يصف هذا البروتوكول التحكم البصري الكامل ومراقبة النشاط الخلوي المثار في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC (iPSC-CMs) لفحص الأدوية عالية الإنتاجية واختبار السمية. يتم عرض القياس الكمي متعدد المعلمات لأنماط النمط الظاهري في الزمان والمكان. يتم إثبات الآثار طويلة الأجل للعقاقير على مدى ساعات ، أو القياسات المتسلسلة على مدى أيام.
من المهم فهم كيفية عمل الخلايا القابلة للإثارة في الصحة والمرض وكيف يمكن تغيير هذا السلوك بواسطة جزيئات صغيرة أو التلاعب الجيني. يمكن الجمع بين مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مع نوافذ انبعاث متعددة (على سبيل المثال ، للمراقبة المتزامنة للأحداث دون الخلوية المتميزة) أو استخدامها في التطبيقات الموسعة مع المحركات الأخرى المعتمدة على الضوء في الخلايا القابلة للاستثارة (على سبيل المثال ، الجمع بين التحكم البصري الوراثي المشفر وراثيا مع مؤشرات الكالسيوم المتوافقة مع الطيف). وقد استخدمت هذه الأساليب في الخلايا العصبية الأولية أو المشتقة من الخلايا الجذعية، والخلايا العضلية القلبية، وخلايا بيتا البنكرياسية. ومع ذلك، كان من الصعب زيادة إنتاجية، أو مدة الملاحظة، لهذه النهج بسبب القيود المفروضة على الأدوات، وبرامج التحليل، وأداء المؤشرات، وكفاءة توصيل الجينات. هنا ، يتم الجمع بين GECI الأخضر عالي الأداء ، mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) ، و GECI ، K-GECO ، ذو الانزياح الأحمر ، مع التحكم البصري الجيني لتحقيق التحكم البصري الكامل وتصور النشاط الخلوي بتنسيق تصوير عالي الإنتاجية باستخدام نظام تصوير عالي المحتوى. يتم عرض التطبيقات التي توضح اختبار السمية القلبية وفحص الأدوية المظهرية باستخدام iPSC-CMs الصحية والمشتقة من المريض. بالإضافة إلى ذلك ، تقتصر التقييمات متعددة المعلمات باستخدام مجموعات من متغيرات مؤشر التقارب الطيفي والكالسيوم (NIR-GECO ، LAR-GECO ، و MTGCEPIA أو Orai1-G-GECO) على مقصورات خلوية مختلفة كما يتم عرضها في نموذج iPSC-CM.
تعتبر النماذج المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) القائمة على الإنسان حلا واعدا لأهداف 3Rs (الاستبدال والاختزال والصقل) المحددة للدراسات الحيوانية 1,2. تم استخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية لأنها تلخص الجوانب الأساسية لعلم الأحياء البشري3. تم استخدام تصوير الكالسيوم ، عادة مع الأصباغ الكيميائية ، لمراقبة النشاط الخلوي قبل وبعد العلاج بالعقاقير 4,5. ومع ذلك ، فإن مجسات استشعار الكالسيوم القائمة على الصبغة الكيميائية تمنع مباشرة Na و K-ATPase وتعطل الوظيفة الخلوية6. وبالتالي ، فإن تتبع نفس الخلايا على مدار ساعات أو أيام كان مشكلة عند استخدام الأصباغ الكيميائية. هنا ، يتم استخدام مجموعة من مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) 7،8،9،10 عبر طيف واسع من الإثارة / الانبعاثات وتقارب الكالسيوم لتشكيل منصة اختبار سمية القلب التي تقدم قياسات متعددة العضيات في الوقت الفعلي على مدى فترات طويلة من الزمن11.
لمواصلة تطوير مفهوم الفحص القائم على الكالسيوم عالي الإنتاجية في نموذج iPSC-CM خارج السياق الأكاديمي الموضح سابقا باستخدام أدوات مشفرة وراثيا للتحكم البصري وتصوير الكالسيوم عن طريق التعبير المشترك عن مؤشر الكالسيوم ذي الانزياح الأحمر ، R-GECO أو K-GECO مع أداة وراثية بصرية ،ChR2 12,13 ، تم إنشاء مجموعات فيروسية جاهزة. من خلال نقل التصوير إلى أداة عالية المحتوى مجهزة بنظام تلقائي للسوائل الدقيقة ، يتم وضع طبقات من السحب أحادي القناة للإضافة المركبة فوق تصوير الخلايا الحية. وأخيرا ، يتم تحسين وأتمتة كلا الجانبين الحاسمين للمسار التجريبي ، ومعالجة الصور ، والتحليل.
