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Biochemistry

सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम स्थिर ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63118
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

Summary

प्रोटोकॉल सेल झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (सीएमएसी) कॉलम की तैयारी का वर्णन करता है जिसमें कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी प्रोटीन युक्त स्थिर सेल झिल्ली टुकड़े होते हैं। इन रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान में सीएमएसी कॉलम का उपयोग और जटिल प्राकृतिक मिश्रण में मौजूद भी समझाया गया है।

Abstract

पौधों, कवक, बैक्टीरिया और समुद्री अकशेरुकी द्वारा संश्लेषित रसायन नई दवा हिट और लीड का एक समृद्ध स्रोत रहे हैं। आमतौर पर चिकित्सा पद्धति में उपयोग की जाने वाली स्टेटिन, पेनिसिलिन, पैक्लिटैक्सेल, रैपामाइसिन, या आर्टेमिसिनिन जैसी दवाओं को पहले प्राकृतिक उत्पादों से पहचाना और अलग किया गया है। हालांकि, प्राकृतिक स्रोतों से जैविक रूप से सक्रिय विशेष मेटाबोलाइट्स की पहचान और अलगाव एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली प्रक्रिया है। परंपरागत रूप से, बायोमास के निष्कर्षण के बाद, व्यक्तिगत चयापचयों को जटिल मिश्रण से अलग और शुद्ध किया जाता है। इसके बाद, पृथक अणुओं को उनकी जैविक गतिविधि को सत्यापित करने के लिए कार्यात्मक परख में परीक्षण किया जाता है। यहां हम जटिल मिश्रण से सीधे जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान करने के लिए सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (सीएमएसी) कॉलम का उपयोग प्रस्तुत करते हैं। सीएमएसी कॉलम अपने मूल फॉस्फोलिपिड बाइलेयर वातावरण में एम्बेडेड स्थिर कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन (टीएमपी) के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। यह एक लक्षित दृष्टिकोण है, जिसके लिए टीएमपी को जानने की आवश्यकता होती है जिसकी गतिविधि एक नए पहचाने गए छोटे अणु दवा उम्मीदवार के साथ संशोधित करने का इरादा रखती है। इस प्रोटोकॉल में, हम स्थिर ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी (टीआरकेबी) के साथ सीएमएसी कॉलम तैयार करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जो कई तंत्रिका तंत्र विकारों के लिए दवा की खोज के लिए एक व्यवहार्य लक्ष्य के रूप में उभरा है। इस लेख में, हम न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों का उपयोग करके स्थिर टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ सीएमएसी कॉलम को इकट्ठा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो टीआरकेबी रिसेप्टर्स को अतिरंजित करते हैं। हम आगे कॉलम की कार्यक्षमता और टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान में इसके उपयोग की जांच करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

वनस्पति मिश्रण औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों1 में समृद्ध हैं, जो नई दवा हिट की पहचान के लिए एक अच्छे स्रोत के रूप में कार्य करते हैं और 2,3,4,5 की ओर जाता है। प्राकृतिक उत्पादों से नई दवाओं की खोज एक उपयोगी दृष्टिकोण रही है और वर्तमान में अनुमोदित कई दवाएं प्रकृति में पहली बार पहचाने गए यौगिकों से उत्पन्न हुई हैं। प्राकृतिक यौगिकों की रासायनिक विविधता रासायनिक रूप से संश्लेषित अणुओं के मानव निर्मित पुस्तकालयों द्वारा मिलान करना मुश्किल है। कई प्राकृतिक यौगिक मानव प्रोटीन लक्ष्यों के साथ बातचीत करते हैं और संशोधित करते हैं और उन्हें विकासवादी रूप से अनुकूलित दवा जैसे अणुओं 6 माना जा सकताहै। ये प्राकृतिक यौगिक न्यूरोलॉजिकल विकारों6 में उपयोग करने के लिए दवा के नेतृत्व की पहचान के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं। अल्जाइमर रोग (एडी) के प्रबंधन के लिए वर्तमान में एफडीए-अनुमोदित दवाओं में से दो प्राकृतिक अल्कलॉइड से प्राप्त होती हैं, अर्थात्: गैलेंटामाइन और रिवेस्टिग्माइन (फिसोस्टिग्माइन का व्युत्पन्न) 6। एल-डीओपीए, वर्तमान में पार्किंसंस रोग के लिए सबसे अधिक निर्धारित दवा है, को पहली बार व्यापक बीन (विसिया फाबा एल) से पहचाना गया था। 7. पर्गोलाइड और लिसुराइड, डोपामिनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट परजीवी कवक क्लैविसेप्स पुरपुरिया8 से प्राकृतिक एर्गोट एल्कलॉइड के डेरिवेटिव हैं। रेसरपिन, भारतीय स्नेकरूट से अलग एक एल्कलॉइड (राउवोल्फिया सर्पेंटिना (एल) बेंथ पूर्व कुर्ज़) पहली एंटीसाइकोटिक दवाओं में से एक था। हाल ही में, डिस्रेगुलेटेड प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रणालीगत सूजन को कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के विकास से जोड़ा गया है, जैसे कि प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार या न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग10। अन्य जीवनशैली हस्तक्षेपों के साथ एक पौधे आधारित आहार बुजुर्गों में संज्ञानात्मक और कार्यात्मक क्षमताओं में सुधार करने के लिए पाया गया है 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . ट्राइटरपेन्स और पॉलीफेनोल से संबंधित कुछ इलेक्ट्रोफिलिक अणुओं को इन विट्रो और विवो मॉडल12 दोनों में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को संशोधित करने के लिए पाया गया है। उदाहरण के लिए, α, β-असंतृप्त कार्बोनिल (उदाहरण के लिए, कर्क्यूमिन, सिनामाल्डिहाइड), या आइसोथियोसाइनेट समूह (उदाहरण के लिए, सल्फोराफेन) युक्त प्राकृतिक यौगिक टोल-जैसे रिसेप्टर -4 (टीएलआर 4) डिमराइजेशन के साथ हस्तक्षेप करते हैं जो एक मूत्र इंटरल्यूकिन -3 निर्भर प्रो-बी सेल लाइन12,22 में प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के डाउनस्ट्रीम संश्लेषण को बाधित करते हैं . महामारी विज्ञान के साक्ष्य दृढ़ता से इंगित करते हैं कि जटिल खाद्य मैट्रिक्स में मौजूद आहार फाइटोकेमिकल्स, नई दवा लीड6 का एक व्यवहार्य स्रोत भी बना सकते हैं।

पौधे आधारित भोजन सहित पौधों के अर्क में मौजूद जैविक रूप से सक्रिय अणुओं की पहचान में प्रमुख बाधाओं में से एक जांच किए गए नमूनों की जटिलता है। परंपरागत रूप से, व्यक्तिगत यौगिकों को अलग किया जाता है, शुद्ध किया जाता है, और बाद में जैविक गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाता है। यह दृष्टिकोण आमतौर पर सबसे प्रचुर मात्रा में और अच्छी तरह से विशेषता वाले यौगिकों की पहचान की ओर जाता है। एक परिभाषित आणविक लक्ष्य के बिना फेनोटाइपिक दवा खोज दृष्टिकोण जटिल मिश्रण23 के जैव-निर्देशित-विभाजन पर निर्भर करते हैं। इस दृष्टिकोण में, एक अर्क को कम जटिल उप-अंशों में विभाजित किया जाता है जिन्हें बाद में फेनोटाइपिक परख में परीक्षण किया जाता है। अलगाव और सक्रिय यौगिकों की शुद्धि परख में सत्यापित जैविक गतिविधि द्वारा निर्देशित कर रहे हैं। एक निर्दिष्ट दवा लक्ष्य की पहचान का ज्ञान जटिल मिश्रण में मौजूद औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान को काफी तेज कर सकता है। वे दृष्टिकोण आमतौर पर आणविक लक्ष्य के स्थिरीकरण पर आधारित होते हैं, उदाहरण के लिए, एक एंजाइम, एक ठोस सतह पर, चुंबकीय मोती23 की तरह। स्थिर लक्ष्यों का उपयोग बाद में स्क्रीनिंग प्रयोगों में किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप लक्ष्य के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों का अलगाव होता है। जबकि साइटोसोलिक प्रोटीन को लक्षित करने वाले यौगिकों की पहचान में इस दृष्टिकोण का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, यह आमतौर पर ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन (टीएमपी) 23 के साथ बातचीत करने वाले रसायनों की पहचान में कम लागू किया गया है। टीएमपी के स्थिरीकरण में एक अतिरिक्त चुनौती इस तथ्य से उपजी है कि प्रोटीन की गतिविधि सेल झिल्ली फॉस्फोलिपिड्स और बिलेयर में अन्य अणुओं जैसे कोलेस्ट्रॉल23,24 के साथ इसकी बातचीत पर निर्भर करती है। ट्रांसमेम्ब्रेन लक्ष्य को स्थिर करने का प्रयास करते समय प्रोटीन और उनके मूल फॉस्फोलिपिड बाइलेयर वातावरण के बीच इन सूक्ष्म बातचीत को संरक्षित करना महत्वपूर्ण है।

सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (सीएमएसी) कोशिका झिल्ली टुकड़े में, और शुद्ध प्रोटीन नहीं, कृत्रिम झिल्ली (आईएएम) स्थिर चरणकणों 23 पर स्थिर हैं। आईएएम स्थिर चरणों को सिलिका पर सहसंयोजक रूप से बंधन फॉस्फेटिडाइलकोलाइन एनालॉगद्वारा तैयार किया जाता है। हाल ही में आईएएम स्थिर चरणों के उपन्यास वर्ग विकसित किए गए हैं जिसमें मुफ्त अमीन और सिलानोल समूहों को अंत-कैप्ड (आईएएम) किया गया है। पीसी। डीडी 2 कण)। सीएमएसी कॉलम तैयारी के दौरान सेल झिल्ली के टुकड़े सोखना के माध्यम से आईएएम कणों की सतह पर स्थिर होते हैं।

सीएमएसी कॉलम का उपयोग आयन चैनलों (जैसे, निकोटिनिक रिसेप्टर्स), जीपीसीआर (जैसे, ओपियोइड रिसेप्टर्स), प्रोटीन ट्रांसपोर्टर्स (जैसे, पी-ग्लाइकोप्रोटीन), आदि सहित टीएमपी के विभिन्न वर्गों को स्थिर करने के लिए किया गया है। स्थिर प्रोटीन लक्ष्यों का उपयोग फार्माकोडायनामिक्स (जैसे, पृथक्करण स्थिरांक, केडी) के लक्षण वर्णन में किया गया है या लक्ष्य के साथ बातचीत करने वाले छोटे अणु लिगैंडों के बाध्यकारी कैनेटीक्स (केऑन और केऑफ) का निर्धारण करने के साथ-साथ जटिल मैट्रिक्स 24 में मौजूद संभावित नई दवा लीड की पहचान की प्रक्रिया में किया गयाहै। . यहां हम स्थिर ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी (टीआरकेबी) के साथ सीएमएसी कॉलम की तैयारी प्रस्तुत करते हैं, जो कई तंत्रिका तंत्र विकारों के लिए दवा की खोज के लिए एक व्यवहार्य लक्ष्य के रूप में उभरा है।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ) / टीआरकेबी मार्ग की सक्रियता कुछ न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में सुधार के साथ जुड़ी हुई है, जैसे कि एडी या प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार 25,26,27,28। यह बताया गया था कि बीडीएनएफ स्तर और इसके रिसेप्टर टीआरकेबी अभिव्यक्ति एडी में कम हो जाती है, और इसी तरह की कटौती एडी29 के पशु मॉडल में हिप्पोकैम्पल फ़ंक्शन को खराब करती है। एडी रोगियों30,31,32 के सीरम और मस्तिष्क में बीडीएनएफ के कम स्तर की सूचना दी गई थी। ताऊ अतिअभिव्यक्ति या हाइपरफॉस्फोराइलेशन को प्राथमिक न्यूरॉन्स और एडी पशु मॉडल33,34,35 में बीडीएनएफ अभिव्यक्ति को कम करने के लिए पाया गया था। इसके अतिरिक्त, बीडीएनएफ को इन विट्रो और विवो36 में β-अमाइलॉइड प्रेरित न्यूरोटॉक्सिसिटी पर सुरक्षात्मक प्रभाव होने की सूचना दी गई थी। चूहे के मस्तिष्क में प्रत्यक्ष बीडीएनएफ प्रशासन संज्ञानात्मक रूप से बिगड़ा हुआ जानवरों37 में सीखने और स्मृति को बढ़ाने के लिए दिखाया गया था। बीडीएनएफ / टीआरकेबी एडी28,38 सहित न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों को सुधारने के लिए एक वैध लक्ष्य के रूप में उभरा। एडी में उपचार के विकास के लिए बीडीएनएफ / टीआरकेबी सिग्नलिंग मार्ग को लक्षित करना संभावित रूप से बीमारी39 की हमारी समझ को बढ़ाएगा। दुर्भाग्य से, बीडीएनएफ को अपने खराब फार्माकोकाइनेटिक गुणों और प्रतिकूलदुष्प्रभावों 40 के कारण उपचार के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है। बीडीएनएफ मार्गों के छोटे अणु उत्प्रेरकों को संभावित टीआरकेबी लिगैंड41,42,43 के रूप में खोजा गया है। परीक्षण किए गए छोटे अणु एगोनिस्टों में, 7,8-डाइहाइड्रॉक्सीफ्लेवोन (7,8-डीएचएफ), को बीडीएनएफ / टीआरकेबी मार्ग 41,44,45,46 को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है। 7,8-डीएचएफ (आर 13; 4-ऑक्सो-2-फिनाइल-4 एच-क्रोमेन -7,8-डायल बिस (मिथाइलकार्बामेट)) का व्युत्पन्न वर्तमान में एडी47 के लिए संभावित दवा के रूप में विचाराधीन है। हाल ही में, यह दिखाया गया था कि कई एंटीडिपेंटेंट्स टीआरकेबी को सीधे बाध्यकारी और बीडीएनएफ सिग्नलिंग को बढ़ावा देने के माध्यम से काम करते हैं, आगे विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों48 के इलाज के लिए एक वैध लक्ष्य के रूप में टीआरकेबी का पीछा करने के महत्व पर जोर देते हैं।

प्रोटोकॉल कार्यात्मक टीआरकेबी कॉलम और टीआरकेबी-नल नकारात्मक नियंत्रण कॉलम को इकट्ठा करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। स्तंभों को एक ज्ञात प्राकृतिक उत्पाद छोटे-आणविक लिगैंड का उपयोग करके विशेषता है: 7,8-डीएचएफ। इसके अतिरिक्त, हम टीआरकेबी के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों की पहचान के लिए, एक उदाहरण के रूप में पौधे निकालने का उपयोग करके जटिल मैट्रिक्स की स्क्रीनिंग की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।

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Protocol

1. एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं की सेल संस्कृति (टीआरकेबी और टीआरकेबी-नल (माता-पिता) सेल लाइनों)

नोट: सेल लाइनों (एसएच-एसवाई 5 वाई सेल लाइन (टीआरकेबी, बीआर 6) और एसएच-एसवाई 5 वाई पेरेंटल सेल लाइन (टीआरकेबी नल)) 49,50 को केराफास्ट से खरीदा गया था। सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग सीएमएसी कॉलम की तैयारी के लिए स्थिर होने के लिए ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर्स के स्रोत के रूप में किया जाता है। निम्नलिखित चरणों का वर्णन कैसे सेल झिल्ली टुकड़े प्राप्त करने के लिए और कार्यात्मक सीएमएसी कॉलम इकट्ठा करने के लिए।

  1. आरपीएमआई मीडिया के 450 एमएल, एफबीएस के 50 एमएल, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के 5 एमएल, और 5% सीओ2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 150 मिमी सेल संस्कृति पकवान में जेनेटिसिन (जी 418) के 0.3 मिलीग्राम / एमएल मिश्रण द्वारा तैयार सेल संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को बढ़ाएं।

2. सेल कटाई

  1. माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल कन्फ्लुएंसी (80% -90%) की पुष्टि करें, सेल पासिंग के बाद 3-4 दिनों के बाद पहुंच गया।
  2. कोशिकाओं के ऊपर से एस्पिरेट सेल संस्कृति माध्यम और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, 1 एक्स, पीएच 7.4) के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। पीबीएस निकालें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए कम केंद्रित ट्रिप्सिन (0.25%) के 2 एमएल जोड़ें।
  3. धीरे-धीरे ट्रिप्सिन समाधान के साथ सभी कोशिकाओं को समान रूप से कवर करने के लिए प्लेट को घुमाएं और 5% सीओ 2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग2 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। कोशिकाओं को अलग करने के लिए सेल संस्कृति माध्यम के 8 एमएल जोड़ें और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अलग कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें।
  4. कोशिकाओं की संख्या (लगभग 3 x 107 कोशिकाओं) का अनुमान लगाने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें। मिश्रण में भी सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके सेल निलंबन मिलाएं। कवरस्लिप के तहत सेल निलंबन के 10 μL रखें और 40x उद्देश्य का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की गणना करें।

3. सेल होमोजिनाइजेशन

  1. निम्नलिखित प्रोटीज अवरोधकों के स्टॉक समाधान तैयार करें: बेंजामिडाइन (200 एमएम), फेनिलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ, 10 एमएम), और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल (100 एक्स एकाग्रता) जिसमें 4- (2-एमिनोइथाइल) बेंजीनसल्फोनिल फ्लोराइड हाइड्रोक्लोराइड (एईबीएसएफ), एप्रोटिनिन, बेस्टेटिन और ल्यूपेप्टिन शामिल हैं।
    चेतावनी: पीएमएसएफ को केवल धूआं हुड के अंदर संभाला जाना चाहिए।
    1. अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी के 5 एमएल में 120 मिलीग्राम बेंजामिडाइन को भंग करके बेंजामिडाइन स्टॉक समाधान (200 एमएम) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और एक दिन के भीतर उपयोग करें। प्रत्येक उपयोग (अनुशंसित) से पहले ताजा समाधान तैयार करें।
    2. इथेनॉल के 10 एमएल में पीएमएसएफ के 0.017 ग्राम को भंग करके पीएमएसएफ स्टॉक समाधान (10 एमएम) तैयार करें। - 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी के 1 एमएल में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीज अवरोधक मिश्रण को भंग करके प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (100 एक्स) तैयार करें। कॉकटेल के अच्छी तरह से और विभाज्य 200-300 μL मिलाएं और उपयोग से पहले - 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. विआयनीकृत अल्ट्राप्योर पानी के 1 एमएल में एटीपी डिसोडियम नमक हाइड्रेट के 55.114 मिलीग्राम को भंग करके एटीपी स्टॉक समाधान (100 एमएम) तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं और मिश्रण के 100 μL को विभाज्य करें और उपयोग करने से पहले - 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 3.03 ग्राम ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमिथाइल) एमिनोमेथेन हाइड्रोक्लोराइड (ट्रिस-एचसीएल, 50 एमएम), सोडियम क्लोराइड के 2.9 ग्राम (एनएसीएल, 100 एमएम), कैल्शियम क्लोराइड निर्जल (सीएसीएल 2, 3 एमएम) के 0.22 ग्राम, मैग्नीशियम क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट (एमजीसीएल 2, 2 एमएम) के 0.2 ग्राम और पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल, 5 एमएम) के 0.1 9 को भंग करके बफर तैयार करें।
  4. बेंजामिडाइन स्टॉक समाधान के 0.3 एमएल (3 एमएम), पीएमएसएफ स्टॉक समाधान के 0.2 एमएल (0.1 एमएम), प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल मिश्रण के 0.2 एमएल, एटीपी स्टॉक समाधान के 20 μL (100 μM), ग्लिसरॉल के 2 एमएल (100%) और ईडीटीए के 0.029 ग्राम (5 एमएम) के साथ चरण 3.3 में तैयार बफर के 17.3 एमएल को मिलाकर समरूपीकरण बफर तैयार करें, और ईडीटीए के 0.029 ग्राम (5 एमएम) के साथ। हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान का उपयोग करके पीएच को 7.4 तक समायोजित करें।
  5. 400 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर चरण 2.3 में काटा कोशिकाओं को स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और बर्फ-ठंडे पीबीएस (1 एक्स, पीएच 7.4) के 10 एमएल के साथ शेष सेल गोली धो लें। 400 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से कोशिकाओं को स्पिन करें।
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और इसे चरण 3.4 में तैयार होमोजिनाइजेशन बफर के 20 एमएल के साथ बदलें। शंक्वाकार ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  7. सेल निलंबन को 40 मिलीलीटर डोंस होमोजेनाइज़र ऊतक चक्की में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें। 40 अप-एंड-डाउन मूसल स्ट्रोक का उपयोग करके बर्फ पर मैन्युअल रूप से निलंबन को समरूप करें। एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में होमोजेनाइज्ड सेल निलंबन को स्थानांतरित करें।
  8. 400 एक्स जी पर 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर होमोजेनेट को अपकेंद्रित्र करें। गोली त्यागें और सतह पर तैरनेवाला को एक नई शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 47900 एक्स जी पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें। कोशिका झिल्ली गोली को बचाने के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।

4. कोशिका झिल्ली घुलनशीलता

  1. पीएमएसएफ स्टॉक समाधान के 0.1 एमएल (0.1 एमएम), बेंजामिडाइन स्टॉक समाधान के 0.15 एमएल (3 एमएम), प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल के 0.1 एमएल, एटीपी स्टॉक समाधान के 10 μL (100 μM), ग्लिसरॉल के 1 एमएल (10%) और सोडियम चोलेट के 0.2 ग्राम (तालिका 2%) के साथ चरण 3.3 में किए गए बफर समाधान के 8.7 एमएल को मिलाकर घुलनशीलता बफर तैयार करें।
  2. चरण 3.8 में प्राप्त सेल झिल्ली टुकड़ों के साथ शंक्वाकार ट्यूब में घुलनशीलता बफर को स्थानांतरित करें और गोली को फिर से निलंबित करें। 18 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम पर परिणामी मिश्रण घुमाएं।
    नोट: इस बिंदु पर, प्रयोग रातोंरात सेल झिल्ली गोली घुलनशीलता के लिए रोका जा सकता है।

5. आईएएम पर सेल झिल्ली स्थिरीकरण। पीसी। DD2 कण

  1. 18 घंटे के बाद, 47900 एक्स जी पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुलनशीलता मिश्रण अपकेंद्रित्र।
  2. सतह पर तैरनेवाला रखें और गोली त्यागें। आईएएम के 100 मिलीग्राम जोड़ें। पीसी। डीडी 2 कणों, सतह पर तैरनेवाला, भंवर करने के लिए और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम पर परिणामी निलंबन मिश्रण बारी बारी से।
  3. आईएएम पर कोशिका झिल्ली के टुकड़ों के स्थिरीकरण की सुविधा के लिए। पीसी। डीडी 2 कण नीचे उल्लिखित डायलिसिस चरण में आगे बढ़ते हैं।
    1. ट्राइस-एचसीएल (50 एमएम), एनएसीएल (100 एमएम) के 23.4 ग्राम, सीएसीएल 2 के 0.06 ग्राम (0.1 एमएम), ईडीटीएके 5.85 ग्राम (5 एमएम), और पीएमएसएफ के 0.07 ग्राम (0.1 एमएम) के 0.07 ग्राम जोड़कर अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी के 4 एल में डायलिसिस बफर तैयार करें; तालिका 3)।
      नोट: पीएमएसएफ पानी में घुलनशील नहीं है, इसलिए इसे पहले इथेनॉल की छोटी मात्रा में भंग करें और फिर बफर के साथ बीकर में धीरे-धीरे जोड़ें।
    2. हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान के साथ पीएच को 7.4 तक समायोजित करें। डायलिसिस चरण में आगे बढ़ने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर रखें।
    3. सेलूलोज झिल्ली डायलिसिस ट्यूबिंग (10 के एमडब्ल्यूसीओ, 35 मिमी) के 10 सेमी काटकर डायलिसिस ट्यूब तैयार करें और आईएएम युक्त निलंबन को स्थानांतरित करें। पीसी। डायलिसिस ट्यूब में डीडी 2 कणों और कोशिका झिल्ली टुकड़े। डायलिसिस ट्यूब के दोनों सिरों को बंद करने के लिए डायलिसिस टयूबिंग क्लिप का उपयोग करें।
    4. आईएएम युक्त डायलिसिस ट्यूब रखें। पीसी। डायलिसिस बफर में डीडी 2 स्थिर चरण और धीरे-धीरे सरगर्मी करते हुए 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिज़ करें।
    5. 24 घंटे के बाद, ताजा तैयार डायलिसिस बफर में डायलिसिस टयूबिंग रखें और एक और 24 घंटे के लिए डायलिसिस जारी रखें।

