게 만들어야합니다. 가스 유입 라인, 가열 재킷 및 응축기가있는 퍼지 용기, 수산화 나트륨 (NaOH) 가스 버블러 트랩, 퍼지 용기와 버블러 사이의 연결 라인, 퍼지 용기 출구 가스 라인 (CLD까지)에는 강렬한 전계 유전체 (IFD) 필터가 부여됩니다. 정화 용기와 CLD의 샘플 입구 사이의 IFD 필터 라인은 액체 형태의 NO 대사 산물 (플라즈마, 세포 배양물, 조직 균질물)이 측정 될 때마다 제자리에 있어야합니다 (프로토콜에 제시된 모든 분석). 샘플 준비는 분석되는 유체 또는 조직 및 관심있는 화합물에 따라 다릅니다. 사전 분석 단계의 중요한 측면은 섹션 1과 2에서 다룹니다. 특정 검정을 위한 특정 준비 단계는 섹션 3-5에 포함된다. 섹션 6-8은 모든 분석에 적용됩니다.
1. 전용시약의 제조
참고: 자세한 내용은 이전 간행물15,22를 참조하십시오.
- 500 mg의 설파닐아미드를 1N HCl 10 mL에 용해시켜NO2-제거를 위한 5% (290 mM) 산성화된 설파닐아미드 (AS) 용액을 준비한다. 이 솔루션은 몇 달 동안 안정적입니다.
- 67.9 mg의 HgCl2를 PBS 5 mL에 용해시킴으로써 S-NOs로부터 NO2-방출을 위한 50 mM 수은 클로라이드 (HgCl2) 용액을 제조하였다. 원액을 빛으로부터 보호하십시오.
- 티올기를 차단하기 위해 800 mM 페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]로 Hb를 산화시키기 위해 800 mM 페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]로NO2-블로킹 용액을 제조하고, 적색 세포막을 가용화하기 위해 10% 노닐페닐폴리에틸렌글리콜 용액(Nonidet p-40)을 제조하였다.
- 탈이온수 (ddH2O, 리터당 분말 263.5 g)에K3Fe(CN)6을 첨가하여 최종 농도 800 mM을 얻었다.
- ddH2O 용액 (100 mM 농도를 갖도록 리터 당12.5g의 분말)에서 800 mMK3Fe(CN)6에 NEM을 첨가하고 용액을 혼합하여 모든 결정을 용해시킨다.
- 800 mM NEMK3Fe(CN)6 100 mM NEM 용액 (리터당 111 mL)의 9 부분에 10% NP-40의 한 부분을 첨가하고 잘 섞는다 (전혈 분석을 위한 필수 단계).
- 그들의 원액으로부터 12 mMK3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA, 금속 킬레이트화용) 및 1% 노니데트 p-40 세제를 함유하는 S-NO-Hb 안정화 용액을 제조하였다.
- PBS (25 mg / mL, 예를 들어, PBS 중 250 mg)에 NEM 결정을 첨가하여 200 mM NEM 용액을 준비하고 모든 결정이 용해 될 때까지 용액을 혼합하십시오 (실험 당일에 제조).
- ddH2O (ddH2O5 mL 중 263.5 mg/mL 예컨대 1.32 g)에K3Fe(CN)6을 첨가하여 800mM K3Fe(CN)6 용액을 제조하여 800 mM의 최종 농도를 얻었다(실험당일에 제조됨).
- ddH2O200 mL에 DTPA 786 mg을 첨가하여 10 mM DTPA 원액을 제조하고 DTPA를 완전히 가용화하기 위해 5N NaOH로 pH를 7.0으로 조정하였다.
- 7.2 pH에서 PBS 81.5 mL에 200 mM NEM 용액 5 mL, 800 mMK3Fe(CN)6 용액 1.5 mL 및 DTPA 원액 1 mL를 첨가하고, 마지막으로 10% NP-40 11 mL를 마침내 첨가하여 최종 부피를 100 mL로 가져온다.
2. 샘플 수집
참고: 샘플 수집에 대한 자세한 내용은 이전에 출판된 작품 15,22,40을 참조하십시오.
- 전혈 수집
- 헤파린 코팅 튜브에 혈액을 모아 동맥 혈관보다 정맥을 선호하고 (특별히 필요하지 않은 경우) 용혈을 최소화하기 위해 적어도 20G 이상의 카테터 또는 바늘 보어로 정맥 천자 (가능한 경우)보다 카테터 배치를 선호합니다.
- NO2-블로킹 용액(전혈 4부에 용액 1부)을 즉시 첨가하고, 처리(섹션 3 또는 4)하거나, 동결시키고 -80°C에서 보관한다.
- 혈장 및 적혈구 (RBC) 수집
- 동맥혈보다 정맥을 선호하는 헤파린 코팅 튜브 (특별히 필요하지 않은 경우)와 적어도 20G 이상의 바늘에 혈액을 모아 용혈을 최소화하고 4 °C에서 4000 x g 에서 5 분 동안 즉시 원심분리하십시오.
- 상청액(플라즈마)을NO2-블로킹 용액(상청액의 4부까지 용액 1부)과 혼합하고 새로운 튜브(섹션 3 또는 4)에서 처리하거나(섹션 3 또는 4), 또는 -80°C에서 동결 및 보관한다.
참고: NO 소비 분석의 경우,NO2-차단 용액을 사용할 수 없습니다. 상기 분석은 혈장 전처리 없이 수행될 수 있다. - RBC 펠릿을 바닥으로부터 S-NO 안정화 용액 (단계 1.4 참조)으로 미리 충전된 새로운 튜브 (1 mL의 펠릿 내지 9 mL의 용액)에 재현탁시키고, 5분 동안 인큐베이션한다.
- RBC 용해물을 배제 크로마토그래피를 위해 이전에 ddH2O로 헹구어 온G-25세파덱스 중합체와 함께 사이징 컬럼에 통과시킨다.
- Hb 분획을 수집하여 처리하고(섹션 4) Drabkin의 시약을 사용하여 Hb 농도를 측정합니다(Hb 측정의 경우, 이전에 발표된 작업22 참조).
참고 : 특정 조직 / 기관을 준비하고 샘플링하려면 그 틈새를 확인하고 외과 적으로 분리하십시오. 정맥을 절개하고, 동맥에 구멍을 뚫고, 동맥을 통해 헤파린화 식염수 (10 U / mL)를 주사하십시오. 식염수가 정맥 절개에서 역류하기 시작할 때 조직을 절제하십시오. 조직을 기계식 균질화기로 균질화하면서 균질화된 조직의 4 부에NO2-차단 용액 1 부를 첨가한다.
3. HCl 분석 제제에서 VCl3
참고 : HCl 분석 준비에서 VCl3에 대한 자세한 내용은 이전에 발표 된 작품37,41을 참조하십시오.
주의: 이 분석을 수행할 때 NaOH 트랩이 제대로 제자리에 있지 않으면 CLD가 손상됩니다. 이것은 HCl의 부식성 때문입니다.
- 표준 곡선에 대한 NO3- 의 표준 솔루션 준비
- 85 mg의NaNO3를 10 mL의 ddH2O에 용해시켜 0.1 MNaNO3-(이 용액은 몇 주 동안 안정하게 유지됨)를 얻었다.
- 원액을 사용하여ddH2O로 희석하여 표준을 준비하여 혈장 또는 소변 샘플에 대한 검량선을 수행하기 위해 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3의 농도를 얻습니다 (세포 배양으로 작업하는 경우 더 낮은 농도 사용).
- 퍼지 용기에서 NO3-감소를 위해VCl3(염화바나듐) 포화 용액을 준비한다.
주의: 물과 VCl3 의 반응은 발열성입니다. 산을 첨가 할 때와 실험이 끝날 때 유리 제품을 헹굴 때 높은 유리 제품 온도에주의하십시오.- 1.6 g의 VCl3을 200 mL의 1 M HCl에 녹인 다음, 먼저 VCl3을 깨끗한 플라스크에 첨가한 다음, 200 mL의 1 M HCl을 첨가한다.
- 용액을 여과지를 통해 진공 여과한다(예: 11 μm 여과지, 그러나 임의의 여과지를 사용할 수 있다).
참고 : 여과 된 용액은 맑은 파란색으로 변할 것이며, 여과되지 않은 VCl3 용액은 용해되지 않은 입자 때문에 갈색입니다. - 화합물이 빛에 민감하므로 알루미늄 호일 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 테이프로 덮인 포화 용액을 보관하십시오.
- 순환 수조 준비
- 순환 수조 장치를 퍼지 용기의 워터 재킷에 연결하십시오. 프라이밍하기 전에 선이 건조한지 확인하십시오.
- 95°C에서 수조를 시작하고 라인 주위에 (비부착성) 종이 타월을 적용하여 워터 라인에 누출이 없는지 확인합니다.
- 가스 버블러 트랩 설정
- 버블러의 PTFE 슬리브가 제자리에 있고 손상되지 않았는지 확인합니다.
- 가스 버블러를 열고 15 mL의 1 M NaOH를 버블러 베이스에 주입한다.
- 가스 버블러를 재배치하고 하단을 위쪽으로 누르고 두 부분을 약간 비틀어 연결을 단단히 밀봉합니다. 힘을 가하지 않고 버블러의 상단을 돌릴 수 없다는 것은 올바른 씰을 나타냅니다.
- 퍼지 용기의 출구를 가스 버블러 트랩의 입구에 연결하십시오.
4.I3- 아세트산 분석 제제
참고: 아세트산 분석 제제에서 I 3-에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 저작 15,22,38,41,42를 참조하십시오.
- NO2-에 대한 표준 곡선 준비
- 69 mg의 아질산나트륨(NaNO2)을 10 mL의 ddH2O에 용해시켜 원액을 준비하여 100 mM 용액을 얻었다. 이 솔루션은 밀폐 용기에 보관하고 냉장 보관하며 빛으로부터 보호하면 안정적입니다.
- 원액을 900 μL의ddH2O로 미리 채워진 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 연속적으로 희석한다: 첫 번째 원심분리 튜브에 100 μL의 원액을 첨가하고, 혼합, 라벨링하고, 두 번째 튜브에 대해 100 μL의 튜브를 사용하고, 이어서 반복하여 10 mM, 1 mM, 이어서 100 μM의 결과를 초래한다.
- ddH2O로 추가로 희석하여 보정 곡선에 사용되는 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM 및 500 nM NaNO2 분취량을 얻었다.
- 퍼지 용기에 I3-아세트산을 준비한다(1주일 동안 실온(RT)에서 보관할 수 있음)22
- 요오드화칼륨(KI) 2g과 요오드(I2) 1.3g을ddH2O40mL와 아세트산 140mL에 첨가한다.
- 혼합물을 적어도 30분 동안 교반하여 충분히 혼합한다.
- NO2-, S-니트로소티올(S-NO-Hb, Hb가 수집되는 경우) 및 철-니트로실 착물(Hb가 수집되는 경우 Hb-NO)의 시차 측정을 위해 샘플을 준비합니다(그림 3).
- 각 샘플을 광보호 마이크로 원심분리 튜브에서 270 μL (S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하는 경우 900 μL의 Hb)의 3 분취량으로 나누고, 그 중 2 개는 30 μL의 1x PBS (S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하는 경우 100 μL)로 미리 채워지고 세 번째 튜브는 30 μL의 HgCl2 (S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하는 경우 100 μL)로 미리 채워지고, 와류하고 RT에서 2분 동안 인큐베이션한다(그림 3).
- Fe-NOs를 측정하기 위해 HgCl2를 갖는 샘플에 30 μL의 5% AS를 첨가하고, (Hb-NO의 경우 100 μL) 및 S-NOs 및 Fe-NOs를 측정하기 위해 PBS를 첨가한 것 (S-NO-Hb 및 Hb-NO의 경우 100 μL)을 측정하고, 30 μL의 PBS를 30 μL의 PBS를 이미 1x PBS로 미리 채워 30 μL를 첨가하여 Hb 수집으로부터 NO2-, S-NOs 및 Fe-NOs(잔류 NO2-에 대해 100 μL)를 측정하고, S-NO 및 Hb-NO). 소용돌이를 3분 동안 RT에서 인큐베이션한다(그림 3).
5. 셀 프리 Hb 설정에 의한 소비 없음
참고: 자세한 내용은 이전에 출판된 저작물(38)을 참조한다.
- 공지된 농도로 정제된 스톡 Hb 용액으로부터 표준 oxyHb 용액을 준비한다.
- ddH2O를 첨가하여 원액을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 연속적으로 희석하여 검량선에 사용될 용액을 얻었다: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM, 1.56 μM.
- DETA-NONOate 용액 준비
- pH 7.4 PBS에서 10 μM NaOH 중 610 μL의 DETA-NONOate에 10 mg의 DETA-NONOate를 첨가하여 100 mM의 DETA-NONOate를 생성하고 이를 얼음 위에 보관한다.
6. 화학발광 검출기(CLD)를 시작하고 퍼지 용기를 준비한다.
주: 퍼지 용기의 준비에 대해서는, 이전에 발표된 작업(43)을 참조한다.
- CLD와의 기본 연결 확인
- 산소 라인을 CLD에 연결하고 CLD 제조업체와 일치하는 압력으로 산소 탱크를 엽니 다.
- IFD(집중 전계 유전체) 필터 라인이 CLD에 연결되어 있지만 퍼지 용기 또는 NaOH 트랩에는 연결되어 있지 않은지 확인하십시오.
- CLD 시작
- CLD 인터페이스에서 액상 분석을 위한 검출 프로그램 실행을 시작하십시오.
- 산소 공급이 적절한지 확인합니다. 이 경우 CLD는 입구에서 샘플링을 성공적으로 시작하고 밀리볼트 (0-5mV)의 신호로 감지를 나타냅니다. 그렇지 않으면 CLD가 네거티브 진단 신호를 프롬프트합니다.
- 퍼지 용기 준비
- 세 가지 포트 모두에서 퍼지 용기를 닫으십시오 : 바늘 밸브를 오른쪽으로 완전히 조이고 입구 및 출구 스톱콕을 닫으십시오.
- 정화 용기로부터 캡을 제거하고 계획된 분석법에 특이적인 시약의 충분한 양을 반응 챔버(표 1)에 첨가하여 샘플을 주입하는데 사용된 주사기 바늘이 유체 컬럼에 도달할 수 있도록 한다.
- 안정한 원하는 기준선의 존재를 검증한다(표 1).
- 퍼지 가스 흐름 시작
- 불활성 가스 탱크(예:N2)에 2단 조절기가 장착되어 있는지 확인하고 불활성 가스 탱크를 용기의 가스 입구와 연결하십시오.
- 1-5 psi의 조절기에서 출구 압력으로 가스를 열고 퍼지 용기의 입구를 열고 퍼지 용기의 바늘 밸브를 천천히 열어 가스가 유입 될 수 있도록하십시오. 퍼지 용기 내에서 버블링을 확인합니다.
- 가스 흐름 조정
- 주변 공기를 샘플링하는 IFD 필터 라인으로 CLD에 의해 측정된 셀 압력을 기록하십시오.
- 퍼지 용기 상에 캡을 재배치하고, IFD 필터 라인을 퍼지 용기에 연결하고(또는 HCl 분석에서 VCl3 내의 NaOH 트랩에), 퍼지 용기의 출구를 개방한다.
- 니들 밸브를 사용하여 주변 공기에 기록된 CLD 레벨에서 동일한 셀 압력에 도달하십시오.
7. 실험
참고: 실험에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 작업(43)을 참조한다.
- 화학발광 신호 수집 프로그램 시작
- CLD의 직렬 포트를 수집 프로그램이 설치된 컴퓨터의 직렬 포트에 연결합니다.
- 분석 프로그램을 실행합니다.
- 획득을 클릭하고 .data 파일을 저장할 폴더를 선택하고 파일 이름을 입력 한 다음 저장을 클릭하십시오.
참고: 사전 설정된 시간이 경과하면 녹화가 자동으로 중지되므로 화면에서 미리 설정된 실행 시간을 확인합니다. 필요한 경우 사전 설정된 실행 시간을 늘릴 수 있습니다.
- 반복 시료 주입 준비
- 최소 및/또는 최대 버튼을 클릭한 다음 원하는 값을 입력하여 대상 기준선을 제어하도록 화면의 전압 배율을 조정합니다.
- ddH2O로 채워진20- 또는 50-mL 튜브를 가지고 샘플 사이의 주사기를 헹구십시오.
- 섬세한 작업 물티슈 상자를 쉽게 사용할 수 있습니다.
- 시료 주입
참고: 보정 곡선에 대한 표준 솔루션(가장 덜 농축된 샘플에서 가장 농축된 샘플로 주입)에서 시작하여 실험 샘플로 진행하십시오(중복 또는 삼중으로 주입하는 것을 고려하십시오).- 각 샘플을 철수하기 전에(그리고 각 주입 후)ddH2O로 주사기를 적어도 2배 이상 헹구고 작업 닦아내기에서 방해받지 않은 물이 분출될 때마다 확인하십시오.
- 주사기와 튜브를 모두 가까운 거리에 유지하면서 시료 튜브에 주사기를 삽입하고 플런저를 원하는 부피로 당기면서 기포 및/또는 비균질화된 고체 부품이 갇히지 않도록 합니다.
- 작업 와이퍼로 주사기의 팁을 닦은 다음 주사기를 주입구의 셉타 캡에 삽입하고 주사기의 팁이 반응 챔버 내의 액상 내에 있는지 확인한 후 주입합니다.
- 소프트웨어 프로그램에 주입을 표시하고 기다립니다.
- 주입으로 인해 신호가 위쪽으로 변경되는지 확인하고(보충 그림 1) (셀 프리 Hb 분석법에 의한 NO 소비량에서 아래쪽으로) 샘플 이름 아래의 회색 상자를 클릭하여 샘플 이름을 입력한 다음 마크 인젝션을 클릭합니다.
참고: 시료 주입이 신호를 생성하지 않는 경우 주사기 폐색이 의심됩니다. - 전기 신호가 기준선에 다시 도달 할 때까지 기다리십시오 (일반적으로 3-4 분 정도 소요됨). 이 시간은 7.3.1 단계를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
- 주입으로 인해 신호가 위쪽으로 변경되는지 확인하고(보충 그림 1) (셀 프리 Hb 분석법에 의한 NO 소비량에서 아래쪽으로) 샘플 이름 아래의 회색 상자를 클릭하여 샘플 이름을 입력한 다음 마크 인젝션을 클릭합니다.
- 실험 종료 시와 주사 후 7.3 단계 및 7.4 단계에 표시된 모든 단계를 반복하십시오. 보존 솔루션의 샘플을 실행하는 것을 잊지 마십시오 (사용 된 경우)
- 실험 중지
- STOP을 클릭하여 신호 획득을 중단하고 CLD를 중지하고 수조를 끕니다 (NO3-가 측정 된 경우).
- 가스 흐름을 중단하고, 바늘 밸브를 열고, 퍼지 용기에서 캡을 제거하고, 폐기물 용기를 배수구 아래에 놓고 배수 스토콕을 엽니 다.
참고: 실험에서 60분 이상 데이터 수집이 필요한 경우 실행 시간 60분 후(7.1.3단계 반복) 수집을 다시 시작하고 새 파일을 만들어야 합니다.
8. 측정 및 계산
참고: 측정 및 계산은 오프라인에서 수행되며 다른 시간에 수행할 수 있습니다.
- 오프라인 데이터 분석을 위한 화학발광 수집 프로그램 시작
- 프로그램을 시작하고 프로세스를 클릭하십시오.
- 실험 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
- 각 투여에 대한 곡선 아래의 면적 계산
- 이 소프트웨어는 기준선 (보충 그림 2A, 수평 노란색 선)과 각 샘플 투여에 의해 생성 된 각 파동의 피크 축 (세로 노란색 선)을 화면에 자동으로 그래프로 표시합니다 : 올바른 위치를 확인하고 (또는 각 라인을 클릭하고 마우스 또는 화살표로 이동하여 조정) 임계 값 확인 (보충 그림 2B)을 클릭하십시오.
참고: 무세포 Hb 측정 분석법에 의한 NO 소비에서 소프트웨어는 일반적으로 샘플 주입에 의해 생성된 파형을 정확하게 캡처하지 못합니다. 각 파형을 확대함으로써 작업자는 영역 계산에서 소프트웨어를 쉽게 지원할 수 있습니다(보충 그림 2). - 이 소프트웨어는 각 샘플 투여로 인해 발생하는 각 피크의 시작 (세로 녹색 선)과 끝 (세로 빨간색 선)을 자동으로 그래프로 표시합니다 : 올바른 위치를 확인하고 (또는 각 줄을 클릭하고 마우스 또는 화살표로 이동하여 조정) 통합 을 클릭하십시오 (보충 그림 2C).
참고: 추적의 일부 영역은 이 시점에서 주입으로 잘못 정의될 수 있으며 일부 피크는 자동으로 두 번 계산될 수 있습니다. 두 실수 모두 8.2.2 단계에서 다시 식별하고 제거 할 수 있습니다. - 이 소프트웨어는 실험 중에 표시된 주입 후 모든 신호 영역과 할당 된 이름을 자동으로 일치시킵니다 : 다음 피크 및 이전 피크를 클릭하여 할당 된 이름으로 각 피크 (노란색 세로선으로 표시됨)를 탐색 한 다음 버튼을 클릭하면 모두 확인] 버튼을 클릭하여 마침내 화면의 모든 영역에 대한 계산을 얻습니다.
- 사용자 또는 프로그램에서 만든 모든 이름 지정 또는 일치 실수를 수정하려면 보충 파일 1에 표시된 단추를 필요에 따라 사용하십시오.
- 이 소프트웨어는 기준선 (보충 그림 2A, 수평 노란색 선)과 각 샘플 투여에 의해 생성 된 각 파동의 피크 축 (세로 노란색 선)을 화면에 자동으로 그래프로 표시합니다 : 올바른 위치를 확인하고 (또는 각 라인을 클릭하고 마우스 또는 화살표로 이동하여 조정) 임계 값 확인 (보충 그림 2B)을 클릭하십시오.
