Kemiluminescensbaserade analyser för detektion av kväveoxid och dess derivat från autoxidation och nitroserade föreningar

Summary

Här presenterar vi protokoll för att detektera kväveoxid och dess biologiskt relevanta derivat med hjälp av kemiluminescensbaserade analyser med hög känslighet.

Abstract

Kväveoxid (NO) aktivitet in vivo är de kombinerade resultaten av dess direkta effekter, verkan av dess derivat genererade från NO-autoxidation och effekterna av nitroserade föreningar. Mätning av NO-metaboliter är avgörande för att studera NO-aktivitet både vid vaskulära nivåer och i andra vävnader, särskilt i experimentella miljöer där exogent NO administreras. Ozonbaserade kemiluminescensanalyser möjliggör exakta mätningar av NO- och NO-metaboliter i både vätskor (inklusive plasma, vävnadshomogenater, cellkulturer) och gasblandningar (t.ex. utandad andedräkt). NO reagerar med ozon för att generera kvävedioxid i ett upphetsat tillstånd. Den därav följande ljusemissionen möjliggör fotodesektion och generering av en elektrisk signal som återspeglar NO-innehållet i provet. Alikvoter från samma prov kan användas för att mäta specifika NO-metaboliter, såsom nitrat, nitrit, S-nitrosotiolaler och järn-nitrosylkomplex. Dessutom kvantifieras NO som konsumeras av cellfritt hemoglobin också med kemiluminescensanalys. En illustration av alla dessa tekniker tillhandahålls.

Introduction

Sedan Salvador Moncada och Nobelpristagarna Robert Furchgott, Louis Ignarro och Ferid Murad identifierade kväveoxid (NO) som den tidigare kända endotel-härledda avslappningsfaktorn (EDRF), har NO: s centrala roll fastställts i flera nyckelmekanismer som spänner över hela vaskulär biologi, neurovetenskap, metabolism och värdrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Exogen administrering av NO-gas har blivit en etablerad behandling för andningssvikt på grund av pulmonell hypertension hos nyfödda⁸. Kväveoxidgas har också undersökts för behandling av respiratorisk syncytialvirusinfektion (RSV), malaria och andra infektionssjukdomar, ischemi-reperfusionsskada och för förebyggande av akut njurskada hos patienter som genomgår hjärtkirurgi 9,10,11,12. Behovet av exakta mättekniker för att bedöma nivåerna av NO, dess metaboliter och nivåerna av dess målproteiner och föreningar härrör från både mekanistiska och interventionella studier.

På grund av sin höga reaktivitet kan NO genomgå olika reaktioner beroende på den biologiska matrisen i vilken den produceras och/eller friges. I frånvaro av hemoglobin (Hb) eller andra oxihemoproteiner oxideras NO nästan helt till nitrit (_NO2^–).

2NO + O₂ →_2NO2

NO₂ + NO →_N2O3

_N2O3+_H2O→_NO2^– + H ⁺

NO genomgår först autoxidation med molekylärt syre (_O2) för att ge kvävedioxid (_NO2) och reagerar med NO₂ själv för att generera dikvävetrioxid (_N2O3). En molekyl av_N2O3reagerar med vatten (_H2O) för att bilda två molekyler av NO₂^– och en proton (H⁺)¹³. Inom helblod^{omvandlas 14,15}, NO och NO₂^– snabbt till nitrat (NO₃^–) eftersom dessa molekyler reagerar ivrigt med de oxiderade hemgrupperna av Hb [Hb-Fe²⁺–_O2 eller oxyhemoglobin (oxyHb)] för att ge NO ₃^–. Denna reaktion är kopplad till övergången av hemgruppen till järntillståndet [Hb-Fe³⁺ eller methemoglobin (metHb)]:

Hb-Fe²⁺–_O2 + INGEN → Hb-Fe³⁺ + NO₃^–

Barriären för röda blodkroppar (RBC) och utrymmet omedelbart intill endotelet är de viktigaste faktorerna som begränsar denna reaktion och tillåter en liten del av NO som frigörs av endotelet att fungera som EDRF^16,17. Faktum är att cellfritt Hb i cirkulationen är känt för att störa vasodilatation i experimentella och kliniska miljöer^17,18. Inom RBC, beroende på syresättning och NO ^{2-koncentration}, reagerar en del av NO med deoxihemoglobin (Hb-Fe²⁺) för att bilda järn-nitrosyl Hb (Hb-Fe²⁺-NO eller HbNO):

Hb-Fe²⁺ + INGEN → Hb-Fe²⁺-NO

I RBC^15,17 kan NO₂^– bilda Hb-Fe³⁺ genom att reducera Hb-Fe²⁺ vilket leder till frisättning av NO, vilket i sin tur binder Hb-Fe²⁺–_O2 (företrädesvis) eller Hb-Fe²⁺.