6. सीएमएसी कॉलम पैकिंग

  1. अमोनियम एसीटेट बफर (10 एमएम, पीएच 7.4) तैयार करें जिसका उपयोग आईएएम को धोने के लिए किया जाएगा। पीसी। डीडी 2 कणों और कॉलम लक्षण वर्णन प्रयोगों में 0.7708 ग्राम अमोनियम एसीटेट को 1 एल अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी में भंग करके। हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान के साथ पीएच को 7.4 तक समायोजित करें।
  2. डायलिसिस के 48 घंटे के बाद, डायलिसिस बफर से डायलिसिस ट्यूब को हटा दें और डायलिसिस ट्यूब की सामग्री को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 400 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और अमोनियम एसीटेट बफर के 10 एमएल के साथ शेष गोली को तीन बार धोएं, प्रत्येक धोने के बाद, 400 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को केंद्रित करें।
  4. तीसरे धोने के बाद, अमोनियम एसीटेट बफर के 1 एमएल में शेष गोली को फिर से निलंबित करें। इसे अच्छी तरह से मिलाएं और सीएमएसी क्रोमैटोग्राफी कॉलम उत्पन्न करने के लिए 5/20 ग्लास कॉलम को पैक करने के लिए परिणामी घोल का उपयोग करें।
  5. कॉलम को पैक करने के लिए, पहले फ़िल्टर धारक में अमोनियम एसीटेट बफर के साथ पहले भिगोए गए नीचे के फ़िल्टर को रखें। कांच के कॉलम में फ़िल्टर धारक को फिट करें और धारक की स्थिति को सुरक्षित करने के लिए कॉलम कैप को पेंच करें। कॉलम को एक उंगली क्लैंप में लंबवत रखें और इसे लैब स्टैंड में सुरक्षित करें। स्तंभ के नीचे एक बीकर रखें।
  6. एक एकल चैनल पिपेट्टर का उपयोग करके ग्लास कॉलम में चरण 6.4 में प्राप्त घोल की एक छोटी मात्रा को स्थानांतरित करें। कांच के स्तंभ की दीवार के खिलाफ विंदुक टिप पकड़े हुए, धीरे-धीरे सामग्री डालो। स्लरी की एक और मात्रा डालने से पहले पैकिंग सामग्री को व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  7. पैकिंग प्रक्रिया को गति देने के लिए प्रत्येक चरण के बीच एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके स्थिर बिस्तर के ऊपर से बफर को हटा दें। इन चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि स्लरी का 1 एमएल पैक न हो जाए।
  8. एक शीर्ष फिल्टर रखें और एडाप्टर इकाई को पेंच करें ताकि स्थिर चरण के ऊपर कोई शेष बफर न हो, जैसा कि चित्रा 1 में प्रस्तुत किया गया है। एडाप्टर लॉक के साथ एडाप्टर इकाई की स्थिति सुरक्षित करें।
  9. कॉलम को एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) पंप से कनेक्ट करें, प्रवाह दर को 0.2 एमएल / मिनट पर सेट करें, और अमोनियम एसीटेट बफर के साथ रात भर कॉलम धो लें। स्तंभ अब लक्षण वर्णन चरण के लिए तैयार है। उपयोग तक कॉलम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: लंबे समय तक भंडारण के लिए (कॉलम एक सप्ताह से अधिक समय तक उपयोग नहीं किया जाता है) अमोनियम एसीटेट बफर में 0.05% सोडियम एजाइड समाधान के साथ कॉलम चलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: त्वचा के माध्यम से मौखिक रूप से निगलने या अवशोषित होने पर सोडियम एज़ाइड अत्यधिक विषाक्त होता है; इसे केवल धूआं हुड के तहत संभाला जाना चाहिए। सोडियम एजाइड के साथ काम करते समय प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा और दस्ताने (नाइट्राइल पसंदीदा) पहनना सुनिश्चित करें।

7. सीएमएसी कॉलम लक्षण वर्णन

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और बीडीएनएफ बाध्यकारी
    1. आईएएम तैयार करें। पीसीसी । एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं से अलग-अलग प्राप्त स्थिर सेल झिल्ली टुकड़ों के साथ डीडी 2 स्थिर चरण कण चरण 1 से चरण 6.4 तक के निर्देशों का पालन करके टीआरकेबी और एसएच-एसवाई 5 वाई टीआरकेबी-नल कोशिकाओं को अतिरंजित करते हैं।
    2. एंटीबॉडी धुंधला होने से पहले बीडीएनएफ के साथ इनक्यूबेट किए जाने वाले नमूनों के लिए, अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी के 100 μL में बीडीएनएफ के 10 μg को भंग करके बीडीएनएफ स्टॉक समाधान तैयार करें। समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      1. अलग-अलग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरण, आईएएम के 100 μ एल विभाज्य। पीसी। स्थिर एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के साथ डीडी 2 कॉलम पैकिंग सामग्री टीआरकेबी और आईएएम के 100 μL विभाज्य को अतिरंजित करती है। पीसी। अमोनियम एसीटेट बफर में निलंबित स्थिर एसएच-एसवाई 5 वाई टीआरकेबी-नल कोशिकाओं के साथ डीडी 2 कॉलम पैकिंग सामग्री।
      2. अमोनियम एसीटेट बफर के 390 μL, बीडीएनएफ स्टॉक समाधान के 10 μL, और एटीपी स्टॉक समाधान के 0.5 μL (चरण 3.2 में तैयार) प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें और रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    3. एंटीबॉडी धुंधला होने से पहले बीडीएनएफ के साथ इनक्यूबेट नहीं किए जाने वाले नमूनों के लिए, आईएएम के 100 μL विभाज्य को स्थानांतरित करें। पीसी। स्थिर एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के साथ डीडी 2 कॉलम पैकिंग सामग्री अमोनियम एसीटेट में निलंबित टीआरकेबी को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में निलंबित कर दिया गया है।
    4. अमोनियम एसीटेट बफर के 400 μL और एटीपी स्टॉक समाधान के 0.5 μL (चरण 3.2 में तैयार) प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें और रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    5. 10,000 एक्स जी पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 7.1.2 और 7.1.4 चरणों में तैयार नमूनों स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. 10 मिनट के लिए अमोनियम एसीटेट बफर के 500 μL के साथ परिणामी छर्रों को धोलें और 10,000 एक्स जी पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से स्पिन करें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    7. छर्रों में से प्रत्येक के लिए, अमोनियम एसीटेट बफर के 220 μL, 10% सामान्य बकरी सीरम के 25 μL, और प्राथमिक विरोधी बीडीएनएफ एंटीबॉडी के 5 μL जोड़ें। रॉकिंग के साथ रात भर एक ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में सेते हैं।
    8. इनक्यूबेशन चरण के पूरा होने पर मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 एक्स जी पर 1 मिनट के लिए स्पिन करें और सतह पर तैरनेवाला त्याग दें।
    9. 10 मिनट के लिए 1% हल्के डिटर्जेंट (जैसे, सोडियम कोलेट) युक्त अमोनियम एसीटेट बफर के साथ परिणामी गोली को 3 बार धोलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 एक्स जी पर 1 मिनट के लिए मिश्रण को स्पिन करें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    10. अमोनियम एसीटेट बफर के 900 μL, 10% सामान्य बकरी सीरम के 100 μL, और फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 1,000 कमजोर पड़ने) के 1 μL मिश्रण द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। चरण 7.1.9 में प्राप्त छर्रों में से प्रत्येक के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 300 μL जोड़ें। और रॉकिंग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर मिश्रण स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    12. 10 मिनट के लिए 1% हल्के डिटर्जेंट (जैसे, सोडियम कोलेट) युक्त अमोनियम एसीटेट बफर के साथ परिणामी गोली को 3 बार धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 एक्स जी पर 1 मिनट के लिए मिश्रण को स्पिन करें और सतह पर तैरनेवाला त्याग दें।
    13. अमोनियम एसीटेट बफर के 50 μL में परिणामी छर्रों को फिर से निलंबित करें। प्रत्येक मिश्रण के 20 μL को एक स्लाइड पर रखें और एक कवरस्लिप के साथ कवर करें।
    14. आईएएम की छवि बनाएं। पीसी। 488 एनएम पर उत्तेजना के साथ एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्थिर सेल झिल्ली टुकड़ों के साथ डीडी 2 कण और एक ठोस राज्य लेजर प्रणाली का उपयोग करके उत्पन्न 520 एनएम पर उत्सर्जन। 0.75 के एनए और 0.35 मिमी के डब्ल्यूडी के साथ 20x उद्देश्य का उपयोग करें।
  2. एक मार्कर लिगैंड के रूप में 7,8-डीएचएफ का उपयोग करके ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी
    1. एक डायोड-सरणी डिटेक्टर और / या द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के साथ एक एचपीएलसी प्रणाली के लिए एक सीएमएसी कॉलम कनेक्ट करें।
    2. 5% मेथनॉल युक्त अमोनियम एसीटेट बफर में 7,8-डीएचएफ के 1 एमएम समाधान के 500 एमएल तैयार करें।
    3. कमरे के तापमान पर 0.4 एमएल / मिनट प्रवाह दर पर सीएमएसी कॉलम के माध्यम से मार्कर लिगैंड (1 एमएम) की निरंतर एकाग्रता पंप करें। या तो एक डायोड सरणी का पता लगाने (डीएडी) (तरंग दैर्ध्य 254 एनएम) डिटेक्टर या द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर (एकल आयन निगरानी मोड का उपयोग करें; नकारात्मक आयनीकरण मोड में एम / जेड 253) का उपयोग करके क्षालन प्रोफ़ाइल की निगरानी करें।
    4. रन के पूरा होने के बाद कॉलम के माध्यम से अमोनियम एसीटेट बफर चलाकर रात भर धो लें।
    5. चरण 7.2.2 दोहराएँ। - 7.2.4. मार्कर लिगैंड (750 एनएम, 500 एनएम, 300 एनएम) की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके, प्रत्येक रन के बाद रात भर कॉलम धोना। लिगैंड केडी की गणना करने के लिए ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करें, जैसा कि विस्तार से समीक्षा की गई है, कहीं और। 24,51
  3. सेंटेला एशियाटिका (एल) उर्ब के साथ विस्थापन अध्ययन। (गोटू कोला) उद्धरण
    1. अमोनियम एसीटेट बफर में 7,8-डीएचएफ के 500 एनएम समाधान के 500 एमएल तैयार करें जिसमें 5% मेथनॉल और 0.2% जलीय गोटू कोला निकालने (10 मिलीग्राम /
    2. कमरे के तापमान पर 0.4 एमएल / मिनट प्रवाह दर पर कॉलम के माध्यम से निकालने के साथ मार्कर लिगैंड (500 एनएम) की निरंतर एकाग्रता पंप करें। या तो एक डीएडी डिटेक्टर (तरंग दैर्ध्य 254 एनएम) या एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर (एकल आयन निगरानी मोड का उपयोग करें; नकारात्मक आयनीकरण मोड में एम / जेड 253) का उपयोग करके क्षालन प्रोफ़ाइल की निगरानी करें।
    3. रन के पूरा होने के बाद कॉलम के माध्यम से अमोनियम एसीटेट बफर चलाकर रात भर धो लें।
    4. मार्कर लिगैंड विस्थापन के लिए निरीक्षण करने के लिए गोटू कोला निकालने के साथ समाधान चलाने के बाद प्राप्त 500 एनएम 7,8-डीएचएफ और एक के लिए क्षालन प्रोफाइल प्लॉट करें।

8. गोटू कोला निकालने से संभावित टीआरकेबी बाइंडर्स की पहचान करने के लिए लापता शिखर क्रोमैटोग्राफी दृष्टिकोण

  1. सीएमएसी कॉलम पर गोटू कोला निकालने का विभाजन
    1. सीएमएसी टीआरकेबी और टीआरकेबी-नल कॉलम को एचपीएलसी सिस्टम से अलग-अलग कनेक्ट करें और प्रत्येक कॉलम पर जलीय गोटू कोला निकालने (10 मिलीग्राम / एमएल) के 50 μ एल इंजेक्ट करें। पंप अमोनियम एसीटेट बफर (10 एमएम, पीएच 7.4) कमरे के तापमान पर 0.4 एमएल / मिनट प्रवाह दर पर कॉलम के माध्यम से 5% मेथनॉल युक्त।
    2. सीएमएसी टीआरकेबी और टीआरकेबी-नल कॉलम से अलग-अलग अंशों को निम्नानुसार एकत्र करें: 0-5 मिनट, 5-10 मिनट, 10-15 मिनट, 15-20 मिनट, 20-25 मिनट, 25-30 मिनट, 30-35 मिनट, 35-40 मिनट, 40-45 मिनट, 45-50 मिनट, 50-55 मिनट, 55-60 मिनट।
    3. प्राप्त अंशों को फ्रीज और लायोफिलाइज़ करें। अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने से पहले मेथनॉल के 50 μL में लायोफिलाइज्ड अंशों को फिर से निलंबित करें।
  2. अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी क्वाड्रोपोल टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-क्यूटीओएफ-एमएस) गोटू कोला सीएमएसी अंशों का विश्लेषण
    1. बिंदु 8.1.3 में प्राप्त सभी भिन्नों का विश्लेषण कीजिए। एक यूपीएलसी प्रणाली (यूपीएलसी-एमएसई विश्लेषण मोड) के साथ मिलकर एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करना। सी 18 वैनगार्ड प्री-कॉलम (2.1 मिमी एक्स 5 मिमी, 1.7 μm) के साथ सी 18 कॉलम (2.1 x 50 मिमी, 1.7 μm) का उपयोग करके अंशों का विश्लेषण करें।
    2. मोबाइल चरण ए (0.1% फॉर्मिक एसिड के साथ पानी) और बी (0.1% फॉर्मिक एसिड के साथ एसिटोनिट्राइल) के साथ 0.3 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर निम्नलिखित ढाल समाधानों का उपयोग करके कॉलम को एल्यूट करें: 0.0 मिनट 99% ए 1% बी, 1.5 मिनट 84% ए 16% बी, 5.0 मिनट 80% ए 20% बी, 7.0 मिनट 75% ए 25% बी, 10.0 मिनट 65% ए 35% बी, 20.0-24.0 मिनट 1% ए 99% बी, 25.0-29.0 मिनट 99% ए 1% बी।
    3. कम ऊर्जा के लिए 4 वी और उच्च ऊर्जा के लिए 20-35 वी पर टकराव ऊर्जा के साथ, संकल्प सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड में एमएसई प्रदर्शन करें।
    4. सकारात्मक आयनीकरण मोड में निम्नलिखित ईएसआई स्रोत स्थितियों का उपयोग करें: केशिका वोल्टेज 1.5 केवी, नमूना शंकु 40 वी, स्रोत ऑफसेट 80, स्रोत तापमान 100 डिग्री सेल्सियस, डिसॉल्वेशन अस्थायी 350 डिग्री सेल्सियस, शंकु गैस प्रवाह 38.0 एल /
    5. नकारात्मक आयनीकरण मोड में निम्नलिखित ईएसआई स्रोत स्थितियों का उपयोग करें: केशिका वोल्टेज 1.45 केवी, नमूना शंकु 40 वी, स्रोत ऑफसेट 80, स्रोत तापमान 110 डिग्री सेल्सियस, डिसॉल्वेशन अस्थायी 300 डिग्री सेल्सियस, शंकु गैस प्रवाह 50.0 एल /

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Representative Results

प्रोटोकॉल के बाद, दो सीएमएसी क्रोमैटोग्राफिक कॉलम इकट्ठे किए गए थे: एक स्थिर एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा सेल झिल्ली टुकड़े के साथ अतिरंजित टीआरकेबी के साथ और एक एसएच-एसवाई 5 वाई टीआरकेबी-नल सेल झिल्ली टुकड़ों के साथ। सही ढंग से इकट्ठे सीएमएसी कॉलम चित्रा 1 में प्रस्तुत किया गया है और सेल झिल्ली टुकड़ा स्थिरीकरण में शामिल कदम चित्रा 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं।

आईएएम पर टीआरकेबी रिसेप्टर्स के स्थिरीकरण के बाद से। पीसी। डीडी 2 क्रोमैटोग्राफिक स्थिर चरण का पहले प्रयास नहीं किया गया था, रिसेप्टर्स के सफल स्थिरीकरण की पुष्टि एंटीबॉडी धुंधला और ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा एक मार्कर लिगैंड का उपयोग करके की गई थी: 7,8-डीएचएफ। एंटीबॉडी धुंधला प्रयोग का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 2 में प्रस्तुत किया गया है। न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन से प्राप्त सेल झिल्ली के टुकड़े टीआरकेबी रिसेप्टर्स (टीआरकेबी-नल) के बिना माता-पिता की सेल लाइन से टीआरकेबी रिसेप्टर्स और सेल झिल्ली के टुकड़ों को अतिरंजित करते हुए आईएएम पर स्थिर कर दिया गया था। पीसी। अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करके डीडी 2 कण। इसके बाद, स्थिर कोशिका झिल्ली टुकड़ों वाले कणों को बीडीएनएफ (शारीरिक लिगैंड) के साथ इनक्यूबेट किया गया था और फिर प्राथमिक और फ्लोरोसेंट-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी (चित्रा 2) के साथ। आईएएम। पीसी। स्थिर न्यूरोब्लास्टोमा टीआरकेबी सेल झिल्ली टुकड़े के साथ डीडी 2 कणों और बीडीएनएफ की उपस्थिति में फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए कणों (चित्रा 3 सी) के परिणामस्वरूप। कोई प्रतिदीप्ति (कमजोर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को छोड़कर) नहीं देखा गया था जब टीआरकेबी-नल सेल झिल्ली ने आईएएम कणों को समझाया था (चित्रा 3 ए) की जांच की गई थी या जब टीआरकेबी सेल झिल्ली के मामले में कोई बीडीएनएफ का उपयोग नहीं किया गया था, तो आईएएम कणों (चित्रा 3 बी)।

स्थिर टीआरकेबी रिसेप्टर्स ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए एक छोटे मार्कर लिगैंड (7,8-डीएचएफ) के बंधन को चिह्नित करने के लिए 7,8-डीएचएफ की विभिन्न सांद्रता के साथ किया गया था। एक कार्यात्मक सीएमएसी कॉलम पर 7,8-डीएचएफ सांद्रता बढ़ाने का एक विशिष्ट क्रोमैटोग्राम चित्रा 4 में प्रस्तुत किया गया है। स्थिर टीआरकेबी के लिए 7,8-डीएचएफ के विशिष्ट बंधन की पुष्टि मार्कर लिगैंड के प्रतिधारण समय में एकाग्रता-निर्भर कमी से की गई थी। एक गैर-कार्यात्मक सीएमएसी कॉलम पर प्राप्त ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी परिणाम चित्रा 5 में प्रस्तुत किए गए हैं। मार्कर लिगैंड के प्रतिधारण में एकाग्रता-निर्भर परिवर्तनों की कमी सीएमएसी तैयारी में असफल प्रयास को इंगित करती है।

सीएमएसी कॉलम पर इंजेक्ट किए गए यौगिक न केवल विशेष रूप से बातचीत करते हैं बल्कि आईएएम के साथ गैर-विशेष रूप से बातचीत भी कर सकते हैं। पीसी। डीडी 2 कण, स्थिर कोशिका झिल्ली के टुकड़ों के फॉस्फोलिपिड बिलेयर, और बाइलेयर में मौजूद अन्य प्रोटीन। टीआरकेबी बाइंडर्स के लिए जटिल अर्क की स्क्रीनिंग की प्रक्रिया के दौरान गैर-विशेष रूप से सीएमएसी कॉलम के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों को रद्द करने के लिए लक्षित प्रोटीन को व्यक्त नहीं करने वाली माता-पिता की सेल लाइन के सेल झिल्ली टुकड़ों को स्थिर करके सीएमएसी नकारात्मक नियंत्रण कॉलम तैयार करना महत्वपूर्ण है (इस मामले में टीआरकेबी-नल)। एक नकारात्मक सीएमएसी टीआरकेबी-नल कॉलम पर प्राप्त ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी परिणाम चित्रा 6 में प्रस्तुत किए गए हैं।

कार्यात्मक सीएमएसी कॉलम का उपयोग विभिन्न उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि लक्षित प्रोटीन का लक्षण वर्णन, स्थिर लक्ष्यों के साथ व्यक्तिगत यौगिकों की बातचीत का अध्ययन करना (उदाहरण के लिए, पृथक्करण स्थिरांक प्राप्त करना, केडी) या बाध्यकारी कैनेटीक्स (केऑन और केऑफ) आदि का निर्धारण करना। स्तंभों का उपयोग जटिल नमूनों को स्क्रीन करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि टीआरकेबी रिसेप्टर्स के लिए बाध्यकारी यौगिकों की उपस्थिति के लिए पौधे के अर्क, इसलिए संभावित रूप से अणु होते हैं जो टीआरकेबी एगोनिस्ट या विरोधी के रूप में कार्य करते हैं। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या एक निकालने में संभावित रूप से स्थिर रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले यौगिक होते हैं, एक सरल विस्थापन प्रयोग किया जाता है। गोटू कोला निकालने और एक कार्यात्मक टीआरकेबी कॉलम पर 7,8-डीएचएफ के 500 एनएम के साथ किए गए प्रतियोगिता प्रयोग का परिणाम चित्रा 7 में प्रस्तुत किया गया है। एमएल) के अलावा एगोनिस्ट बाध्यकारी साइट के लिए प्रतिस्पर्धी लिगैंड (एस) की उपस्थिति का संकेत देते हुए 7,8-डीएचएफ प्रतिधारण की महत्वपूर्ण कमी हुई। सीएमएसी नकारात्मक टीआरकेबी-नल कॉलम पर किए गए विस्थापन प्रयोग का परिणाम चित्रा 8 में प्रस्तुत किया गया है। उस कॉलम पर 7,8-डीएचएफ प्रतिधारण की कमी की कमी आगे सीएमएसी टीआरकेबी-नल कॉलम पर कार्यात्मक टीआरकेबी रिसेप्टर्स की कमी की पुष्टि करती है।

विशेष रूप से स्थिर लक्ष्यों के साथ बातचीत करने वाले विशेष मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए, सीएमएसी कॉलम का उपयोग विस्थापन प्रयोग के बाद लापता-शिखर क्रोमैटोग्राफी52 नामक दृष्टिकोण में किया जाता है। इस दृष्टिकोण में, जांच निकाले जाने की एक छोटी मात्रा को जांच किए गए स्थिर लक्ष्य और सीएमएसी नकारात्मक नियंत्रण कॉलम वाले कॉलम पर समानांतर में क्रोमैटोग्राफ किया जाता है। ये दो कॉलम लक्ष्य की अभिव्यक्ति में भिन्न होते हैं, इसलिए व्यक्तिगत अणुओं के प्रतिधारण पैटर्न में कोई भी अंतर इन टीएमपी वाले सीएमएसी कॉलम पर जांच किए गए लक्ष्यों के साथ बातचीत की विशिष्ट प्रकृति के कारण होता है। दोनों कॉलम से समयबद्ध अंश एकत्र, केंद्रित और बाद में एक सी 18 कॉलम पर विश्लेषण किया जाता है। प्राप्त क्रोमैटोग्राम की तुलना की जाती है, और दोनों स्तंभों पर समान रूप से बनाए गए चोटियों द्वारा दर्शाए गए यौगिकों को गैर-विशेष रूप से बातचीत करने वाले अणुओं के रूप में लेबल किया जाता है। स्थिर रिसेप्टर्स के साथ सीएमएसी कॉलम पर बाद के अंशों में एक चोटी की उपस्थिति और सीएमएसी नकारात्मक कॉलम के शुरुआती अंशों में एक ही यौगिक का प्रतिनिधित्व करने वाली चोटी की कमी स्थिर लक्ष्य के साथ यौगिक की विशिष्ट बातचीत का प्रतिनिधित्व करती है। इस चरण में पहचाने गए यौगिकों को जैव-निर्देशित विभाजन करने की आवश्यकता के बिना अलगाव और आगे के परीक्षण के लिए लक्षित किया जा सकता है। लापता-शिखर क्रोमैटोग्राफी दृष्टिकोण का उपयोग विशेष रूप से गोटू कोला निकालने से टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों की पहचान करने के लिए किया गया था। गोटू कोला निकालने को टीआरकेबी और टीआरकेबी-नल कॉलम दोनों पर विभाजित किया गया था और इन अंशों में मौजूद यौगिकों का यूपीएलसी-क्यूटीओएफ-एमएस का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक अंश के क्रोमैटोग्राम की जांच ने टीआरकेबी कॉलम (50-55 मिनट अंश) पर दृढ़ता से बनाए गए यौगिक की पहचान की, जबकि टीआरकेबी-नल कॉलम (0-5 मिनट अंश) पर जल्दी एल्यूटिंग, स्थिर टीआरकेबी रिसेप्टर्स (चित्रा 9) के साथ विशिष्ट बातचीत का संकेत देता है। ~ 17.48 मिनट (चित्रा 9) पर यौगिक एल्यूटिंग अब कार्यात्मक परख में अलगाव और परीक्षण के लिए लक्षित है।

Figure 1
चित्रा 1. सीएमएसी कॉलम को सही ढंग से इकट्ठा किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2. सीएमएसी तैयारी के कदम और स्थिर रिसेप्टर्स के फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी लेबलिंग। एक सीएमएसी कॉलम (1-4) और एंटीबॉडी लेबलिंग प्रयोग (5-8) की तैयारी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (1) लक्षित ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन युक्त होमोजेनाइज्ड सेल झिल्ली टुकड़े, टीआरकेबी (2) एक माइसेलर संरचना में घुलनशील सेल झिल्ली के टुकड़े। (3) सेल झिल्ली टुकड़े आईएएम कणों की सतह पर स्थिर। (4) स्थिर सेल झिल्ली के टुकड़े के साथ आईएएम कणों को एक ग्लास कॉलम में पैक किया जाता है। (5) कोशिका झिल्ली के टुकड़ों में स्थिर टीआरकेबी रिसेप्टर। (6) कार्यात्मक टीआरकेबी रिसेप्टर के लिए प्राकृतिक लिगैंड बीडीएनएफ का बंधन। (7) बीडीएनएफ अणुओं के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी का बंधन। (8) हरे रंग की प्रतिदीप्ति में जिसके परिणामस्वरूप प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए फ्लोरोफोर-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी का बंधन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. "आईएएम कणों पर टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ सेल झिल्ली के टुकड़ों का स्थिरीकरण". कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां आईएएम कणों पर कार्यात्मक टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ सेल झिल्ली के टुकड़ों के स्थिरीकरण को दिखाती हैं। (ए) बीडीएनएफ, प्राथमिक एंटीबॉडी, और फ्लोरोफोर-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद आईएएम कणों पर स्थिर एसएच-एसवाई 5 वाई टीआरकेबी-नल सेल लाइन से सेल झिल्ली के टुकड़े। (बी) बीडीएनएफ के बिना प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोफोर-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद आईएएम कणों पर स्थिर टीआरकेबी व्यक्त करने वाली एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों से सेल झिल्ली के टुकड़े। (सी) एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों से सेल झिल्ली टुकड़े बीडीएनएफ, प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोफोर-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद आईएएम कणों पर स्थिर टीआरकेबी व्यक्त करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4. "टीआरकेबी सीएमएसी कॉलम पर 7,8-डीएचएफ के ललाट आत्मीयता क्रोमेटोग्राम". टीआरकेबी सीएमएसी कॉलम पर 7,8-डीएचएफ की बढ़ती सांद्रता के ललाट क्रोमैटोग्राम, जहां ए - 1 एमएम, बी - 750 एनएम, सी - 500 एनएम, और डी - 300 एनएम। अमोनियम एसीटेट बफर (10 एमएम, पीएच 7.4) 5% मेथनॉल के साथ 0.4 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर एल्यूएंट के रूप में उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5. "गैर-कार्यात्मक टीआरकेबी सीएमएसी कॉलम पर 7,8-डीएचएफ के ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राम". गैर-कार्यात्मक टीआरकेबी सीएमएसी कॉलम पर 7,8-डीएचएफ की विभिन्न सांद्रता के ललाट क्रोमैटोग्राम, जहां ए -1 μM, बी - 1 μM, C - 750 एनएम, और डी - 500 एनएम। अमोनियम एसीटेट बफर (10 एमएम, पीएच 7.4) 5% मेथनॉल के साथ 0.4 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर एल्यूएंट के रूप में उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6. "टीआरकेबी-नल सीएमएसी कॉलम पर 7,8-डीएचएफ के ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राम". टीआरकेबी-नल सीएमएसी कॉलम पर 7,8-डीएचएफ की बढ़ती सांद्रता के ललाट क्रोमैटोग्राम, जहां ए - 1 एमएम, बी - 750 एनएम, सी - 500 एनएम, और डी - 300 एनएम। अमोनियम एसीटेट बफर (10 एमएम, पीएच 7.4) 5% मेथनॉल के साथ 0.4 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर एल्यूएंट के रूप में उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7. टीआरकेबी सीएमएसी कॉलम पर 0.2% गोटू कोला निकालने के साथ 7,8-डीएचएफ के ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राम। सीएमएसी टीआरकेबी कॉलम पर (ए) 500 एनएम 7,8-डीएचएफ + 0.2% गोटू कोला निकालने (10 मिलीग्राम / मिलीलीटर) और (बी) 500 एनएम 7,8-डीएचएफ के प्रतिनिधि ललाट क्षालन प्रोफ़ाइल। अमोनियम एसीटेट बफर (10 एमएम, पीएच 7.4) 5% मेथनॉल के साथ 0.4 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर एल्यूएंट के रूप में उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8. "टीआरकेबी-नल सीएमएसी कॉलम पर 0.2% गोटू कोला निकालने के साथ 7,8-डीएचएफ के फ्रंटल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राम". टीआरकेबी-नल सीएमएसी कॉलम पर (ए) 500 एनएम 7,8-डीएचएफ और (बी) 500 एनएम 7,8-डीएचएफ + 0.2% गोटू कोला निकालने (10 मिलीग्राम / एमएल) के प्रतिनिधि ललाट क्षालन प्रोफ़ाइल। अमोनियम एसीटेट बफर (10 एमएम, पीएच 7.4) 5% मेथनॉल के साथ 0.4 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर एल्यूएंट के रूप में उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9. गोटू कोला निकालने के अंशों के यूपीएलसी-एमएस क्रोमैटोग्राम। गोटू कोला निकालने वाले अंशों (ए) के यूपीएलसी-एमएस क्रोमैटोग्राम टीआरकेबी-नल सीएमएसी कॉलम से 0-5 मिनट के बीच एल्यूट किए गए और (सी) सीएमएसी टीआरकेबी कॉलम से 50-55 मिनट के बीच एल्यूट किए गए। दोनों अंशों में मौजूद 17.48 मिनट के प्रतिधारण समय के साथ एक यौगिक, जैसा कि मिलान द्रव्यमान स्पेक्ट्रा (बी और डी) द्वारा पुष्टि की गई थी, को संभावित टीआरकेबी बाइंडर के रूप में पहचाना गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

होमोजनाइजेशन बफर
1 ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमिथाइल) एमिनोमेथेन हाइड्रोक्लोराइड (ट्रिस-एचसीएल) 50 mM
2 सोडियम क्लोराइड (NaCl) 100 mM
3 कैल्शियम क्लोराइड निर्जल (सीएसीएल2) 3 m M.
4 मैग्नीशियम क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट (एमजीसीएल2) 2 mM
5 पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) 5 mM
6 फेनिलमेथेनसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) 0.1 mM
7 बेंज़ामिडाइन 3 m M.
8 प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (100X) (1/100)
9 ग्लिसरॉल 10%
10 एडेनोसिन 5'-ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) डाइसोडियम नमक हाइड्रेट 100 μM
11 एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) 5 mM

तालिका 1. होमोजिनाइजेशन बफर संरचना।

घुलनशीलता बफर
1 ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमिथाइल) एमिनोमेथेन हाइड्रोक्लोराइड (ट्रिस-एचसीएल) 50 mM
2 सोडियम क्लोराइड (NaCl) 100 mM
3 कैल्शियम क्लोराइड निर्जल (सीएसीएल2) 3 m M.
4 मैग्नीशियम क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट (एमजीसीएल2) 2 mM
5 पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) 5 mM
6 फेनिलमेथेनसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) 0.1 mM
7 बेंज़ामिडाइन 3 m M.
8 प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (100X) (1/100)
9 ग्लिसरॉल 10%
10 एडेनोसिन 5'-ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) डाइसोडियम नमक हाइड्रेट 100 μM
11 सोडियम कोलेट 2%

तालिका 2. घुलनशीलता बफर संरचना।

डायलिसिस बफर
1 ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमिथाइल) एमिनोमेथेन हाइड्रोक्लोराइड (ट्रिस-एचसीएल) 50 mM
2 सोडियम क्लोराइड (NaCl) 100 mM
3 कैल्शियम क्लोराइड निर्जल (सीएसीएल2) 0.1 mM
4 एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) 5 mM
5 फेनिलमेथेनसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) 0.1 mM

तालिका 3. डायलिसिस बफर संरचना।

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Discussion

विशेष मेटाबोलाइट्स के जटिल मिश्रण में मौजूद सक्रिय यौगिकों की पहचान एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण कार्य23 है। परंपरागत रूप से, व्यक्तिगत यौगिकों को अलग किया जाता है, और उनकी गतिविधि का परीक्षण विभिन्न परखों में किया जाता है। यह दृष्टिकोण समय लेने वाली और महंगा है और अक्सर सबसे प्रचुर मात्रा में और अच्छी तरह से विशेषता वाले यौगिकों23 के अलगाव और पहचान की ओर जाता है। वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख पहले से ही ज्ञात लक्ष्यों के साथ स्क्रीनिंग कॉम्बिनेटोरियल रसायन विज्ञान पुस्तकालयों पर बहुत अधिक निर्भर करते हैं और जटिल मिश्रण53 में मौजूद जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान और अलगाव के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए हैं।

सीएमएसी टीएमपी 23,24,54 को लक्षित करने वाले यौगिकों की पहचान के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक में टीएमपी के साथ सेल झिल्ली के टुकड़े आईएएम स्थिर चरण कणों23,24 की सतह पर स्थिर होते हैं। सीएमएसी एक अद्वितीय दृष्टिकोण है जो कोशिका झिल्ली फॉस्फोलिपिड बाइलेयर24 की नकल करने वाले ठोस समर्थन पर लक्षित प्रोटीन के साथ कोशिका झिल्ली के टुकड़ों के स्थिरीकरण की अनुमति देता है। यह स्थिर प्रोटीन लक्ष्यों की कार्यक्षमता को संरक्षित करने की अनुमति देता है और टीएमपी के साथ बातचीत करने वाले छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए सीएमएसी का उपयोग करते समय शारीरिक स्थितियों के करीब प्रदान करता है। सीएमएसी अद्वितीय प्राकृतिक उत्पादों के पुस्तकालयों से उपन्यास रासायनिक मचानों की खोज के अवसरों का लाभ प्रदान करता है, जिसे वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले परखों में से किसी अन्य का उपयोग करके परीक्षण नहीं किया जा सकताहै 23 . प्रस्तावित दृष्टिकोण इस बातचीत की प्रकृति को उजागर किए बिना टीएमपी के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों की पहचान के लिए अनुमति देता है। इंटरैक्शन के मोड (एलोस्टेरिक या ऑर्थोस्टेरिक इंटरैक्शन; निषेध या सक्रियण) को कार्यात्मक सेल-आधारित परख का उपयोग करके सत्यापित करने की आवश्यकता है। स्थिर प्रोटीन लक्ष्यों के साथ सीएमएसी का उपयोग फार्माकोडायनामिक्स (जैसे पृथक्करण स्थिरांक, केडी) के लक्षण वर्णन में भी किया जा सकता है या लक्ष्य के साथ बातचीत करने वाले छोटे अणु लिगैंडों के बाध्यकारी कैनेटीक्स (केऑन और केऑफ) का निर्धारण करने के साथ-साथ स्थिर प्रोटीन24 पर बाध्यकारी साइटों के लक्षण वर्णन की प्रक्रिया में भी किया जा सकता है। . यद्यपि सीएमएसी केवल टीएमपी के लिए बाध्यकारी यौगिकों की पहचान करने की अनुमति देता है, यह एक अभिनव दृष्टिकोण है जो दवा खोज पाइपलाइन में पहले कदम को काफी तेज करता है, क्योंकि इसके लिए यौगिक शुद्धिकरण की आवश्यकता नहीं होती है, जो वर्तमान में प्राकृतिक मिश्रण से दवा खोज प्रक्रिया में प्रमुख अड़चन रही है।

यद्यपि प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर (टीआरकेबी) के स्थिरीकरण पर केंद्रित है, सीएमएसी तकनीक का उपयोग अन्य लक्ष्यों के साथ कॉलम की तैयारी में किया जा सकता है। सीएमएसी तैयारी के महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक सेल लाइन या ऊतक की पसंद है जिसका उपयोग सेल झिल्ली के टुकड़ों को अलग करने के लिए किया जाता है। यदि स्थिर रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों के लिए जटिल मिश्रण की स्क्रीनिंग में कॉलम का उपयोग किया जाता है, तो लक्षित प्रोटीन को अतिरंजित करने वाली सेल लाइनों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। इस तरह की एक सेल लाइन का उपयोग करने से स्थिर लक्ष्यों की एक उच्च संख्या होगी और लक्ष्य या कम प्रचुर मात्रा में अणुओं के प्रति कम आत्मीयता के साथ यौगिकों की पहचान की संभावना बढ़ जाएगी। यदि कोई स्थिर प्रोटीन के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित करता है, तो एक देशी सेल लाइन के उपयोग की सिफारिश की जाती है, क्योंकि पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन प्रोटीन से गुजरता है और साथ ही फॉस्फोलिपिड वातावरण ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइन में काफी भिन्न हो सकता है।

आईएएम कणों पर सेल झिल्ली अलगाव और स्थिरीकरण के कुछ पहलू महत्वपूर्ण हैं और रिसेप्टर प्रकार या प्रोटीन के स्रोत के आधार पर संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। स्थिर प्रोटीन के प्रोटियोलिटिक क्लीवेज को रोकने के लिए, होमोजिनाइजेशन और घुलनशीलता बफर में उचित प्रोटीज अवरोधकों का उपयोग करना आवश्यक है। आवश्यक प्रोटीज अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक साहित्य खोज की सिफारिश की जाती है। प्रोटोकॉल अनुकूलन की प्रक्रिया में, हमने निर्धारित किया कि एटीपी और ग्लिसरॉल के अलावा टीआरकेबी को स्थिर करते समय सीएमएसी कॉलम पर बाध्यकारी साइटों (बीअधिकतम) की संख्या बढ़ जाती है। अन्य प्रकार के ट्रांसमेम्ब्रेन लक्ष्य24 के स्थिरीकरण को अनुकूलित करते समय अन्य कोफ़ैक्टर्स आवश्यक हो सकते हैं। वर्तमान में, हम टीआरकेबी स्थिरीकरण की प्रक्रिया में कोलेस्ट्रॉल के अलावा की जांच कर रहे हैं, क्योंकि हाल ही में कोलेस्ट्रॉल को टीआरकेबीलिगैंड48 के प्रभावों को संशोधित करने के लिए पाया गया था। यह पहले बताया गया था कि कार्यात्मक सीएमएसी कॉलम24 प्राप्त करने के लिए कोलेस्ट्रॉल और / या अन्य लिपिड के अलावा की आवश्यकता हो सकती है।

विभिन्न प्रकार के डिटेक्टरों का उपयोग क्रोमोफोर, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या रेडियोधर्मी लिगैंड के लिए रेडियो प्रवाह डिटेक्टर के साथ लिगैंड के लिए डायोड सरणी डिटेक्टर सहित कॉलम एल्यूएट की निगरानी के लिए किया जा सकता है।

सीएमएसी कॉलम की स्थिरता की निगरानी महत्वपूर्ण महत्व का है। सीएमएसी कॉलम स्थिर प्रोटीन के प्रकार, उपयोग की आवृत्ति और भंडारण की स्थिति के आधार पर कई महीनों तक स्थिर हो सकते हैं। यदि कॉलम एक सप्ताह से अधिक समय तक अप्रयुक्त रहता है तो 4 डिग्री सेल्सियस पर अमोनियम एसीटेट बफर में 0.05% सोडियम एजाइड समाधान में कॉलम को स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। इसका उपयोग करने का प्रयास करने से पहले लंबी अवधि के बाद अमोनियम एसीटेट बफर के साथ कॉलम को अच्छी तरह से धोना महत्वपूर्ण है। यह सलाह दी जाती है कि साप्ताहिक मार्कर लिगैंड की चयनित एकाग्रता को इंजेक्ट करके कॉलम की कार्यक्षमता की निगरानी करें।

कई फायदों के बावजूद, सीएमएसी तकनीक में कई सीमाएं हैं जिन्हें दवा की खोज के प्रयासों में कॉलम का उपयोग करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, स्थिर ट्रांसमेम्ब्रेन लक्ष्यों की संख्या समय के साथ कम हो जाती है, और इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि बाध्यकारी साइटों की कुल संख्या साप्ताहिक24 की निगरानी की जाती है। इस कमी के कारणों में से एक स्थिरीकरण प्रक्रिया का परिणाम है जो सोखना पर आधारित है और इसमें सहसंयोजक बांड की शुरूआत शामिल नहीं है। लिपोफिलिक यौगिकों को आईएएम सतह और फॉस्फोलिपिड बिलेयर के लिए महत्वपूर्ण गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के कारण सीएमएसी कॉलम पर दृढ़ता से बनाए रखा जा सकता है। यह विश्लेषण समय को थ्रूपुट कम करने में काफी वृद्धि करता है। सीएमएसी कॉलम तैयारी की प्रक्रिया सेल लाइन-विशिष्ट है और स्थिर प्रोटीन की प्रकृति की पूरी तरह से समझ की आवश्यकता होती है, जिससे यह कम विशेषता वाले लक्ष्यों के लिए कम उपयुक्त हो जाता है।

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Disclosures

लुकास सिज़ला आईएएम के प्रदाता रेजिस टेक्नोलॉजीज के साथ सहयोग करता है। पीसी। डीडी 2 कण।

Acknowledgments

जेडसीए को तुर्की के वैज्ञानिक और तकनीकी अनुसंधान परिषद (टीयूबीआईटीएके) 2219- इंटरनेशनल पोस्टडॉक्टोरल रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या 1आर 41 एटी 011716-01 के तहत नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल सेंटर फॉर कॉम्प्लिमेंट्री एंड इंटीग्रेटिव मेडिसिन द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को आंशिक रूप से अमेरिकन सोसाइटी ऑफ फार्माकोग्नोसी रिसर्च स्टार्टर ग्रांट, एलसी को रेगिस टेक्नोलॉजीज अनुदान द्वारा भी समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-8 Dihydroxyflavone hydrate Sigma-Aldrich D5446-10 mg ≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383-1 g
Ammonium acetate VWR Chemicals BDH BDH9204-500 g
BDNF antibody Invitrogen PA5-15198-400 μL Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human Sigma-Aldrich B3795-10 μg Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride VWR Analytical BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt Alfa Aesar J62050-100 g
Dounce homogenizer VWR 71000-516 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR Analytical BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500 mL sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution Sigma-Aldrich G8168-100 mL 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol VWR Life Science E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) Regis Technologies, Inc. 1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate VWR Analytical BDH9244-500 mL
Methanol Sigma-Aldrich 322425
Nikon C2 DUVb Nikon Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%) Life Technologies 50197Z
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Thermo Scientific 36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS) VWR Life Science K812-500 mL 1x
Potassium chloride VWR Chemicals BDH 0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail VWR Life Science Ambreso M221-1 mL Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758-500 mL with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen Alexa Flour Plus 488 A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B Kerafast ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line Kerafast ECP005
Snake skin dialysis tubing Thermo Scientific 88245 10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride BDH VWR Analytical BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column GE Healthcare 24-4064-08
Tris-HCl VWR Life Science 0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-500 mL 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

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जैव रसायन अंक 179
सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम स्थिर ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए
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Arituluk, Z. C., Adhikari, B., Maitra, U., Goodman, C., Ciesla, L. M. Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B. J. Vis. Exp. (179), e63118, doi:10.3791/63118 (2022).

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