- 보정 곡선 값을 스프레드시트로 전송하고 선형 회귀 방정식을 생성합니다(보충 그림 3).
- 복사 붙여 넣기를 통해 CLD 프로그램에서 새 스프레드 시트로 데이터를 전송하십시오. 데이터시트의 두 열을 표본 농도 및 곡선 아래 영역으로 정렬하고 두 열에 일치하는 0 값을 추가합니다.
- 두 열을 선택하고 분산형 삽입을 클릭> 다음 차트 디자인 메뉴에서 차트 요소 추가를 선택하여 추세선 > 선형>니다.
- 생성된 추세선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 추세선 서식을 클릭한 다음 차트에 방정식 표시 옵션을 클릭하고 추세선 서식 메뉴의 차트에 R-제곱 값 표시 옵션을 클릭하여 간단한 선형 보정 방정식을 가져옵니다.
- 각 샘플의 계산된 면적을 전송하여 농도를 계산합니다(보충 그림 3).
- 스프레드시트의 모든 값을 보고합니다. 다음 컬럼에서, 단계 8.3.3으로부터 얻은 방정식을 적용하여 주입된 각 샘플의 농도를 구하고, 여기서 y는 농도(새로운 컬럼의 값)이고 x는 주입 후 측정된 곡선 아래의 면적이다.
참고 : 보존 용액 (사용 된 경우)에서 측정 된 농도를 고려하고 그에 따라 값을 뺍니다.
- 스프레드시트의 모든 값을 보고합니다. 다음 컬럼에서, 단계 8.3.3으로부터 얻은 방정식을 적용하여 주입된 각 샘플의 농도를 구하고, 여기서 y는 농도(새로운 컬럼의 값)이고 x는 주입 후 측정된 곡선 아래의 면적이다.
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Representative Results
무세포 Hb 분석법에 의한 NO 소비는 공지된 농도의 무세포 oxyHb를 함유하는 샘플에서 사용되었다(도 4). 옥시Hb의 하나의 헴이 화학량론적으로 분석에서 하나의 NO 분자를 방출함에 따라, 정제된 무세포 oxyHb는 검정에 대한 검량선을 구축하는데 사용된다(보충 도 3).
심장 수술 중 심폐 우회술(CPB)에서 벗어나는 환자에서 무세포 Hb(비색 분석법으로 측정됨)와 NO 소비 사이의 용량-반응 관계가 도 5에 도시되어 있다. CPB 후 Hb-Fe2+-O2 상태(도 5, 적색)에서 헴 그룹의 농도가 더 높다고 가정할 수 있는데, 이로부터 무세포 Hb의 헴 그룹 중 소수만이 NO를 소비하는 CPB 동안 NO를 투여받은 환자에 비해 (도 5, 적색).
무세포 Hb에 의한 NO 소비를 평가하기 위한 프로토콜은 이전에 심장 수술을 받고 CPB를 필요로 하는 50명의 환자로부터 혈장 샘플을 시험하기 위해 적용되었다. 혈액을 CPB 후 기준선 및 15분, 4시간, 및 12h에서 수집하였다. 이 연구의 목적은 폐 및 전신 혈관 저항성과 CPB 후에 관찰 된 용혈의 증가 사이의 기존 관계를 조사하는 것이 었습니다. 무세포 Hb 농도는 Hb 비색 검정으로 평가하였다. 용혈은 CPB 후 15 분 후에 최고조에 달했다. 축적된 유리 Hb는 12h18 이내에 혈장으로부터 서서히 제거되었다(도 6A). 대신 NO 소비는 15분에 정점을 찍었고 단 4시간 만에 기준선 값에 도달했습니다(그림 6B). 무세포 Hb에 의한 NO 소비의 선형 회귀 곡선은 기준선, 4h 및 12시간 후 CPB와 반대되는 15분 후 CPB 시점에서의 화학량론적 관계를 나타내었다(도 6C). 동역학의 관찰 된 차이에 대한 설명은 환자의 내피에 의해 방출되는 NO 분자를 아직 만나지 않은 새로 방출 된 자유 Hb의 풍부함에 있습니다. oxyHb의 농도 (NO를 소거하고 분석에서 소비를 초래함)는 실제로 다른 시점에서보다 15 분에서 더 높았다. 기준선 및 다른 시점에서에서 수집된 혈장은 이미 NO에 의해 산화되었고, NO에 결합하지 않았고, 분석에서 소비를 일으키지 않았던 metHb의 비교적 더 높은 성분을 가졌다. 폐 및 전신 혈관 저항성을 침습적으로 측정하고 15분에 최고조에 달하였다. 이 특정 환자 집단에서 처음으로 자유 Hb에 의한 NO 소비가 혈관 수축과 일시적으로 결합되는 것으로 관찰되었으며, 이는 동물 모델 및 겸상 적혈구 질환 환자18에서 이전의 관찰을 확인했다.
CPB 동안 및 수술 후 NO 가스의 투여는 순환하는 metHb 대 옥시Hb의 상대적인 양을 증가시킨다. 심장 수술을 받은 환자가 수술 중 및 수술 후 NO-가스로 치료되었을 때, CPB 후 유리 Hb의 관찰된 증가(도 7A)는 전술한 프로토콜로 측정된 바와 같이 NO 소비의 어떠한 증가와도 결합되지 않았다(도 7B). 외인성으로 투여된 NO 가스는 대부분의 oxyHb를 metHb로 변환하고, 이는 생체내에서 NO를 소거하거나 시험관내에서 NO를 소비하지 않는다(공개되지 않은 데이터).