Genereringen av NO-derivat bör inte betraktas som strikt enkelriktad eftersom NO kan regenereras från NO₂^– och_NO3^– i olika vävnader och av olika enzymer (t.ex. av tarmbakterier eller inom mitokondrier, särskilt under hypoxiska förhållanden)^19,20.

En varierande mängd NO som produceras (eller administreras) leder till nedströms generering av S-nitrosotioler, huvudsakligen genom tioltransnitrosation från_N2O3i närvaro av en nukleofil som skapar en NO⁺ givarmediär (Nuc-NO⁺-NO₂^–):

_N2O3+ RS^– → RS-NO + NO ₂^–

En annan möjlighet för S-nitrosotioler generering är nitrosylering av oxiderade tioler (NO reagerar med en oxiderad tiol):

RS• + INGEN → RS-NO

Denna mekanism och direkt tioloxidation med NO₂ kan vara möjlig endast under mycket specifika förhållanden som beskrivs någon annanstans²¹. S-nitrosotioler sträcker sig från ljusmolekyler som S-nitrosoglutation till stora tiolhaltiga proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) bildas genom nitrosering av en tiolgrupp av en konserverad cysteinrest i β-chain (β93C)²².

Genereringen och metabolismen av S-nitrosotiolaler är en del av viktiga regleringsmekanismer. Exempel inkluderar reglering av glutation, kaspaser, N-metyl-D-aspartat (NMDA) och ryanodinreceptorer 23,24,25,26,27,28. Nitroserat albumin (S-nitroso-albumin) har tidigare betraktats som en viktig medlare av NO-biologi in vivo och verkar vara en NO/NO⁺-transportör utan någon specifik ytterligare biologisk aktivitet²⁹.

Vid mätning av koncentrationen av NO och dess derivat från ett specifikt biologiskt prov inom en biologisk matris är det viktigt att överväga egenskaper som surhet, syresättning, temperatur och närvaron av reagenser. Exempel inkluderar administrerade exogena NO-givare och, vid inställning av akut inflammation, väteperoxid (_H2O2) som reagerar med NO₂ vilket leder till generering av supernormal koncentration av fria radikaler som peroxinitrit (ONOO^–)²¹. Förutom den analysmetod som används är den preanalytiska fasen av provberedning och lagring grundläggande. Reaktioner nedströms som inte representerar in vivo NO-aktiviteten ska förutsägas, beaktas och blockeras. Ett giltigt exempel är instabiliteten hos S-NO-Hb, som kräver en särskild behandling av blodprover när den är avsedd för mätning²².

Kemiluminescensbaserade analyser är guldstandarden för att detektera nivåerna av NO och dess huvudmetaboliter [NO 2^–,_NO3^{-, S-NO} och järn-nitrosylkomplex (Fe-NO)] i någon biologisk vätska, inklusive vävnadshomogenater ^30,31. Dessa metoder bygger på kemiluminescensdetektorn (CLD), en anordning som rymmer reaktionen av NO med ozon (_O3), vilket genererar NO₂ i ett exciterat tillstånd (NO₂•). Avslappning av NO₂• orsakar utsläpp av en foton av ljus som detekteras av ett fotomultiplikerarrör, vilket genererar en elektrisk signal som är direkt proportionell mot NO-halten i den samplade gasblandningen³². Ett förenklat schema över CLD representeras.

Figur 1: Förenklat schema över en kemiluminescensdetektor för kväveoxidgas. Kemiluminescensbaserad detektion av kväveoxid (NO) är den stökiometriska generationen av en foton per NO-gasmolekyl som införs i kemiluminescensdetektorn (CLD). Kemiluminescensreaktionen erhålles i en utsedd kammare försedd med ozon (O3) från en intern generator, som hålls vid undertryck genom anslutning till en extern pump, vilket möjliggör kontinuerligt och konstant inflöde av provgas. Genereringen av_O3 kräver diatomiskt syre (_O2) som levereras av en dedikerad_O2-tank ansluten till CLD (andra tillverkare tillhandahåller CLD som arbetar med omgivande luft). Inom reaktionskammaren reagerar varje molekyl av NO-gas som finns i den provterade gasen med syre för att ge en molekyl kvävedioxid i aktiverat tillstånd (_NO2*). Genom att återgå till sitt marktillstånd avger varje_NO2*-molekyl en foton som detekteras av ett fotomultiplikorrör (PMT) som ligger intill reaktionskammaren. PMT med tillhörande förstärkare och centralprocessor producerar en signal som är proportionell mot fotontalet och antalet NO-molekyler i reaktionskammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.

CLD:s provingringsprov kan anslutas till ett glassystem som innehåller en reaktionskammare för vätskeprover. Systemet rensas kontinuerligt med en inert gas såsom kväve, helium eller argon, vilket överför NO från reaktionskammaren till CLD. Vätskefasprover injiceras genom ett dedikerat membran i reningskärlet.

Figur 2: Struktur av ett reningskärl för kemiluminescensbaserad detektion av kväveoxidgas Reningskärlet (höger) möjliggör detektion av kväveoxid (NO) gas eller någon annan förening som lätt kan omvandlas till INGEN gas när den frigörs från ett vätskefasreagens. Det inerta gasinloppet är anslutet till en källa (tank) till en inert gas såsom Argon, Xeon eller diatomiskt kväve (_N2). Nålventilen (öppnas till vänster) används för tryckreglering i reningskärlet och kan tas bort helt för att rengöra kärlet. Injektionsporten är täckt av ett lock med ett membranseptum för provinjektion. Membranet bör bytas ut ofta. En uppvärmd mantel omger reaktionskammaren och är ansluten till ett varmvattenbad för att utföra VCl₃ i HCl-analysen. Reningskärlets utlopp är anslutet till kemiluminescensdetektorn (CLD) eller till NaOH-fällan (krävs för VCl₃ i HCl-analyser). För att tömma reaktionskammarens innehåll, stäng först stoppkranarna vid det inerta gasinloppet och rensningskärlets utlopp, stäng nålventilen, ta bort locket vid injektionsporten och öppna slutligen stoppkranen vid avloppet. NaOH-fällan (vänster) måste placeras inline mellan reningskärlet och CLD om VCl₃ i HCl-analysen utförs på grund av frätandet av HCl. Anslutningen till CLD kräver alltid att ett intensivt fältdielektriskt (IFD) filter placeras mellan CLD och utgången från rensningskärlet (eller NaOH-fällan, om den används). IFD-filtret tar bort luftburna partiklar och hindrar vätska från att passera genom reningskärlet. PTFE = polytetrafluoretylen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Som en konsekvens kan varje förening som kan omvandlas till NO genom en specifik och kontrollerad kemisk reaktion detekteras med hög känslighet i vilken biologisk vätska och vävnadshomogenat som helst²⁴. Direkt mätning av gasfas NO genom kemiluminescens utförs i både experimentella och kliniska miljöer. Dessa tekniker beskrivs utförligt någon annanstans 33,34,35. Mätning av NO₂^–, S-nitrosotioler, S-nitroserade proteiner och Fe-NOs kan utföras genom tillsats av prover i en reaktionsblandning med trijodid (I₃^–), som stökiometriskt frigör INGEN gas från alla dessa föreningar:

I₃^– → I₂ + I^–

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO +_I2 +2H2O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

medan jag₃^– inte reagerar med NO ^3-15. Exakta mätningar av varje förening möjliggörs genom förbehandling av provalikvoter med surgjord sulfanilamid (AS) med eller utan kvicksilverklorid (_HgCl2). Specifikt tar förbehandling med AS bort allt NO ^2-innehåll. Till följd av detta återspeglar NO-halten mätt med CLD endast summan av koncentrationen av S-NOs och Fe-NOs. Injektion av_HgCl2 i ett prov alikvot före AS-injektion orsakar att NO₂^– frigörs av S-NO. Behandling med AS (vilket leder ^{till borttagning av} NO₂) säkerställer att den uppmätta NO-halten endast återspeglar koncentrationen av Fe-NO. En serie subtraktioner mellan bedömningarna gör det möjligt att beräkna den exakta koncentrationen av de tre NO-derivaten²².

