הפרוטוקול הנוכחי מתאר בקרה ותצפית כל-אופטית של פעילות תאית מופעלת בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC (iPSC-CMs) לצורך בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה ובדיקות רעילות. מוצג כימות רב-פרמטרי של תבניות פנוטיפיות בזמן ובמרחב. ההשפעות ארוכות הטווח של סמים לאורך שעות, או מדידות עוקבות לאורך ימים, מודגמות.
הבנת האופן שבו תאים מעוררים פועלים בבריאות ובמחלות וכיצד התנהגות זו יכולה להשתנות על-ידי מולקולות קטנות או מניפולציה גנטית היא חשובה. ניתן לשלב מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs) עם חלונות פליטה מרובים (למשל, לתצפית בו-זמנית על אירועים תת-תאיים מובהקים) או להשתמש בהם ביישומים מורחבים עם מפעילים תלויי אור אחרים בתאים מעוררים (למשל, שילוב של בקרה אופטוגנטית מקודדת גנטית עם מחווני סידן תואמים ספקטרלית). גישות כאלה שימשו בנוירונים ראשוניים או בתאי גזע, קרדיומיוציטים ותאי בטא בלבלב. עם זאת, זה היה מאתגר להגדיל את התפוקה, או משך התצפית, של גישות כאלה בשל מגבלות של המכשירים, תוכנת הניתוח, ביצועי האינדיקטורים ויעילות העברת הגנים. כאן, GECI ירוק בעל ביצועים גבוהים, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), ו- GECI עם הסטה אדומה, K-GECO, משולבים עם בקרה אופטוגנטית כדי להשיג בקרה אופטית מלאה והדמיה של פעילות התאים בפורמט הדמיה בעל תפוקה גבוהה באמצעות מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה. מוצגים יישומים המדגימים בדיקת קרדיוטוקסיות ובדיקת תרופות פנוטיפית עם iPSC-CMs בריאים שמקורם בחולה. בנוסף, הערכות רב-פרמטריות המשתמשות בשילובים של וריאנטים ספקטרליים ומדדי זיקה לסידן (NIR-GECO, LAR-GECO ו-mtGCEPIA או Orai1-G-GECO) מוגבלות לתאים תאיים שונים מודגמות גם במודל iPSC-CM.
מודלים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) נחשבים לפתרון מבטיח ליעדי 3Rs (החלפה, הפחתה ועידון) שנקבעו למחקרים בבעלי חיים 1,2. קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC שימשו למידול מחלות ולגילוי תרופות, שכן הם מסכמים היבטים חיוניים של הביולוגיה האנושית3. הדמיית סידן, בדרך כלל עם צבעים כימיים, שימשה לתצפית על פעילות התאים לפני ואחרי טיפול תרופתי 4,5. עם זאת, בדיקות חישת סידן המבוססות על צבע כימי מעכבות ישירות את Na, K-ATPase ומשבשות את תפקוד התאים6. לפיכך, מעקב אחר אותם תאים לאורך שעות או ימים היה בעייתי כאשר נעשה שימוש בצבעים כימיים. כאן, מגוון של מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs)7,8,9,10 מנוצלים על פני ספקטרום רחב של עירור/פליטה וזיקת סידן כדי ליצור פלטפורמה לבדיקת רעילות לב המציעה מדידות רב-אברונים בזמן אמת על פני פרקי זמן ממושכים 11.
כדי להמשיך ולפתח את רעיון הסינון מבוסס הסידן בתפוקה גבוהה במודל iPSC-CM מעבר להקשר האקדמי שהוכח בעבר באמצעות כלים מקודדים גנטית לבקרה אופטית והדמיית סידן על ידי ביטוי משותף של מחוון סידן בהסטה אדומה, R-GECO או K-GECO עם כלי אופטוגנטי, ChR212,13, ערכות ויראליות מהמדף נוצרו. על ידי העברת ההדמיה למכשיר בעל תוכן גבוה המצויד במערכת מיקרופלואידית אוטומטית, צנרת חד-ערוצית של תוספת תרכובת מונחת בשכבות על גבי הדמיה של תאים חיים. לבסוף, שני ההיבטים החיוניים של מסלול הניסוי, עיבוד התמונה והניתוח משופרים ואוטומטיים.
כדי לבצע בהצלחה סינון בתפוקה גבוהה, האותות חייבים להיות מפוזרים באופן שווה על פני כלי התרבית, מה שמבטיח שניתן יהיה ליישם אזורי עניין (ROIs) שנבחרו באקראי באופן אוטומטי במהלך רכישת ההדמיה. למרות שמדדי סידן כימיים עומדים בקלות בדרישה זו, בדיקות מקודדות גנטית ייצרו באופן היסטורי טלאים, ולא יריעות, של אות המגבילים את השימוש בהם. השימוש במערכת התמרה נגיפית מספק רמות ביטויגבוהות של 27,28 ושווה ערך של אינדיקטורים מרובים בקרב תאי המטרה בהשוואה לשיטות טרנספקציה קונבנציונליות. סוגי תאים שונים עשויים לדרוש מקדמים שונים, וייתכן שבחירת מערכת העברת הגנים תצטרך להשתנות בהתאםל-29,30,31. במודלים של תאים הטרוגניים, יעילות ההתמרה וההבעה עשויה להיות שונה בסוגי תאים ספציפיים. מצד אחד, זה עשוי להגביל את היישום לתאים מסוימים, אבל התופעה יכולה להיות מנוצלת כדי להבחין בין תאים מסוימים במערכת תרבית משותפת32.
ההשפעה העיקרית של גישה זו היא השחרור ממערכת היחסים של אחד לאחד בין הנסיין לבין המדגם על ידי אוטומציה. בניסוי סטנדרטי מרובה בארות, לאיסוף נתונים בארבעה מיקומים בתוך באר אחת, אנו מעריכים שנדרשות כ-15 שעות במיקרוסקופ כדי לאסוף סרטונים של 30 שניות מצלחת של 96 בארות. במערכת האוטומטית, זה לוקח ~ 4 שעות. יתר על כן, ניתוח הנתונים באופן ידני לוקח הרבה יותר זמן מאשר רכישת נתונים. מערכת הניתוח המשמשת כאן מהירה בערך פי 200 מהמקבילה הידנית. התוצאה נטו היא זרימת עבודה משופרת וחיסכון גבוה בעלויות ובזמן.
בניגוד לקרדיומיוציטים ראשוניים עמוסים בצבעי סידן ששורדים בסדר שעות, GECIs המתבטאים ב-iPSC-CM באמצעות מערכות העברת נגיפים יכולים להניב אות במודל ניסיוני שחי כמה חודשים. מודלים אלה יכולים להישמר בפורמט רב-בארות ולעקוב אחריהם בו-זמנית לצורך ניתוח סדרתי במערכות הדמיה בעלות תוכן גבוה שפותחו לסינון מולקולות קטנות. זה מייצר פלטפורמה ניסויית אנושית פשוטה לבדיקת השפעות תרופות על פני משכי זמן קרובים יותר לאלה שחווים חולים (שבועות או חודשים) ולא את הדקות המשמשות בדרך כלל במבחני טוקסיקולוגיה.
ניתן להרחיב את המערכת כדי לספק מדידות מרובות פרמטרים על ידי הכללת GECIs עם תכונות פליטה ייחודיות מירוק ועד אינפרה-אדום קרוב. ניסויים כאלה דורשים אורות עירור נאותים וערכות סינון בתכנון הניסוי כדי לשמור על אותות נפרדים. יישום רחב בהקשר של סינון תרופות דורש פלטפורמות ניתוח חזקות ויעילות בנוסף לחלוקת תרופות. למרות שהמודל המתואר כאן מתמקד בשימוש במספר מדדי סידן דינמיים, ניתן לשנות זאת לסמנים מבניים של צורת התא או תפקודו. בדרך כלל קל יותר לדמיין אותם מכיוון שהם מראים שונות קטנה מפעימה לפעימה בהשוואה לשונות של פי מאה בריכוז הסידן התוך-תאי. גישה זו עשויה להיות בעלת ערך רב במיוחד עבור מחלות נדירות שבהן ה-iPSC הנגזר מחולים עשוי להכיל את כל המניעים הגנטיים והמשנים של מצב מסוים אשר ניתן לשמר במודל תא הניתן להרחבה, מה שמקל על גילוי תרופות במחלות שונות המבוססות על פנוטיפים תאיים שניתן לדמיין ללא תלות במנגנון הביולוגי הבסיסי אשר עשוי להיות מאתגר להבהיר.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לפרופ’ רוברט קמפבל מאוניברסיטת טוקיו על שיתוף החומר והדיון בעל הערך; ד”ר צ’יה-לין הו ב מכשיר מולקולרי לתמיכה טכנית.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |