नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने के लिए Chemiluminescence-आधारित Assays और Autoxidation और Nitrosated यौगिकों से इसके डेरिवेटिव

Summary

यहां, हम नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उच्च संवेदनशीलता के साथ केमिलुमिनेसेंस-आधारित assays का उपयोग करके इसके जैविक रूप से प्रासंगिक डेरिवेटिव।

Abstract

विवो में नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) गतिविधि इसके प्रत्यक्ष प्रभावों के संयुक्त परिणाम हैं, NO autoxidation से उत्पन्न इसके डेरिवेटिव की कार्रवाई, और नाइट्रोसेटेड यौगिकों के प्रभाव। नो मेटाबोलाइट्स को मापना संवहनी स्तरों और अन्य ऊतकों दोनों में कोई गतिविधि का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से प्रयोगात्मक सेटिंग्स में जहां बहिर्जात NO प्रशासित किया जाता है। ओजोन-आधारित chemiluminescence assays दोनों तरल पदार्थ (प्लाज्मा, ऊतक homogenates, सेल संस्कृतियों सहित) और गैस मिश्रण (जैसे, साँस छोड़ने) में NO और NO मेटाबोलाइट्स के सटीक माप की अनुमति देते हैं। कोई भी एक उत्साहित राज्य में नाइट्रोजन डाइऑक्साइड उत्पन्न करने के लिए ओजोन के साथ प्रतिक्रिया करता है। परिणामस्वरूप प्रकाश उत्सर्जन फोटोडिटेक्शन और नमूने की कोई सामग्री को प्रतिबिंबित करने वाले एक इलेक्ट्रिक सिग्नल की पीढ़ी की अनुमति देता है। एक ही नमूने से एलीकोट का उपयोग विशिष्ट नो मेटाबोलाइट्स को मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि नाइट्रेट, नाइट्राइट, एस-नाइट्रोसोथिओल्स, और आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स। इसके अलावा, सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन द्वारा उपभोग नहीं किया जाता है, यह भी chemiluminescence विश्लेषण के साथ परिमाणित किया जाता है। इन सभी तकनीकों का एक उदाहरण प्रदान किया गया है।

Introduction

चूंकि साल्वाडोर मोनकाडा और नोबेल पुरस्कार विजेता रॉबर्ट फुर्चगोट, लुई इग्नारो और फेरीड मुराद ने नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) को पहले से ज्ञात एंडोथेलियल-व्युत्पन्न विश्राम कारक (ईडीआरएफ) के रूप में पहचाना था, इसलिए संवहनी जीव विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान, चयापचय और मेजबान प्रतिक्रिया ^{1,2,3,4,5,6,7} में फैले कई प्रमुख तंत्रों में NO की केंद्रीय भूमिका स्थापित की गई है^। . कोई गैस का बहिर्जात प्रशासन नवजात शिशु में फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप के कारण श्वसन विफलता के लिए एक स्थापित उपचार बन गया^है। नाइट्रिक ऑक्साइड गैस की भी जांच श्वसन syncytial वायरस (RSV) संक्रमण, मलेरिया और अन्य संक्रामक रोगों, ischemia-reperfusion चोट के उपचार के लिए, और कार्डियक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों में तीव्र गुर्दे की चोट की रोकथाम के लिए ^9,10,11,12. NO, इसके मेटाबोलाइट्स, और इसके लक्षित प्रोटीन और यौगिकों के स्तर का आकलन करने के लिए सटीक माप तकनीकों की आवश्यकता यांत्रिक और इंटरवेंशनल दोनों अध्ययनों से उत्पन्न होती है।

इसकी उच्च प्रतिक्रियाशीलता के कारण, NO जैविक मैट्रिक्स के आधार पर विभिन्न प्रतिक्रियाओं से गुजर सकता है जिसमें इसका उत्पादन और / या जारी किया जाता है। हीमोग्लोबिन (एचबी) या अन्य ऑक्सी-हेमोप्रोटीन की अनुपस्थिति में, NO को लगभग पूरी तरह से नाइट्राइट (NO₂^–) में ऑक्सीकरण किया जाता है।

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

N₂O₃ + H₂O → NO₂^– + H⁺

कोई भी पहले नाइट्रोजन डाइऑक्साइड (NO 2) उत्पन्न करने के लिए आणविक ऑक्सीजन (O₂) के साथ autoxidation से गुजरता है और Dinitrogen trioxide (N₂ O_{3) उत्पन्न} करने के लिए NO₂के साथ प्रतिक्रिया करता है। N₂O₃ का एक अणु पानी (H₂O) के साथ प्रतिक्रिया करता है ताकि NO₂^– और एक प्रोटॉन (H⁺)¹³ के दो अणु बन सकें। पूरे रक्त^{के भीतर 14,15}, NO और NO₂^– तेजी से नाइट्रेट (NO₃^–) में परिवर्तित हो जाते हैं क्योंकि ये अणु Hb [Hb-Fe^{2 +}-O₂ या oxyhemoglobin (oxyHb)] के ऑक्सीकृत हीम समूहों के साथ उत्साहपूर्वक प्रतिक्रिया करते ^हैं। यह प्रतिक्रिया फेरिक राज्य [Hb-Fe^{3 +} या मेथेमोग्लोबिन (metHb)] के लिए हीम समूह के संक्रमण के साथ युग्मित है:

Hb-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^–

लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) बाधा और एंडोथेलियम से तुरंत सटे स्थान इस प्रतिक्रिया को सीमित करने वाले मुख्य कारक हैं और एंडोथेलियम द्वारा जारी एनओ के एक छोटे से हिस्से को ईडीआरएफ^16,17 के रूप में कार्य करने की अनुमति देते हैं। वास्तव में, परिसंचरण में सेल-मुक्त एचबी को प्रयोगात्मक और नैदानिक सेटिंग्स^17,18 में वासोडिलेशन को बाधित करने के लिए जाना जाता है। आरबीसी के भीतर, ऑक्सीकरण और NO₂^– एकाग्रता के आधार पर, NO का एक हिस्सा लोहे-नाइट्रोसिल Hb (Hb-Fe²⁺-NO या HbNO) बनाने के लिए deoxyhemoglobin (Hb-Fe²⁺-NO या HbNO) के साथ प्रतिक्रिया करता है:

Hb-Fe²⁺ + NO → Hb-Fe²⁺-NO

आरबीसी^15,17 में, NO 2^– Hb-Fe₂+ को कम करके^{Hb-Fe 3+} बना सकता^है, जिससे NO की रिहाई होती है, जो बदले में Hb-Fe^{2 +}-O 2 (अधिमानतः) या Hb-Fe^{2 +} को बांधती है।

NO-डेरिवेटिव की पीढ़ी को सख्ती से यूनिडायरेक्शनल नहीं माना जाना चाहिए क्योंकि NO को NO₂^– और NO₃ से विभिन्न ऊतकों ^{में और} विभिन्न एंजाइमों (उदाहरण के लिए, आंतों के बैक्टीरिया द्वारा या माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर, विशेष रूप से हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत) ^19,20 से पुनर्जीवित किया जा सकता ^है।

उत्पादित (या प्रशासित) की एक चर राशि एस-नाइट्रोसोथिओल्स की डाउनस्ट्रीम पीढ़ी की ओर ले जाती है, मुख्य रूप से एन₂ओ₃ से थिओल ट्रांसनिट्रोसेशन द्वारा एक न्यूक्लियोफाइल की उपस्थिति में एक एनओ ⁺ दाता मध्यवर्ती (एनयूसी-एनओ ⁺ -एनओ₂^–):

N₂O₃ + RS^– → RS-NO + NO₂^–

एस-नाइट्रोसोथिओल्स पीढ़ी के लिए एक और संभावना ऑक्सीकरण थिओल का नाइट्रोसिलेशन है (ऑक्सीकरण थिओल के साथ प्रतिक्रिया नहीं):

RS• + NO → RS-NO

यह तंत्र और NO₂ द्वारा प्रत्यक्ष थिओल ऑक्सीकरण केवल बहुत ही विशिष्ट स्थितियों में संभव हो सकता है जो कहीं और वर्णित हैं^। एस-नाइट्रोसोथियोल एस-नाइट्रोसोग्लूटाथियोन जैसे प्रकाश अणुओं से लेकर बड़े थिओल युक्त प्रोटीन तक होते हैं। S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) का गठन β-श्रृंखला (π93C)²² में एक संरक्षित सिस्टीन अवशेषों के एक थिओल समूह के नाइट्रोसेशन द्वारा किया जाता है।

एस-नाइट्रोसोथिओल्स की पीढ़ी और चयापचय महत्वपूर्ण नियामक तंत्र का हिस्सा हैं। उदाहरणों में ग्लूटाथियोन का विनियमन, एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट (एनएमडीए), और रेयानोडीन रिसेप्टर्स ^{23,24,25,26,27,28} शामिल ^हैं। पहले विवो में नो बायोलॉजी के एक प्रमुख मध्यस्थ के रूप में माना जाता था, नाइट्रोसेटेड एल्ब्यूमिन (एस-नाइट्रोसो-एल्ब्यूमिन) किसी भी विशिष्ट अतिरिक्त जैविक गतिविधि^के बिना एक नो / एनओ ⁺ ट्रांसपोर्टर प्रतीत होता है।

एक जैविक मैट्रिक्स के भीतर एक विशिष्ट जैविक नमूने से NO और इसके डेरिवेटिव की एकाग्रता को मापते समय, अम्लता, ऑक्सीकरण, तापमान और अभिकर्मकों की उपस्थिति जैसी विशेषताओं पर विचार करना महत्वपूर्ण है। उदाहरणों में प्रशासित बहिर्जात कोई दाताओं और, तीव्र सूजन की स्थापना में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच₂ओ₂) NO₂ के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिससे पेरोक्सिनिट्रिटाइट (ONOO^–) जैसे मुक्त कणों की अलौकिक एकाग्रता की पीढ़ी होती ^है। नियोजित विश्लेषणात्मक विधि के अलावा, नमूना तैयारी और भंडारण का पूर्व-विश्लेषणात्मक चरण मौलिक है। डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाएं जो विवो NO गतिविधि का प्रतिनिधित्व नहीं करती हैं, उनकी भविष्यवाणी की जाएगी, विचार किया जाएगा, और अवरुद्ध किया जाएगा। एक वैध उदाहरण एस-एनओ-एचबी की अस्थिरता है, जब इसे माप²² के लिए लक्षित किया जाता है तो रक्त के नमूनों के एक समर्पित उपचार की आवश्यकता होती है।

Chemiluminescence-आधारित assays NO और इसके मुख्य चयापचयों के स्तर का पता लगाने के लिए सोने का मानक हैं [NO₂^–, NO₃^–, S-NO और आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स (Fe-NO)] किसी भी जैविक तरल पदार्थ में, जिसमें ऊतक होमोजेनेट्स^30,31 शामिल हैं। ये विधियां chemiluminescence डिटेक्टर (CLD) पर निर्भर करती हैं, एक उपकरण जो ओजोन (O₃) के साथ NO की प्रतिक्रिया को रखता है, जो एक उत्साहित स्थिति (NO₂•) में NO₂ उत्पन्न करता है। NO₂ की छूट • प्रकाश के एक फोटॉन के उत्सर्जन का कारण बनती है जो एक फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब द्वारा पता लगाया जाता है, जिससे एक इलेक्ट्रिक सिग्नल उत्पन्न होता है जो सीधे नमूना गैस मिश्रण³² की NO सामग्री के लिए आनुपातिक होता है। CLD की एक सरलीकृत योजनाबद्ध का प्रतिनिधित्व किया जाता है।

चित्रा 1: नाइट्रिक ऑक्साइड गैस के लिए एक chemiluminescence डिटेक्टर के सरलीकृत योजनाबद्ध. नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) का Chemiluminescence-आधारित पता लगाना प्रति NO गैस अणु प्रति एक फोटॉन की स्टोइकोमेट्रिक पीढ़ी है जिसे chemiluminescence डिटेक्टर (CLD) में पेश किया जाता है। chemiluminescence प्रतिक्रिया एक आंतरिक जनरेटर से ओजोन (O3) के साथ आपूर्ति की एक नामित कक्ष में प्राप्त की जाती है, जो एक बाहरी पंप के साथ संबंध द्वारा नकारात्मक दबाव में रखा जाता है, जिससे नमूना गैस के निरंतर और निरंतर प्रवाह की अनुमति मिलती है। ओ₃ की पीढ़ी को डायटोमिक ऑक्सीजन (ओ₂) की आवश्यकता होती है जो सीएलडी से जुड़े एक समर्पित ओ₂ टैंक द्वारा आपूर्ति की जाती है (अन्य निर्माता परिवेशी हवा के साथ संचालित सीएलडी प्रदान करते हैं)। प्रतिक्रिया कक्ष के भीतर, नमूना गैस में निहित NO गैस का प्रत्येक अणु सक्रिय अवस्था (NO₂*) में नाइट्रोजन डाइऑक्साइड के एक अणु को उत्पन्न करने के लिए ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करता है। अपनी जमीनी स्थिति में लौटकर, प्रत्येक NO₂ * अणु एक फोटॉन का उत्सर्जन करता है जो प्रतिक्रिया कक्ष के बगल में स्थित एक फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) द्वारा पता लगाया जाता है। संबंधित एम्पलीफायर और केंद्रीय प्रसंस्करण इकाई के साथ पीएमटी फोटॉन गणना और प्रतिक्रिया कक्ष में नो अणुओं की संख्या के आनुपातिक संकेत का उत्पादन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सीएलडी के नमूना इनलेट को एक ग्लासवेयर सिस्टम से जोड़ा जा सकता है जिसमें तरल नमूनों के लिए एक प्रतिक्रिया कक्ष होता है। नाइट्रोजन, हीलियम, या आर्गन जैसी अक्रिय गैस के साथ सिस्टम को लगातार शुद्ध किया जाता है, जो प्रतिक्रिया कक्ष से सीएलडी में NO को स्थानांतरित करता है। तरल-चरण नमूनों को एक समर्पित झिल्ली के माध्यम से शुद्ध पोत में इंजेक्ट किया जाता है।

चित्रा 2: नाइट्रिक ऑक्साइड गैस के chemiluminescence-आधारित पता लगाने के लिए एक शुद्ध पोत की संरचना शुद्ध पोत (दाएं) नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) गैस या किसी भी अन्य यौगिक का पता लगाने के लिए अनुमति देता है जिसे तरल चरण अभिकर्मक से जारी होने पर आसानी से NO गैस में परिवर्तित किया जा सकता है। अक्रिय गैस इनलेट एक अक्रिय गैस के स्रोत (टैंक) से जुड़ा होता है जैसे कि आर्गन, क्सीऑन, या डायटोमिक नाइट्रोजन (एन₂)। सुई वाल्व (बाईं ओर खुलता है) का उपयोग पर्ज पोत के भीतर दबाव नियंत्रण के लिए किया जाता है और पोत को साफ करने के लिए पूरी तरह से हटाया जा सकता है। इंजेक्शन पोर्ट को नमूना इंजेक्शन के लिए एक झिल्ली सेप्टम के साथ एक टोपी द्वारा कवर किया जाता है। झिल्ली को अक्सर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। एक गर्म जैकेट प्रतिक्रिया कक्ष को घेरता है और HCl परख में VCl₃ प्रदर्शन करने के लिए एक गर्म पानी के स्नान से जुड़ा हुआ है। शुद्ध पोत आउटलेट chemiluminescence डिटेक्टर (CLD) या NaOH जाल (HCl assays में VCl₃ के लिए आवश्यक) से जुड़ा हुआ है। प्रतिक्रिया कक्ष सामग्री को निकालने के लिए, पहले अक्रिय गैस इनलेट और पर्ज पोत आउटलेट पर स्टॉपकॉक्स को बंद करें, सुई वाल्व को बंद करें, इंजेक्शन पोर्ट पर टोपी को हटा दें और अंत में नाली पर स्टॉपकॉक खोलें। NaOH जाल (बाएं) शुद्ध पोत और CLD के बीच इनलाइन रखा जा करने के लिए आवश्यक है यदि HCl परख में VCl₃ HCl की corrosivity के कारण प्रदर्शन किया जाता है. CLD के लिए कनेक्शन हमेशा CLD और शुद्ध पोत (या NaOH जाल, यदि उपयोग किया जाता है) के आउटपुट के बीच रखा जा करने के लिए एक तीव्र क्षेत्र ढांकता हुआ (IFD) फिल्टर की आवश्यकता होती है। IFD फ़िल्टर हवाई कणों को हटा देता है और तरल को शुद्ध पोत से गुजरने से रोकता है। PTFE का मतलब polytetrafluoroethylene है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नतीजतन, कोई भी यौगिक जिसे एक विशिष्ट और नियंत्रित रासायनिक प्रतिक्रिया के माध्यम से NO में परिवर्तित किया जा सकता है, किसी भी जैविक तरल पदार्थ और ऊतक homogenate²⁴ में उच्च संवेदनशीलता के साथ पता लगाया जा सकता है। chemiluminescence के माध्यम से गैस चरण NO का प्रत्यक्ष माप प्रयोगात्मक और नैदानिक सेटिंग्स दोनों में किया जाता है। इन तकनीकों को बड़े पैमाने पर कहीं और ^33,34,35 वर्णित किया गया ^है। NO₂-, S-nitrosothiols, S-nitrosated proteins, और Fe-NOs का मापन ट्राइआयोडाइड (I₃^–) के साथ एक प्रतिक्रिया मिश्रण में नमूने जोड़कर किया जा सकता है, जो स्टोइकोमेट्रिक रूप से इन सभी यौगिकों से कोई गैस जारी नहीं करता है:

I₃^– → I₂ + I^–

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +2H₂O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

जबकि मैं₃^– नहीं ^3-15 के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है. प्रत्येक यौगिक के सटीक माप को अम्लीकृत सल्फानिलामाइड (एएस) के साथ या उसके बिना मर्क्युरिक क्लोराइड (एचजीसीएल₂) के साथ नमूना एलीकोट के पूर्व-उपचार द्वारा संभव बनाया जाता है। विशेष रूप से, एएस के साथ पूर्व-उपचार सभी NO₂^– सामग्री को हटा देता है। नतीजतन, सीएलडी द्वारा मापी गई कोई सामग्री केवल एस-एनओ और एफई-एनओ एकाग्रता के योग को दर्शाती है। एएस इंजेक्शन से पहले एक नमूना एलीकोट में एचजीसीएल₂ का इंजेक्शन एनओ₂^– एस-एनओ द्वारा जारी किया जाना है। एएस के साथ उपचार (NO₂^– हटाने के लिए अग्रणी) यह सुनिश्चित करता है कि मापा गया कोई सामग्री केवल Fe-NOs की एकाग्रता को दर्शाती है। आकलन के बीच घटाव की एक श्रृंखला तीन NO डेरिवेटिव²² की सटीक एकाग्रता की गणना करने की अनुमति देती है।

चित्रा 3: एसिटिक एसिड chemiluminescence परख में मैं₃ ^के लिए नमूना तैयारी में कदम. एसिटिक एसिड chemiluminescence परख में मैं₃ ^की तैयारी के लिए अनुक्रमिक कदम सचित्र हैं. प्रकाश-संरक्षित सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग आवश्यक है। ट्यूब 1, 2, और 3 परख के लिए तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक और नमूना ऐलीकोट (ट्यूब 4) HCl परख में VCl₃ के लिए आवश्यक है अगर नाइट्रेट (NO₃^–) के माप की आवश्यकता है. चरणों को लाल रंग में संख्याओं द्वारा इंगित किया जाता है। प्रीफिल (चरण 1) जैसा कि नमूना मात्रा को जोड़ने से पहले फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या एचजीसीएल₂ के साथ इंगित किया गया है। नमूना मात्रा (2) के रूप में इंगित, भंवर जोड़ें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। जोड़ें (3) PBS या अम्लीकृत सल्फानिलामाइड (AS) के रूप में संकेत दिया, भंवर, और आरटी पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। परख (4) चलाएं। परख द्वारा मापा एकाग्रता प्रत्येक ट्यूब के तहत रिपोर्ट यौगिकों की एकाग्रता का योग है. ट्यूब नंबर 1 नाइट्राइट (NO₂-), S-nitrosothiols (^S-NO), और आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स (Fe-NOs) को एक ही संकेत के रूप में मापने की अनुमति देगा। नाइट्रेट (NO₃^–) माप के लिए, नमूनों को एसिटिक एसिड में I₃^– और HCl assays में VCl₃ दोनों के साथ चलाया जाएगा, और ट्यूब 1 से प्राप्त मूल्य को ट्यूब 4 से प्राप्त एक से घटाया जाना चाहिए। * अवशिष्ट NO 2-, S-nitrosohemoglobin और ^{लौह-नाइट्रोसिल-हीमोग्लोबिन} के निर्धारण के लिए_Hb विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली मात्रा का सुझाव दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

NO₃^– माप के लिए, हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) में वैनेडियम (III) क्लोराइड (VCl₃) का उपयोग सीएलडी के साथ NO_{3- stoichiometrically} NO को मापने के लिए पर्ज पोत में NO₃^– NO के रूपांतरण के लिए किया जाता है:

2 NO₃^–+ 3V⁺³ + 2H₂O → 2NO + 3VO₂⁺ + 4H⁺

पर्याप्त रूप से तेजी से रूपांतरण प्राप्त करने के लिए, प्रतिक्रिया को 90-95 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है। NO₃ ^से NO₂ तक की कमी ^HCl द्वारा NO₂^– से NO में कमी के साथ युग्मित है। Vanadium धातु भी S-NOs को उनके NO moiety^22,36 को मुक्त करती है। एचसीएल में वीसीएल₃ के साथ सीएलडी द्वारा प्राप्त अंतिम एकाग्रता NO₃^–, NO₂, और अन्य नाइट्रोसेटेड यौगिकों की कुल एकाग्रता को दर्शाती है। मैं 3 के साथ CLD के साथ उपज एकाग्रता से बाद के मूल्य का घटाव^– NO₃^– एकाग्रता_36,37 (चित्रा³) की गणना के लिए अनुमति देता है।

कोई खपत परख में, (Z) -1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) जैसे कोई दाताओं द्वारा शुद्ध पोत में NO की निरंतर रिहाई एक स्थिर संकेत उत्पन्न करता है जो इंजेक्ट किए गए नमूनों में सेल-मुक्त ऑक्सीएचबी को परिमाणित करने की अनुमति देता है। शुद्ध पोत में खपत NO की मात्रा नमूना³⁸ में oxyHb की मात्रा के साथ एक stoichiometric संबंध में है।

NO₂-, NO₃^{-, S-nitrosothiols}, आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स, और प्लाज्मा नमूनों में सेल-मुक्त Hb द्वारा कोई खपत नहीं के माप के लिए प्रोटोकॉल सचित्र हैं। आरबीसी वातावरण में NO पर अध्ययन के लिए विशिष्ट नमूना उपचार की आवश्यकता होती है जिसके बाद बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के बाद बेहद नाजुक S-NO-Hb और Hb-NO को मापने के लिए कुल^{Hb एकाग्रता 15,22} के निर्धारण के साथ युग्मित होता है। नमूना तैयारी माप को सही करने में सहायक है। एच 2 ओ में NO₂ ^के पूर्व अस्तित्व औरNO₂ की रिहाई^– परख के दौरान इस तरह के S-NO-Hb^14,39 के रूप में कोई डेरिवेटिव के कृत्रिम रूप से उच्च सांद्रता के माप के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. नमूना तैयारी के महत्वपूर्ण पहलुओं को भी प्रस्तुत किया गया है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में इंगित की गई प्रक्रियाएं मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के समीक्षा बोर्ड के अनुसार हैं। उपयोग किए गए रक्त के नमूने पिछले अध्ययन के दौरान एकत्र किए गए थे और वर्तमान उद्देश्यके लिए ड…

Representative Results

सेल-मुक्त एचबी परख द्वारा नो-खपत का उपयोग सेल-मुक्त ऑक्सीएचबी (चित्रा 4) की ज्ञात सांद्रता वाले नमूनों में किया गया था। के रूप में oxyHb stoichiometrically परख में एक अणु जारी की एक हीम के रूप में, शुद्ध सेल मु?…

Discussion

उच्च संवेदनशीलता के कारण, NO और संबंधित यौगिकों के निर्धारण के लिए chemiluminescence-आधारित assays में NO ^{2-संदूषण} का उच्च जोखिम होता है। प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक अभिकर्मक (विशेष रूप से NO₂^– अ?…

Materials

Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL – liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL – liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL – liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g – solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g – solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g – crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software – Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% – 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g – powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g – solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g – crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump – Bundled with analyzer
Sodium Heparin – BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg – pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g – powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g – crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g – solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g – solid – Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155