Figur 3: Steg i provberedningen för I₃^– i ättiksyrakemiluminiscensanalysen. De sekventiella stegen för framställning av I₃^– i ättiksyrakemiluminiscensanalys illustreras. Användning av ljusskyddade centrifugrör krävs. Rör 1, 2 och 3 är de som används för att förbereda sig för analysen. En annan provalimit (rör 4) behövs för_VCl3 i ^HCl-analysen om mätning av nitrat (_NO3-) krävs. Steg indikeras med siffror i rött. Förfyllning (steg 1) enligt vad som anges med fosfatbuffertsaltlösning (PBS) eller_HgCl2 innan provvolymen tillsätts. Tillsätt provvolymen (2) enligt anvisningarna, virvel och inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur (RT). Tillsätt (3) PBS eller surgjord sulfanilamid (AS) enligt anvisningarna, virvel och inkubera i 3 min vid RT. Kör analysen (4). Den koncentration som mäts med analysen är summan av koncentrationen av de föreningar som rapporterats under varje rör. Rör nummer 1 möjliggör mätningar av nitrit (NO₂^–), S-nitrosotiolaler (S-NO) och järn-nitrosylkomplex (Fe-NOs) som en enda signal. För nitratmätning (NO₃-) ska proverna köras med både I ^3-i ättiksyra och _VCl3 i ^HCl-analyser, och det värde som erhålls från rör 1 ska subtraheras från det som erhålls från rör 4. *föreslagna kvantiteter som ska användas för Hb-analys för bestämning av kvarvarande NO₂^–, S-nitrosohemoglobin och järn-nitrosyl-hemoglobin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För NO ^3-mätning används vanadin (III)klorid (_VCl3) i saltsyra (HCl) för omvandling av NO₃^– till NO i reningskärlet för att mäta NO ^{3-stökiometriskt} med CLD:

2 NO₃^–+ 3V ^{+ 3} + 2H2 O → 2NO+ 3VO₂⁺ + 4H⁺

För att uppnå en tillräckligt snabb omvandling måste reaktionen utföras vid 90-95 °C. Reduktion från NO₃^– till NO₂^– är kopplad till reduktion av NO₂^– till NO med HCl. Vanadinmetall minskar också S-NOs som frigör sin NO-del^22,36. Den slutliga koncentrationen erhållen genom CLD med_VCl3 i HCl återspeglar den aggregerade koncentrationen av_NO3^–,_NO2– och andra nitroserade föreningar. Subtraktion av det senare värdet från den koncentration som avges med CLD med I₃^– möjliggör beräkning av NO ^{3-koncentration 36,37} (figur 3).

I NO-konsumtionsanalysen genererar den kontinuerliga frisättningen av NO i reningskärlet av NO-givare som (Z)-1-[2-(2-aminoetyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) en stabil signal som möjliggör kvantifiering av cellfri oxyHb i de injicerade proverna. Mängden NO som konsumeras i reningskärlet är i ett stökiometriskt förhållande till mängden oxyHb i provet³⁸.

Protokoll för mätning av NO₂^–,_NO3^–, S-nitrosotiolaler, järn-nitrosylkomplex och NO-konsumtion med cellfritt Hb i plasmaprover illustreras. Studier av NO i RBC-miljön kräver specifik provbehandling följt av uteslutningskromatografi för att mäta extremt ömtålig S-NO-Hb och Hb-NO i kombination med bestämning av total Hb-koncentration^15,22. Provberedning är avgörande för att korrigera mätningen. Förekomst av NO₂^– i_H2Ooch frisättning av NO₂^– under analysen kan leda till mätning av artificiellt högre koncentrationer av NO-derivat såsom S-NO-Hb^14,39. Viktiga aspekter av provberedning presenteras också.

Protocol

De förfaranden som anges i detta protokoll är i enlighet med granskningsnämnden för Massachusetts General Hospital. De blodprover som användes hade samlats in under en tidigare studie och avidentifierats för det aktuella ändamålet18. OBS: Se tillverkarens instruktioner för specifik vägledning om optimala anslutningar mellan slangar och glas som utgör reningskärlet, tvätt och allmänt underhåll. Anslutningarna måste vara fasta och noggrant gjorda för att …

Representative Results

NO-förbrukningen genom cellfri Hb-analys användes i prover innehållande kända koncentrationer av cellfri oxyHb (figur 4). Eftersom ett hem av oxyHb stökiometriskt frigör en NO-molekyl i analysen används renad cellfri oxyHb för att bygga kalibreringskurvan för analysen (kompletterande figur 3). Dos-responsförhållandet mellan cellfritt Hb (mätt med en kolorimetrisk analys) och INGEN konsumtion hos patienter som kommer från kardiopulmone…

Discussion

På grund av den höga känsligheten har kemiluminescensbaserade analyser för bestämning av NO och besläktade föreningar en hög risk för NO ^{2-kontaminering}. Varje reagens (särskilt NO ^{2-blockerande} lösning) och spädningsmedel (inklusive ddH2O) som används i experimentet bör testas för dess NO ^2-innehåll för att korrigera för bakgrundssignal. Nitrit är extremt reaktivt med en halveringstid i helblod runt 10 min och genererar snabb…

Materials

Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL – liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL – liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL – liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g – solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g – solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g – crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software – Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% – 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g – powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g – solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g – crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump – Bundled with analyzer
Sodium Heparin – BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg – pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g – powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g – crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g – solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g – solid – Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155