لإجراء فحص عالي الإنتاجية بنجاح، يجب توزيع الإشارات بالتساوي عبر وعاء الاستزراع، مما يضمن إمكانية تطبيق مناطق الاهتمام المختارة عشوائيا (ROIs) تلقائيا أثناء الحصول على التصوير. على الرغم من أن مؤشرات الكالسيوم الكيميائية تلبي هذا الشرط بسهولة ، إلا أن المجسات المشفرة وراثيا أنتجت تاريخيا بقع ، بدلا من صفائح ، من الإشارة التي تحد من استخدامها. يوفر استخدام نظام النقل الفيروسي مستويات تعبير عالية تبلغ27,28 ومستويات تعبير مكافئة لمؤشرات متعددة بين الخلايا المستهدفة مقارنة بطرق النقل التقليدية. قد تتطلب أنواع الخلايا المختلفة مروجين مختلفين ، وقد يحتاج اختيار نظام توصيل الجينات إلى التغيير وفقا لذلك29،30،31. في نماذج الخلايا غير المتجانسة، قد تختلف كفاءة النقل والتعبير في أنواع معينة من الخلايا. فمن ناحية، قد يحد هذا من التطبيق على خلايا معينة، ولكن يمكن استغلال هذه الظاهرة لتمييز خلايا معينة في نظام الزراعة المشتركة32.
التأثير الرئيسي لهذا النهج هو التحرر من العلاقة الفردية بين المجرب والعينة عن طريق الأتمتة. في تجربة قياسية متعددة الآبار ، لجمع البيانات في أربعة مواقع داخل بئر واحد ، نقدر أن الأمر يستغرق حوالي 15 ساعة في المجهر لجمع مقاطع فيديو 30 ثانية من لوحة بئر 96. في النظام الآلي ، يستغرق هذا ~ 4 ساعات. علاوة على ذلك ، يستغرق تحليل البيانات يدويا وقتا أطول بكثير من الحصول على البيانات. نظام التحليل المستخدم هنا أسرع بحوالي 200 مرة من المكافئ اليدوي. والنتيجة الصافية هي تحسين سير العمل وتوفير التكلفة والوقت بشكل كبير.
على النقيض من الخلايا العضلية القلبية الأولية المحملة بأصباغ الكالسيوم التي تبقى على قيد الحياة في حدود الساعات ، يمكن أن تسفر GECIs المعبر عنها في iPSC-CM عبر أنظمة التوصيل الفيروسي عن إشارة في نموذج تجريبي يعيش لبضعة أشهر. يمكن الحفاظ على هذه النماذج في شكل بئر متعددة وتتبعها في وقت واحد للتحليل التسلسلي في أنظمة التصوير عالية المحتوى التي تم تطويرها لفحص الجزيئات الصغيرة. ينتج عن ذلك منصة تجريبية بشرية بسيطة لاختبار تأثيرات الأدوية على مدى فترات أقرب إلى تلك التي يعاني منها المرضى (أسابيع أو أشهر) بدلا من الدقائق المستخدمة عادة في اختبارات السموم.
يمكن توسيع النظام لتقديم قياسات متعددة المعلمات من خلال تضمين GECIs ذات خصائص الانبعاثات المتميزة من الأخضر إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة. تتطلب مثل هذه التجارب ضوء الإثارة المناسب ومجموعات المرشحات في التصميم التجريبي للحفاظ على الإشارات منفصلة. يتطلب التطبيق الواسع النطاق في سياق فحص الأدوية منصات تحليل قوية وفعالة بالإضافة إلى صرف الأدوية. على الرغم من أن النموذج الموصوف هنا يركز على استخدام مؤشرات الكالسيوم الديناميكية المتعددة ، إلا أنه يمكن تعديل ذلك إلى علامات هيكلية لشكل الخلية أو وظيفتها. عادة ما يكون من الأسهل تصورها لأنها تظهر القليل من التباين من نبض إلى فوز مقارنة بالتباين مائة ضعف في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. قد يكون هذا النهج ذا قيمة خاصة للأمراض النادرة حيث قد يحتوي وسيط iPSC المشتق من المرضى على جميع الدوافع الجينية والمعدلات لحالة معينة والتي يمكن الحفاظ عليها في نموذج خلية قابل للتطوير ، مما يسهل اكتشاف الأدوية في مختلف الأمراض القائمة على الأنماط الظاهرية الخلوية التي يمكن تصورها بشكل مستقل عن الآلية البيولوجية الأساسية التي قد يكون من الصعب توضيحها.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر البروفيسور روبرت كامبل من جامعة طوكيو على مشاطرته المواد والمناقشات القيمة؛ الدكتور شيا لين هو في الجهاز الجزيئي للدعم الفني.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |