Настоящий протокол описывает полностью оптический контроль и наблюдение за триггерной клеточной активностью в кардиомиоцитах, полученных из iPSC (iPSC-CM), для высокопроизводительного скрининга лекарств и тестирования токсичности. Показана многопараметрическая количественная оценка фенотипических закономерностей во времени и пространстве. Демонстрируются долгосрочные эффекты лекарств в течение нескольких часов или последовательные измерения в течение нескольких дней.
Важно понять, как возбудимые клетки работают в здоровье и болезни и как это поведение может быть изменено небольшими молекулами или генетическими манипуляциями. Генетически закодированные индикаторы кальция (GECI) с несколькими эмиссионными окнами могут быть объединены (например, для одновременного наблюдения различных субклеточных событий) или использованы в расширенных приложениях с другими светозависимыми исполнительными механизмами в возбудимых клетках (например, комбинируя генетически закодированный оптогенетический контроль со спектрально совместимыми показателями кальция). Такие подходы были использованы в первичных или стволовых нейронах, кардиомиоцитах и бета-клетках поджелудочной железы. Тем не менее, было сложно увеличить пропускную способность или продолжительность наблюдения таких подходов из-за ограничений инструментов, аналитического программного обеспечения, производительности индикаторов и эффективности доставки генов. Здесь высокопроизводительный зеленый GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) и GECI с красным смещением, K-GECO, сочетаются с оптогенетическим контролем для достижения полностью оптического контроля и визуализации клеточной активности в высокопроизводительном формате визуализации с использованием системы визуализации с высоким содержанием. Показаны приложения, демонстрирующие тестирование кардиотоксичности и фенотипический скрининг лекарств со здоровыми и полученными от пациента iPSC-CMs. Кроме того, в модели iPSC-CM также демонстрируются многопараметрические оценки с использованием комбинаций спектральных и кальциевых вариантов показателей сродства к кальцию (NIR-GECO, LAR-GECO и mtGCEPIA или Orai1-G-GECO), ограниченные различными клеточными компартментами.
Модели, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), на основе человека, считаются многообещающим решением целей 3R (замена, сокращение и уточнение), изложенных для исследований на животных 1,2. Кардиомиоциты, полученные из iPSC, использовались для моделирования заболеваний и открытия лекарств, поскольку они резюмируют основные аспекты биологии человека3. Кальциевая визуализация, как правило, с химическими красителями, использовалась для наблюдения клеточной активности до и послемедикаментозного лечения 4,5. Однако химические датчики кальция на основе красителей непосредственно ингибируют Na, K-АТФазу и нарушают клеточную функцию6. Таким образом, отслеживание одних и тех же клеток в течение нескольких часов или дней было проблематичным при использовании химических красителей. Здесь ряд генетически закодированных показателей кальция (GECI)7,8,9,10 используется в широком спектре возбуждения/излучения и сродства кальция для формирования платформы для тестирования сердечной токсичности, предлагающей измерения мультиорганелл в режиме реального времени в течение длительных периодов времени11.
Для дальнейшего развития концепции высокопроизводительного скрининга на основе кальция в модели iPSC-CM за пределами ранее продемонстрированного академического контекста с использованием генетически закодированных инструментов для оптического контроля и визуализации кальция путем совместной экспрессии индикатора кальция с красным смещением, R-GECO или K-GECO с оптогенетическим инструментом, ChR2 12,13, были созданы готовые вирусные наборы. При преобразовании визуализации в инструмент с высоким содержанием, оснащенный автомикрофлюидной системой, одноканальное пипетирование добавления соединений наслаивается поверх визуализации живых клеток. Наконец, оба важнейших аспекта экспериментального пути, обработка изображений и анализ улучшаются и автоматизируются.
Для успешного выполнения высокопроизводительного скрининга сигналы должны быть равномерно распределены по сосуду культуры, гарантируя, что случайно выбранные области интереса (ROI) могут быть применены автоматически во время получения изображений. Хотя химические показатели кальция легко удовлетворяют этому требованию, генетически закодированные зонды исторически производили пятна, а не листы сигнала, ограничивающие их использование. Использование системы вирусной трансдукции обеспечивает высокие27,28 и эквивалентные уровни экспрессии множественных индикаторов среди клеток-мишеней по сравнению с обычными методами трансфекции. Различные типы клеток могут требовать разных промоторов, и выбор системы доставки генов может потребоваться соответственноизменить 29,30,31. В гетерогенных клеточных моделях эффективность трансдукции и экспрессии могут быть различными в определенных типах клеток. С одной стороны, это может ограничить применение к конкретным клеткам, но это явление может быть использовано для различения конкретных клеток в системе32 совместной культивирования.
Основное влияние этого подхода заключается в освобождении от отношений один к одному между экспериментатором и образцом с помощью автоматизации. В стандартном эксперименте с несколькими скважинами для сбора данных в четырех позициях в пределах одной скважины мы оцениваем, что для сбора видео 30 с из 96 лунок требуется около 15 часов под микроскопом. В автоматизированной системе это занимает ~4 ч. Кроме того, анализ данных вручную занимает гораздо больше времени, чем сбор данных. Используемая здесь система анализа примерно в 200 раз быстрее ручного эквивалента. Конечным результатом является улучшенный рабочий процесс и высокая экономия средств и времени.
В отличие от первичных кардиомиоцитов, загруженных красителями кальция, которые выживают в порядке часов, GECI, выраженные в iPSC-CM через вирусные системы доставки, могут давать сигнал в экспериментальной модели, которая живет в течение нескольких месяцев. Эти модели могут поддерживаться в формате с несколькими скважинами и отслеживаться одновременно для последовательного анализа в системах визуализации с высоким содержанием, разработанных для скрининга малых молекул. Это создает простую экспериментальную платформу для человека для проверки эффектов лекарств в течение длительностей, близких к тем, которые испытывают пациенты (недели или месяцы), а не минуты, обычно используемые в токсикологических анализах.
Система может быть расширена для обеспечения многопараметрических измерений путем включения GECI с различными свойствами выбросов от зеленого до почти инфракрасного. Такие эксперименты требуют надлежащего света возбуждения и наборов фильтров в экспериментальной конструкции для разделения сигналов. Широкое применение в контексте скрининга лекарств требует надежных и эффективных аналитических платформ в дополнение к дозированию лекарств. Хотя модель, описанная здесь, фокусируется на использовании нескольких динамических показателей кальция, она может быть изменена на структурные маркеры клеточной формы или функции. Их, как правило, легче визуализировать, поскольку они показывают небольшую изменчивость по сравнению со стократным изменением внутриклеточной концентрации кальция. Этот подход может быть особенно ценным для редких заболеваний, когда промежуточный iPSC, полученный от пациентов, может содержать все генетические драйверы и модификаторы конкретного состояния, которые могут быть сохранены в масштабируемой клеточной модели, способствуя открытию лекарств при различных заболеваниях на основе клеточных фенотипов, которые могут быть визуализированы независимо от лежащего в основе биологического механизма, который может быть трудно выяснить.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора Роберта Кэмпбелла из Токийского университета за обмен материалами и ценную дискуссию; Доктор Чиа-Лин Хо в Molecular Device для технической поддержки.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |