Het huidige protocol beschrijft volledig optische controle en observatie van geactiveerde cellulaire activiteit in iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM’s) voor high-throughput geneesmiddelenscreening en toxiciteitstests. Multiparametrische kwantificering van fenotypische patronen in tijd en ruimte worden getoond. Langetermijneffecten van geneesmiddelen gedurende uren, of opeenvolgende metingen gedurende dagen, worden aangetoond.
Begrijpen hoe prikkelbare cellen werken in gezondheid en ziekte en hoe dat gedrag kan worden veranderd door kleine moleculen of genetische manipulatie is belangrijk. Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s) met meerdere emissievensters kunnen worden gecombineerd (bijvoorbeeld voor gelijktijdige observatie van verschillende subcellulaire gebeurtenissen) of worden gebruikt in uitgebreide toepassingen met andere lichtafhankelijke actuatoren in prikkelbare cellen (bijvoorbeeld het combineren van genetisch gecodeerde optogenetische controle met spectraal compatibele calciumindicatoren). Dergelijke benaderingen zijn gebruikt in primaire of stamcel-afgeleide neuronen, cardiomyocyten en bètacellen van de pancreas. Het was echter een uitdaging om de doorvoer of de duur van observatie van dergelijke benaderingen te verhogen vanwege beperkingen van de instrumenten, analysesoftware, indicatorprestaties en genleveringsefficiëntie. Hier wordt een hoogwaardige groene GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) en rood verschoven GECI, K-GECO, gecombineerd met optogenetische controle om volledig optische controle en visualisatie van cellulaire activiteit te bereiken in een beeldvormingsformaat met hoge doorvoer met behulp van een High-Content Imaging System. Toepassingen die cardiotoxiciteitstests en fenotypische geneesmiddelenscreening demonstreren met gezonde en van patiënten afgeleide iPSC-CM’s worden getoond. Bovendien worden multiparametrische beoordelingen met combinaties van spectrale en calciumaffiniteitsindicatorvarianten (NIR-GECO, LAR-GECO en mtGCEPIA of Orai1-G-GECO) ook gedemonstreerd tot verschillende cellulaire compartimenten.
Op mensen gebaseerde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide modellen worden beschouwd als een veelbelovende oplossing voor de 3V-doelstellingen (vervanging, reductie en verfijning) die zijn uiteengezet voor dierstudies 1,2. iPSC-afgeleide cardiomyocyten zijn gebruikt voor ziektemodellering en medicijnontdekking omdat ze essentiële aspecten van de menselijke biologie samenvatten3. Calciumbeeldvorming, meestal met chemische kleurstoffen, is gebruikt om cellulaire activiteit voor en na medicamenteuze behandeling te observeren 4,5. Chemische op kleurstoffen gebaseerde calciumdetectiesondes remmen echter direct de Na, K-ATPase en verstoren de cellulaire functie6. Het volgen van dezelfde cellen over uren of dagen is dus problematisch wanneer chemische kleurstoffen worden gebruikt. Hier wordt een reeks genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s)7,8,9,10 gebruikt over een breed excitatie/ emissie- en calciumaffiniteitsspectrum om een cardiaal toxiciteitstestplatform te vormen dat real-time multi-organelmetingen over langere perioden biedt 11.
Om het high-throughput calcium-gebaseerde screeningsconcept in het iPSC-CM-model verder te ontwikkelen dan de eerder aangetoonde academische context met behulp van genetisch gecodeerde hulpmiddelen voor optische controle en calciumbeeldvorming door co-expressie van een rood verschoven calciumindicator, R-GECO of K-GECO met een optogenetisch hulpmiddel, chR212,13, zijn kant-en-klare virale kits gegenereerd. Door beeldvorming over te zetten in een instrument met een hoog gehalte dat is uitgerust met een auto-microfluïdisch systeem, wordt eenkanaals pipetteren van samengestelde toevoeging bovenop live-cell imaging gelegd. Ten slotte worden beide cruciale aspecten van het experimentele traject, beeldverwerking en analyse, verbeterd en geautomatiseerd.