도 4: 정제된 무세포 옥시헤모글로빈에 의한 산화질소 소비. 산화질소 소비 분석은 정제된 무세포 옥시헤모글로빈의 공지된 농도의 샘플을 주입함으로써 수행된다. 회귀선은 빨간색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 심폐 우회로 심장 수술을받는 환자의 산화 질소 소비 및 무세포 헤모글로빈 농도. 각 환자의 무세포 헤모글로빈 수준은, 비색 키트로 측정된 바와 같이, 화학발광을 통해 측정된 산화질소(NO) 소비량으로 플롯팅되었다. 혈액 샘플은 CPB의 종료 15분 후에 수집되었다. 회귀 라인은 심폐 우회술 (CPB) 동안 NO를 수신하지 않거나 (녹색으로) 수신하지 않는 심장 수술 환자에 대해 도시된다. 헤모글로빈은 헴기의 μM로 발현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 심장 수술 환자에서 산화질소 소비 및 무세포 헤모글로빈. (A) 심폐 우회술(CPB)을 이용한 심장 수술을 받은 환자의 혈장 내 무세포 헤모글로빈(Hb) 농도(N=50)는 시판되는 비색 판정 키트를 사용하여 상이한 시점에서 측정되었다. 데이터는 시간점 사이에 고정된 효과의 증거와 함께 혼합된 모델을 피팅함으로써 분석되었다. 상이한 시점에서의 혈장 농도는 Tukey의 다중 비교 시험과 함께 기준선과 비교되었다. (b) 유리 Hb의 정량화에 사용된 동일한 샘플로부터 얻어진 플라즈마에 의한 산화질소(NO) 소비량. 데이터는 시간점 사이에 고정된 효과의 증거와 함께 혼합 모델을 피팅함으로써 분석되었다. 상이한 시점에서의 혈장 농도는 Dunnett의 다중 비교 시험과 함께 기준선과 비교되었다. (C) NO 소비와 일치하는 무세포 Hb 혈장 함량에 대한 회귀 라인. * p< 0.05, **p는 0.01<, ***p는 0.001, ***p < 0.0001, **** p는 0.0001, ns는 유의<지 않다. 데이터는 사분위수 범위의 중앙값 ± 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 심장 수술을 받는 환자의 산화질소 소비에 대한 산화질소 가스 투여의 효과. (A) 심폐 우회술(CPB)을 이용한 심장 수술을 받은 환자의 혈장 내 무세포 헤모글로빈 농도는 CPB가 시작된 이후 24시간 동안 위약(N=28) 또는 산화질소(NO) 가스(N=22)를 투여받는다. 농도는 상업적으로 입수가능한 비색 키트의 사용과 함께 상이한 시점에서 결정되었다. 데이터는 프리드먼의 시험에 의해 분석되었으며, 이는 두 그룹의 시점 사이에 효과의 존재를 나타낸다. 상이한 시점에서의 혈장 농도는 Dunn의 다중 비교 시험과 함께 기준선과 비교되었다. (b) 무세포 Hb의 정량화에 사용된 동일한 샘플로부터 수득된 혈장에 의한 NO 소비량. 데이터는 프리드먼의 시험에 의해 분석되었으며, 이는 두 그룹 모두에서 시점 사이의 효과의 존재를 나타낸다. 상이한 시점에서의 혈장 농도는 Dunn의 다중 비교 시험과 함께 기준선과 비교되었다. ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 사분위수 범위의 중앙값 ± 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시험 | 시약 혼합물 | 목표 기준선(mV) |
| HCl의 VCl3 | HCl 포화 용액 중VCl3 5 mL + 소포제 100 μL | 0~5mV* |
| I3- 아세트산에서 | 5-7 mL의 I3– 시약 | 0~5mV* |
| 무세포 헤모글로빈에 의한 NO 소비 | pH 7.4에서 PBS 5–7 mL + 소포제 100 μL + 팽창된 DETA-NONOate 용액 20 μL | 70~100mV** |
| *이상적인 값: 기준선은 실험 환경의 공기 품질로 인해 더 높을 수 있습니다. | ||
| **실험을 시작하기 전에 20분 동안 안정성을 보장하십시오. | ||
표 1: 다양한 화학발광 분석을 위한 용기 시약 조성물 및 표적 기준선을 퍼지. 각각의 기재된 검정을 위한 용기 정화 시약 조성물. NO = 산화질소; PBS = 포스페이트 퍼세탈린; 데타-노노에이트: (Z)-1-[2-(2-아미노에틸)-N-(2-암모니오에틸)아미노]디아젠-1-움-1,2-디올레이트. *이상적인 값: 기준선은 실험 환경에서 공기의 질로 인해 더 높을 수 있습니다. **실험을 시작하기 전에 20분 동안 안정성을 보장하십시오. NO 소비 분석을 수행하기 위해, 스케일은 목표 기준 전압인 70mV 내지 100mV(예를 들어, 0-100mV) 사이의 값을 캡처하도록 소프트웨어 상에서 변경되어야 한다. 이 조정은 샘플 주입을 완전히 제어하여 샘플 주입 후 기준선에서 이동하는 신호를 문서화하고 기준선으로 돌아가는 신호를 관찰 할 수 있도록 제안됩니다. 데이터 기록은 시각화된 스케일의 영향을 받거나 이에 국한되지 않습니다.
보충 그림 1: HCl 분석에서 VCl3에서 NO 검출에 따른 피크. HCl에서 VCl3에서의 샘플 투여를 따르는 피크는 CLD 번들 소프트웨어 상에 도시되어 있다. 각 주입에 대한 피크 아래의 면적의 계산은 편의를 위해 도시되고 보충 그림 2에 설명되어 있습니다. 이 실험에서, 상이한 농도의 표준이 보정 곡선을 위해 투여되었고, 이어서 혈장 샘플이 뒤따랐다. 희석은 교정 곡선의 하이 엔드 또는 심지어 외부에서 NO를 산출하는 샘플에서 대사 산물을 계산하는 데 유용한 솔루션입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 피크 아래 영역의 사용자 지원 자동 계산. 무세포 헤모글로빈에 의한 NO 소비 분석을 수행할 때, 각 샘플 주입에 의해 생성된 피크 아래의 면적을 측정하기 위한 가장 정확한 한계를 소프트웨어에 제공하기 위해 수동으로 피크를 설정해야 할 수도 있다. (A) 기록된 실험의 대표적인 전체보기. 메인 메뉴에서 프로세스를 클릭하고 관심있는 기록 된 파일을 선택하고 열면 도달합니다. 노란색 선은 피크 아래 영역의 직선 세그먼트를 구성하는 신호 임계값(mV)을 나타냅니다. 그것을 클릭하면 사용자는 신호 영역으로 드래그 할 수 있습니다. x 축과 y 축은 왼쪽 아래 버튼을 클릭하거나 각각에 대해 원하는 최소 및 최대 값을 입력하여 정확한 측정을 위해 관심 피크를 확대하도록 변경할 수 있습니다. (B) 임계 위치 지정. 사용자는 샘플 주입으로 인한 신호 다운슬라이드 직전에 노란색 선을 신호 중간점으로 드래그하여 최적의 기준선 임계값을 선택할 수 있습니다. 영역을 계속 제한하려면 사용자는 수동으로 피크 설정 버튼을 클릭해야합니다. (C) 커서 위치 지정 시작 및 종료. 시작 커서 설정 버튼을 클릭하면 화면에 녹색 선이 나타납니다. 녹색 선은 샘플 주입으로 인한 다운 슬라이드의 맨 처음에 드래그 및 풀어서 배치해야합니다. 동일한 버튼은 화면에 빨간색 선이 나타나는 것을 클릭하여 레이블을 끝 커서 설정 으로 변경합니다. 적색 선은 주입된 샘플로부터의 NO 소비로 인한 편향 후에 신호가 기준선에 다시 도달하는 지점에 배치되어야 한다. 전체적으로 임계 선 (노란색, B), 녹색 선 및 빨간색 선은 샘플 주입에 의해 생성 된 영역을 정확하게 윤곽을 그립니다. (d) 피크 아래의 면적을 산출한다. 통합 버튼(C)을 클릭하면 피크 아래의 계산된 영역이 화면 오른쪽 상단에 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 보정 곡선 및 결과가 있는 대표적인 스프레드시트입니다. 무세포 헤모글로빈(헴의 [μM]으로 표시됨)의 공지된 농도를 갖는 샘플의 주입에 의한 산화질소(NO) 소비로부터 생성된 피크 아래의 계산된 영역은 좌측 상단(노란색 배경 상)에 도시되어 있다. 값은 보정 곡선과 그 결과 선형 방정식 y = mx + q를 작성하기 위해 플로팅됩니다. 기울기(m)는 광승수 튜브에 의해 검출된 신호를 1mV만큼 감소시키는 데 필요한 옥시Hb 헴기(μM)의 수이다. 네 개의 상이한 시점(상이한 배경색으로 표시됨)에서 수득된 한 환자로부터의 샘플의 삼중 주사(Run N 1,2,3)로부터의 계산된 값을 스프레드시트에 입력하였다. 각 삼중항의 평균은 선형 방정식을 풀면서 각 샘플에 의해 야기 된 NO 소비의 값을 산출하는 데 사용되었습니다 : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 번들 소프트웨어를 사용하여 피크를 검토합니다. 이 파일에는 번들 소프트웨어에서 가져온 스크린 샷과 각 버튼에 허용되는 작업이 포함되어 있습니다. 모든 피크(아티팩트로 인한 잘못된 피크 포함)에 대해 사용자는 파일에 표시된 버튼을 사용하여 필요에 따라 특정 피크를 확인, 무시 또는 삭제하거나 이름을 지정할 수 있습니다. 사용자는 또한 이전에 검출되지 않은 피크를 기록할 수 있다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
높은 민감도로 인해, NO 및 관련 화합물의 결정을 위한 화학발광 기반 분석은NO2-오염의 위험이 높다. 실험에 사용된 각각의 시약 (특히 NO2-차단 용액) 및 희석제 (ddH2O 포함)는 배경 신호에 대해 보정하기위해 그의NO2-함량에 대해 시험되어야 한다. 아질산염은 10분 전혈에서 반감기가 매우 반응하며NO3-를 빠르게 생성한다. 따라서 혈액 수집과 원심분리 또는NO2-차단 사이에 경과하는 시간은 사전 분석 오류를 일으킬 수 있으므로 최소화해야합니다15. 혈장 샘플을 이용한 분석에서, 바람직하게는 헤파린 튜브에 혈액을 수집하고, 250 mg의 NEM을 10 mL의 인산완충 식염수(PBS)에 용해시킴으로써 생성된 200 nM NEM의 40 μL로 티올기를 봉쇄한 후 4°C에서 5분 동안 750 x g에서 원심분리한다. 상기 원액은 4°C에서 저장될 수 있다. NO 신타제 (NOS)를 억제하는 니트로아르기닌, 니트로프로스터시드 및 니트로글리세린과 같은 화합물은 NO로의 느린 비정량적 전환을 겪고, 기준선 상승을 초래한다. NOS 억제제의 사용이 조사의 일부인 경우, 니트로기를 포함하지 않는 차단제를 사용하는 것이 좋습니다43. 퍼지 용기의 입구 압력은 샘플링을 위해 CLD에 의해 만들어진 지속적인 음압과 일치해야합니다. 입구 압력이 낮 으면 매체의 진공 증류로 인해 가스 퍼지 라인 및 챔버가 오염되어 신호 왜곡이 발생할 수 있습니다. 또한, 소량의 공기가 퍼지 용기에 들어가서 용액과 반응하여 과도한 NO를 생성할 수 있다. 반대로, 샘플 인출 흐름보다 높은 유량에 의해 야기되는 과도한 압력은 NO를 대기 중으로 방출하여 신호(15)의 과소 평가로 이어질 수 있다. 또한, HCl 중의 VCl3 및 아세트산 프로토콜에서의 I3-둘 모두는 샘플 농도를 산출하기 위해 준비 및 다중 계산 동안 다중 희석을 필요로 한다. 희석과 계산이 많은 그룹에 의해 오류44의 주요 원인으로 인식됨에 따라 모든 단계를 신중하게 기록해야합니다.
NO2-차단 용액의 첨가(단계 2.1.2)는 적혈구가 용해되게 하여, 모든 OxyHb를 MetHb로 감소시킨다. NO3-의 후속 생성과 함께 NO2-에 의한 철 함유 단백질 (주로 OxyHb)의 급속한 감소를 피한다. 수집시이 용액으로 샘플을 처리하면 NO2- 및 / 또는 NO3-을 정확하게 측정해야합니다. 대조적으로, 용액은 무세포 Hb 분석에 의한 NO 소비를 계획할 때 사용되어서는 안 된다. NO2-차단 용액의 분취량은 샘플과 함께 저장되어야 하며 용액 자체에 의해 야기된 신호 부분을 제거하는데 사용되어야 한다. 마지막으로, 희석 인자는 측정된 대사산물의 최종 농도를 계산하기 위해 고려되어야 한다. I3-아세트산 분석에서, NO2-농도는 PBS(NO2-, S-NO, Fe-NO)만을 함유하는 분취량의 것으로부터 HgCl2(S-NO 및 Fe-NO)가 없는 AS를 함유하는 분취액의 농도를 뺀 것에 의해 얻어진다. S-NO (수은-불안정성 단백질)의 농도를 계산하기 위해, HgCl2로 AS로 처리된 분취량의 농도 (Fe-NOs 또는 수은-안정한 니트로소-단백질)는HgCl2 없이 AS로 처리된 분취량의 농도에서 뺄 것이다. 빼기 전에 사용자는 시료 준비 중에 사용된 희석 계수를 고려하여 각 분취량의 농도에 0.8181(270/330)을 곱한 것을 리콜해야 합니다(그림 3). 동일한 개념이 S-NO-Hb 및 Hb-NO 측정에 적용되며, 여기서 절대 농도는 측정된 Hb22의 분율이다. 샘플의 종류에 따라, NO3-농도의 정확한 카운트는 HCl 프로토콜에서 VCl3 및 아세트산 프로토콜에서의 I3-를 모두 실행하여 최종적으로NO3- 및 NO2-의 농도를 뺄 것을 요구할 수 있다. 이는 전혈 및 혈장 샘플, 예를 들어 NO3-전형적으로NO2-를 훨씬 초과하는 경우에 항상 필요한 것은 아니다.
HCl의 부식성으로 인해 HCl 분석에서 VCl3을 수행 할 때 NaOH 트랩이 적절한 위치에 있지 않으면 CLD가 손상 될 것임을 상기시키는 것이 매우 중요합니다. NaOH 트랩을 채우기 위해 사용되는 1M NaOH 용액은 4g의 NaOH 염을 100mL의 ddH2O에 용해시키거나 100mL의 ddH2O에 50% NaOH를 희석하여 구입하거나 제조할수 있다. ddH2O로 10 μM로 추가로 희석될 때, NaOH는 퍼지 용기에 주입함으로써 단백질 파편을 제거하는데 매우 유용하다.
CLD에 의해 검출된 기준선 신호는 안정하고 0-5mV 이내여야 한다. 더 높은 기준 신호는 대기 오염 (NO 및 유도체에 의해)으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 입구를 야외에 남겨 두면 확인할 수 있습니다. 더 높은 전압이 정화 용기에서만 관찰되는 경우, 불활성 기체로 탱크의 오염이 고려되어야하는 반면, 튜브 내의 유기 잔재물의 지속성 또는 NO2-의 존재로 인해 가장 흔합니다. 퍼지 용기를ddH2O로 여러 번 세척하면 기준선 전압을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성공하지 못한 경우, 퍼지 용기를 24-48 시간 동안 100 mM NaOH로 인큐베이션한 다음ddH2O로 여러 번 세척하면 오염 물질을 제거하는 데 도움이됩니다. 무세포 Hb 분석법에 의한 NO 소비에서, 요구되는 CLD 신호는 적어도 20-30분 동안 70-100 mV이다. 신호가 안정하지 않으면(즉, 전압 감소), 10 μL의 DETA NONOate의 추가 용량이 퍼지 용기에 첨가될 수 있다. 이것은 필요에 따라 반복 될 수 있습니다. 사용하지 않은 분말과 이미 팽창 된 DETA NONOate는 모두 -80 °C에서 유지되어야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 시약은 최적의 보관에도 불구하고 빠르게 붕괴되고 새로 준비되지 않은 경우 성능이 저하되어 퍼지 용기에 여러 번 주입해야하며 덜 안정적인 등전 신호로 이어집니다. 더욱 중요하게는, PBS에서 pH 7.4로 확장되어야 하는데, 이는 이의 반감기(실온에서 pH 7.4에서 56시간 대 pH 5.0에서의 준순간 해리)45를 최적화하기 때문이다. DETA NONOate의 주사에 사용되는 주사기는 독점적으로 그 작용에 전념해야하며 샘플 주입에 사용해서는 안됩니다.
샘플의 주입이 보정 곡선의 상점보다 높은 피크를 생성하는 경우, 특히 700mv보다 높은 전압을 생성하는 경우 오류를 최소화하기 위해 샘플 (2x 또는 4x)을 희석하는 것이 좋습니다. 이는 또한 시료 주입으로 인한 딥이 검량선에 사용된 가장 농축된 시료의 주입으로 인한 것보다 더 깊은 경우 NO 소비 분석에도 적용된다. 주사 후 신호에서 피크(또는 관통)가 예상보다 작거나 부재한다는 증거는 주사에 사용되는 정밀 주사기의 막힘을 나타낼 수 있다. 사용되는 부피가 작기 때문에 (10-20 μL / 샘플), 특히 혈장 또는 소변 분석이 수행되는 경우 주사기가 막히기 때문에 채워진 주사기와 샘플이 없음을 구별하기가 어려울 수 있습니다. 플런저에 의한 저항에주의를 기울이는 것이 좋습니다. 주사기의 검사에 의해 확인 후,ddH2O로 주사기를 반복적으로 세척하고 장애물이 외부에서 보이는 경우 섬세한 작업에 주사기를 문질러 닦아서 장애물의 제거를 시도 할 수 있습니다. 의심스러운 경우, 작업 닦아서 샘플 부피를 꺼내어ddH2O로 주사기를 세척하고 샘플 투여를 반복하려고 시도하는 것이 좋습니다. 발포는 일반적인 합병증이며 액체 컬럼의 높이가 반응 컬럼의 높이를 초과하면 실험을 종료하여 신호 불안정을 일으 킵니다. 프로토콜에 지시된 소포제 용량을 초과하는 것은 기준선 신호의 증가를 야기할 수 있으므로 피해야 한다. 과도한 발포의 형성을 야기하는 샘플의 수는 반복된 분석이 수행될 때 예측 가능해지며, 이는 실험이 어떻게 최적으로 계획될 수 있는지를 알려야 하는 현상이다. 발포성을 감소시키기 위한 선택적인 단계는 혈장 또는 조직 상청액을 차가운 메탄올 (비율 1:1)과 혼합하고 4°C에서 15분, 13000 x g 동안 원심분리하는 것이다 . 메탄올이 단백질을 침전시키는 것을 고려해야한다. 자연에서 프로테익이 아닌 가벼운 S-NO와 Fe-NO만 측정됩니다. 따라서이 옵션은 전혈에 대한 연구 또는 S-NO 및 Fe-NO 단백질에 관심이있는 다른 경우에는 채택 될 수 없습니다.
아세트산에서 HCl 및 I3-중의 VCl3 이외의 더 많은 시약 용액이 기술되고 성공적으로 채택되었다. 아스코르브산은 NO2-를 특이적으로 감소시키고,NO3- 또는 S-NOs와 반응하지 않으며,NO2-가 유일한 관심 분자인 상황에서 주입된 샘플 및 계산의 벌크를 감소시키는데 사용될 수 있다. 주요 함정은 시약의 제한된 안정성이며, 시약 용액의 더 빈번한 변경이 필요하고, 이에 의해 반복된 교정(46)이 필요하다. 일산화탄소 및 쿠프로우스 클로라이드 (CuCl) 포화 시스테인 (3C 방법)을 사용하는 분석은I3-와 비교할 수있는 감도로 S-NO를 특이적으로 검출 할 수 있지만 비특이적 반응을 피하기 위해 HgCl2 유무에 관계없이 치료가 필요합니다47. 신호 분석에서 더 높은 정밀도를 달성하기 위해 실험은 .data 형식으로 기록되므로 프로토콜에 표시된 번들 프로그램 이외의 다른 소프트웨어로 오프라인 파형 분석을 완료 할 수 있습니다.
첫 번째 주입이 이루어지면 실험을 중지할 수 없습니다. 일시 중지가 필요하거나 임의의 조건(퍼지 용기 매체의 조성, 퍼지 가스 흐름, 기준선 전압)이 변경되는 경우, 실험은 해당 시점까지 주입된 샘플에 대해서만 유효합니다. 더 많은 샘플을 측정하기 전에 새로운 표준 곡선을 수행해야 합니다. 화학 발광 기반 분석에서 허용하는 정밀도에는 가격이 부과됩니다. 이 분석은 여러 가지 이유로 시간이 많이 걸립니다 : 1) 수동 샘플 주입이 중복되어 필요하기 때문에 자동화가 불가능합니다. 2) 사용되는 대부분의 시약은 장기간 비축할 수 없다. 3) 각 실험은 교정을 위해 알려진 농도에서 표준 샘플을 실행하여 시작해야하며 교정이 반복되지 않으면 일시 중지 할 수 없습니다. 4) 각 샘플은 특정 반응을 차단하기 위해 서로 다른 시약 혼합물을 함유 한 분취량으로 나뉘어 다른 대사 산물의 농도를 최종적으로 계산합니다.
이 작업은 기상에서 <1ppb NO의 검출 임계값(액상에서 최대 1pM의 NO에 해당)과 10-300mL/min의 샘플링 흐름을 갖는 Zysense NOA 280i 장치에 초점을 맞춥니다. 다른 CLD는 액상에서의 대사 산물의 측정을위한 번들 튜브 시스템과 함께 사용할 수 있습니다. 생태물리학 CLD는 가장 민감한 모델에서 1ppb의 높은 감도 임계값을 갖지만 오존 발생을 위해 산소 탱크가 필요하지 않다는 장점이 있습니다. 반면에, 보고된 샘플링 흐름은 1000 mL/min이며, 이는 퍼지 용기에 사용되는 불활성 가스 탱크의 더 높은 소비를 의미합니다. 다른 CLD 기계는 임상 사용을 위해 내뿜는 NO 분석에 전념하고 있습니다.
Chemiluminescence는 용혈 분야에서 무세포 Hb에 의한 NO 소비를 구체적으로 평가하는 가장 민감하고 검증 된 방법입니다. NO,NO2-,NO3-, S-NO 및 수은-불안정성 니트로소 화합물을 측정하기 위해 다른 기술들이 이용가능하다. NO 가스의 직접 측정은 화학 발광 또는 내뿜는 가스의 측정에서 단일 셀 전극에 이르기까지 다양한 전용 전극을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이러한 측정은 가스가 없으며, 비용이 적게 들고(아직 부패하기 쉽고), 교정이 더 자주 필요하며, CLD31에 비해 정확도가 떨어집니다. 아질산염과 NO3-은 역사적으로 Griess 반응으로 측정되었으며, 원래의 버전에서는 샘플에서 상대적 농도를 구별 할 가능성없이 두 분자를 모두 검출하는 비색 기술입니다. 이 기술의 현대적 변형은 2개의 컬럼에서 샘플의 분리를 이용하는 역상 크로마토그래피를 수반하며,NO3- 및NO2-와 2개의 독립적인 반응을 허용한다. 이들 방법의 감도는 CLD를 사용한 1 nM과 비교하여 마이크로몰 또는 약간 더 적다. 주요 함정은 시간 소비 및 수은 및 / 또는 페리시아나이드14로 전처리 된 샘플과의 비 호환성입니다. S-NOs는 아세트산 프로토콜14,41,42에서 I3-에 나타낸 바와 같이 화학발광을 사용하여 기술된 100 fM에 비해 최대 0.5 μM의 감도를 갖는 비색 및 형광 기술로 검출될 수 있다. 비오틴-스위치 분석은, 피코몰 범위에서 S-NOs를 검출하는 데 실패했음에도 불구하고, 프로테오믹 분석(48)으로 정제되고 확인될 수 있는 비오틴-표지된 단백질을 생성하는 이점을 갖는다. 자세히 살펴보면, 각 기술은 하나의 공통된 함정을 공유하는데, 이는 시험관 내 측정을 목적으로 반응의 봉쇄를 의무화하는 NO 및 그 유도체의 극단적 인 반응성입니다. 샘플의 전처리는 매우 중요하며, 특정 전처리가 반응을 완전히 차단하는지 아니면 다른 전처리보다 더 잘 수행되는지에 대한 질문에 답하는 것은 지금까지 방법론 연구의 증가를 향한 원동력이었습니다. NO의 생체 내에서 극심한 반응성은 확실히 그 대사 산물의 검출을위한 민감한 방법을 연구하는 원동력 이었지만, NO의 직접 측정은 1990 년 최초의 앰페로메트릭 검출기가 개발 된 이후 지난 삼십 년 동안 상당한 진전을 이루었습니다. 그 이후로 단일 세포 NO 함량49를 연구하는 데 사용되는 나노 센서를 포함하여 20 개 이상의 다른 프로브가 설명되었습니다. 전기 화학 센서는 생체 내 및 실시간으로 NO를 검출 할 수있는 주요 도구입니다. 폐 의학에서 여러 연구에서 전극 기반 기계와 CLD를 비교했습니다. 내뿜은 NO의 측정은 대사 산물 검출을위한 다른 분석보다 간단하며, 가스 라인 (IFD 필터를 통해)을 폐쇄 시스템 호흡 부속물에 직접 연결하거나 오프라인 분석을 위해 가방에서 몇 번 호흡해야하지만 CLD의 비용과 휴대성이 떨어집니다. 많은 전기 화학 장치가 현재 임상 사용 기준을 충족하지만 CLD와 비교할 때 감도와 재현성이 낮습니다. 또한, 절대 측정값의 측면에서의 일치는 장치들 사이에서 차선책이므로, 환자들은 항상 동일한 전기화학 장치(50)로 추적되어야 한다. 비강 내쉼 NO 측정과 같은 설정과 치료 적 저용량 및 고용량 흡입 NO와 같은 연구 환경에서 CLD를 사용하는 것은 여전히 필요합니다.
NO, 그 유도체 및 NO 결합 단백질의 정확한 측정은 간과되고 여전히 대부분 알려지지 않은 신호 전달 메커니즘을 이해하기 위해 여러 수준에서 필요합니다. 응용 분야는 면역 생물학, 신경 과학, 심혈관 과학 및 감염성 질병을 포함한 특정 대상 영역과 함께 전임상 및 임상 수준에서 생물학 및 병리학에 걸쳐 있습니다. 전임상 연구 및 임상 시험은 흡입된 NO 가스를 치료제로 사용하는 것을 조사하고 있다. 외인성 NO 가스가 혈장에서 세포 구획에 이르기까지 모든 수준에서 NO 대사 산물 및 NO 결합 단백질의 농도에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 더 깊은 지식이 필요할 것입니다. 고수율 프로테오믹스의 구현은 NO 및 그 유도체에 의해 영향을 받는 알려진 매개체의 수를 증가시킬 가능성이 높으며, NO 대사산물의 정확한 측정을 필요로 하는 새로운 기계론적 조사를 요구할 수 있다.
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Disclosures
L.B.는 용혈 및 산화 질소에 대한 그의 연구에 대한 수석 연구원으로 K23 HL128882 / NHLBI NIH로부터 급여 지원을받습니다. LB는 George Mason University의 Mercatus Center와 iNO Therapeutics LLC의 "COVID-19 연구를위한 빠른 보조금"으로부터 보조금을받습니다. B.Y.는 NHLBI / #R21HL130956 및 DOD / 제네바 재단 (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244)의 보조금으로 지원됩니다. B.Y.는 MGH에서 산화 질소의 전기 생성에 관한 특허를 받았습니다.
L.B.와 B.Y.는 2021년 6월 7일에 출원된 COVID-19 질병 PCT 출원번호: PCT/US2021/036269에서 NO 전달에 대한 특허 출원을 제출했습니다. RWC는 자원이 부족한 환경에 위치한 어린이의 결핵에 대한 분산 진단을 목표로하는 기술 개발의 수석 연구원으로 Unitaid로부터 급여 지원을받습니다.
Acknowledgments
이 원고에보고 된 프로토콜은 매사추세츠 종합 병원의 마취학과 인 워렌 자폴 (Warren Zapol) 박사의 중환자 치료 마취 연구 연구소의 이전 동료들의 축적 된 기여로 가능했습니다. 우리는 나카가와 아키토 박사, 프란체스코 자덱, 엠마누엘레 바세나, 정 레이, 나가사카 야스코, 에스테르 스파그놀리, 엠마누엘레 레조아글리 박사의 공헌을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma | 45754 | 500 mL - liquid |
| Antifoam B Emulsion | Sigma | A5757 | 250 mL - liquid |
| DETA NONOate | Cayman | 82120 | 10 mg |
| Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190144 | 500 mL |
| Hydroochloric Acid 37% (1 M) | Sigma | 258148 | 500 mL - liquid |
| Iodine | SAFC | 207772 | 100 g - solid |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
| Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% | Sigma | 215465 | 100 g - solid (dissolve in water) |
| Mili-Q Water Purification System | Millipore | ||
| Model 705 RN 50 μL syringe | Hamilton | 80530 | Microliter syringe |
| Model 802 N 25 μL Syringe | Hamilton | 84854 | Microliter syringe |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | 25 g - crystalline |
| Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel | Zysense | NOA 280i | Chemiluminescence Detector |
| Nonidet p-40 (NP-40) | ThermoFisher | 85125 | 10% - 500 mL |
| Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% | Sigma | 244023 | 100 g - powder |
| Potassium Iodide ACS reagent> 99% | Sigma | 221945 | 100 g - solid |
| Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS | Supelco | 105067 | 250 g - crystalline |
| PowerGen 125 | Fisher Scientific | 14-359-251 | Mechanic Homogenizer |
| RV3 Two Stage Rotary Vane Pump | Edwards | A65201906 | Vacuum Pump - Bundled with analyzer |
| Sodium Heparin - BD Hemogard Clo | BD Biosciences | BD367871 | 75 USP Units |
| Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% | Sigma | 795429 | 1 kg - pelletts |
| Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% | Sigma | 221341 | 500 g - powder |
| Sodium nitrite ≥ 99% | Sigma | S2252 | 500 g - crystalline |
| Sulfanilamide ≥ 98% | Sigma | S9251 | 100 g - solid |
| Vanadium (III) Chloride | Sigma | 112393 | 25 g - solid - Caution (exothermic) |
| Whatman 1 Filter Paper | Sigma | WHA10010155 |
References
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