Om met succes high-throughput screening uit te voeren, moeten signalen gelijkmatig over het kweekvat worden verdeeld, zodat willekeurig geselecteerde regio’s van belang (ROI’s) automatisch kunnen worden toegepast tijdens beeldvormingsacquisitie. Hoewel chemische calciumindicatoren gemakkelijk aan deze eis voldoen, hebben genetisch gecodeerde sondes historisch gezien patches geproduceerd, in plaats van vellen, van signaal die het gebruik ervan beperken. Het gebruik van een viraal transductiesysteem levert hoge 27,28 en equivalente expressieniveaus van meerdere indicatoren tussen de doelcellen in vergelijking met conventionele transfectiemethoden. Verschillende celtypen kunnen verschillende promotors vereisen en de keuze van het genafgiftesysteem moet mogelijk dienovereenkomstig veranderen 29,30,31. In heterogene celmodellen kunnen transductie en expressie-efficiëntie verschillen in specifieke celtypen. Aan de ene kant kan dit de toepassing beperken tot bepaalde cellen, maar het fenomeen kan worden gebruikt om bepaalde cellen in een co-kweeksysteem te onderscheiden32.
De belangrijkste impact van deze aanpak is de bevrijding van de één-op-één relatie tussen de experimentator en de steekproef door automatisering. In een standaard multi-well experiment, voor het verzamelen van gegevens op vier posities binnen een enkele put, schatten we dat het ongeveer 15 uur duurt bij de microscoop om 30 s video’s te verzamelen van een 96 putplaat. In het geautomatiseerde systeem duurt dit ~4 uur. Bovendien duurt de handmatige analyse van de gegevens veel langer dan data-acquisitie. Het analysesysteem dat hier wordt gebruikt, is ongeveer 200 keer sneller dan het handmatige equivalent. Het netto resultaat is een verbeterde workflow en hoge kosten- en tijdsbesparingen.
In tegenstelling tot primaire cardiomyocyten geladen met calciumkleurstoffen die in de orde van uren overleven, kunnen GECI’s uitgedrukt in iPSC-CM’s via virale toedieningssystemen een signaal opleveren in een experimenteel model dat een paar maanden leeft. Deze modellen kunnen worden onderhouden in een multi-well formaat en tegelijkertijd worden gevolgd voor seriële analyse in high-content beeldvormingssystemen die zijn ontwikkeld voor screening van kleine moleculen. Dit produceert een eenvoudig menselijk experimenteel platform om medicijneffecten te testen over een duur die dichter bij die van patiënten ligt (weken of maanden) in plaats van de minuten die doorgaans worden gebruikt in toxicologische testen.
Het systeem kan worden uitgebreid om multiparametermetingen te leveren door GECI’s op te nemen met verschillende emissie-eigenschappen van groen tot bijna infrarood. Dergelijke experimenten vereisen goed excitatielicht en filtersets in het experimentele ontwerp om signalen gescheiden te houden. Brede toepassing in een context van geneesmiddelenscreening vereist robuuste en efficiënte analyseplatforms naast het verstrekken van geneesmiddelen. Hoewel het hier beschreven model zich richt op het gebruik van meerdere dynamische calciumindicatoren, kan dit worden gewijzigd in structurele markers van celvorm of -functie. Deze zijn meestal gemakkelijker te visualiseren omdat ze weinig beat-to-beat variabiliteit vertonen in vergelijking met de honderdvoudige variatie in intracellulaire calciumconcentratie. Deze benadering kan met name waardevol zijn voor zeldzame ziekten waarbij het iPSC-tussenproduct dat is afgeleid van patiënten alle genetische drivers en modifiers van een bepaalde aandoening kan bevatten die kunnen worden bewaard in een schaalbaar celmodel, waardoor de ontdekking van geneesmiddelen bij verschillende ziekten op basis van cellulaire fenotypen wordt vergemakkelijkt die onafhankelijk van het onderliggende biologische mechanisme kunnen worden gevisualiseerd, wat een uitdaging kan zijn om op te helderen.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken prof. Robert Campbell van de Universiteit van Tokio voor het delen van het materiaal en de waardevolle discussie; Dr. Chia-Lin Ho in Molecular Device voor technische ondersteuning.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |