Das vorliegende Protokoll beschreibt die rein optische Kontrolle und Beobachtung der ausgelösten zellulären Aktivität in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) für Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und Toxizitätstests. Multiparametrische Quantifizierung phänotypischer Muster in Zeit und Raum werden gezeigt. Langzeitwirkungen von Medikamenten über Stunden oder sequentielle Messungen über Tage werden nachgewiesen.
Es ist wichtig zu verstehen, wie erregbare Zellen in Gesundheit und Krankheit funktionieren und wie dieses Verhalten durch kleine Moleküle oder genetische Manipulation verändert werden kann. Gentechnisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) mit mehreren Emissionsfenstern können kombiniert (z. B. zur gleichzeitigen Beobachtung verschiedener subzellulärer Ereignisse) oder in erweiterten Anwendungen mit anderen lichtabhängigen Aktoren in erregbaren Zellen verwendet werden (z. B. Kombination genetisch kodierter optogenetischer Kontrolle mit spektral kompatiblen Kalziumindikatoren). Solche Ansätze wurden in primären oder Stammzell-abgeleiteten Neuronen, Kardiomyozyten und Pankreas-Beta-Zellen verwendet. Es war jedoch schwierig, den Durchsatz oder die Beobachtungsdauer solcher Ansätze aufgrund von Einschränkungen der Instrumente, der Analysesoftware, der Indikatorleistung und der Genabgabeeffizienz zu erhöhen. Hier werden ein hochleistungsfähiges grünes GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), und ein rotverschobenes GECI, K-GECO, mit optogenetischer Kontrolle kombiniert, um eine vollständig optische Kontrolle und Visualisierung der zellulären Aktivität in einem Hochdurchsatz-Bildgebungsformat mit einem High-Content-Imaging-System zu erreichen. Es werden Anwendungen gezeigt, die Kardiotoxizitätstests und phänotypisches Arzneimittelscreening mit gesunden und patientenabgeleiteten iPSC-CMs demonstrieren. Darüber hinaus werden multiparametrische Bewertungen mit Kombinationen von spektralen und Kalziumaffinitätsindikatorvarianten (NIR-GECO, LAR-GECO und mtGCEPIA oder Orai1-G-GECO) auf verschiedene zelluläre Kompartimente im iPSC-CM-Modell demonstriert.
Human-basierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete Modelle gelten als vielversprechende Lösung für die 3R-Ziele (Replacement, Reduction, and Refinement), die für Tierstudien festgelegt wurden 1,2. iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten wurden für die Krankheitsmodellierung und Wirkstoffforschung verwendet, da sie wesentliche Aspekte der menschlichen Biologie rekapitulieren3. Die Kalziumbildgebung, typischerweise mit chemischen Farbstoffen, wurde verwendet, um die zelluläre Aktivität vor und nach der medikamentösen Behandlung zu beobachten 4,5. Chemische Calcium-Sensorsonden auf Farbstoffbasis hemmen jedoch direkt die Na, K-ATPase und stören die zelluläre Funktion6. Daher war die Verfolgung derselben Zellen über Stunden oder Tage problematisch, wenn chemische Farbstoffe verwendet werden. Hier wird eine Reihe von genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs)7,8,9,10 über ein breites Anregungs-/Emissions- und Calciumaffinitätsspektrum verwendet, um eine Testplattform für kardiale Toxizität zu bilden, die Echtzeit-Multiorganellenmessungen über längere Zeiträume bietet 11.
Um das Hochdurchsatz-Calcium-basierte Screening-Konzept im iPSC-CM-Modell über den zuvor demonstrierten akademischen Kontext hinaus weiterzuentwickeln, wurden genetisch kodierte Werkzeuge für die optische Kontrolle und Kalziumbildgebung durch Co-Expression eines rotverschobenen Kalziumindikators, R-GECO oder K-GECO mit einem optogenetischen Werkzeug, ChR212,13, generiert. Durch den Übergang der Bildgebung in ein High-Content-Instrument, das mit einem automikrofluidischen System ausgestattet ist, wird das Einkanal-Pipettieren der Wirkstoffaddition auf die Lebendzellbildgebung geschichtet. Schließlich werden beide entscheidenden Aspekte des experimentellen Pfades, der Bildverarbeitung und der Analyse, verbessert und automatisiert.
Um ein Hochdurchsatz-Screening erfolgreich durchzuführen, müssen die Signale gleichmäßig über das Kulturgefäß verteilt werden, um sicherzustellen, dass zufällig ausgewählte Regionen von Interesse (ROIs) während der Bildgebungsaufnahme automatisch angewendet werden können. Obwohl chemische Kalziumindikatoren diese Anforderung leicht erfüllen, haben genetisch kodierte Sonden in der Vergangenheit eher Flecken als Blätter von Signalen produziert, die ihre Verwendung einschränken. Die Verwendung eines viralen Transduktionssystems liefert im Vergleich zu herkömmlichen Transfektionsmethoden hohe27,28 und äquivalente Expressionsniveaus mehrerer Indikatoren unter den Zielzellen. Verschiedene Zelltypen können unterschiedliche Promotoren erfordern, und die Wahl des Genabgabesystems muss möglicherweise entsprechend geändert werden 29,30,31. In heterogenen Zellmodellen können Transduktions- und Expressionseffizienz in bestimmten Zelltypen unterschiedlich sein. Einerseits kann dies die Anwendung auf bestimmte Zellen beschränken, aber das Phänomen kann ausgenutzt werden, um bestimmte Zellen in einem Kokultursystemzu unterscheiden 32.
Die Hauptwirkung dieses Ansatzes ist die Befreiung von der Eins-zu-Eins-Beziehung zwischen dem Experimentator und der Probe durch Automatisierung. In einem Standard-Multi-Well-Experiment, um Daten an vier Positionen innerhalb einer einzigen Vertiefung zu sammeln, schätzen wir, dass es am Mikroskop etwa 15 Stunden dauert, um 30-s-Videos von einer 96-Well-Platte zu sammeln. Im automatisierten System dauert dies ~4 h. Darüber hinaus dauert die manuelle Analyse der Daten weitaus länger als die Datenerfassung. Das hier verwendete Analysesystem ist etwa 200-mal schneller als das manuelle Äquivalent. Das Endergebnis ist ein verbesserter Workflow und hohe Kosten- und Zeiteinsparungen.
Im Gegensatz zu primären Kardiomyozyten, die mit Kalziumfarbstoffen beladen sind, die in der Größenordnung von Stunden überleben, können GECIs, die in iPSC-CMs über virale Verabreichungssysteme exprimiert werden, ein Signal in einem experimentellen Modell liefern, das einige Monate lebt. Diese Modelle können in einem Multi-Well-Format gepflegt und gleichzeitig für die Serienanalyse in High-Content-Bildgebungssystemen verfolgt werden, die für das Screening kleiner Moleküle entwickelt wurden. Dies führt zu einer einfachen experimentellen Plattform für den Menschen, um Arzneimittelwirkungen über Zeiträume zu testen, die näher an denen der Patienten liegen (Wochen oder Monate) und nicht über die Minuten, die typischerweise in toxikologischen Assays verwendet werden.
Das System kann erweitert werden, um Multiparametermessungen zu liefern, indem GECIs mit unterschiedlichen Emissionseigenschaften von Grün bis nahes Infrarot einbezogen werden. Solche Experimente erfordern geeignete Anregungslicht- und Filtersätze im experimentellen Design, um Signale getrennt zu halten. Eine breite Anwendung im Kontext des Drogenscreenings erfordert neben der Medikamentenabgabe robuste und effiziente Analyseplattformen. Obwohl sich das hier beschriebene Modell auf die Verwendung mehrerer dynamischer Kalziumindikatoren konzentriert, könnte dies zu strukturellen Markern der Zellform oder -funktion modifiziert werden. Diese sind in der Regel leichter zu visualisieren, da sie im Vergleich zur hundertfachen Variation der intrazellulären Kalziumkonzentration eine geringe Beat-to-Beat-Variabilität aufweisen. Dieser Ansatz kann besonders wertvoll für seltene Krankheiten sein, bei denen das von Patienten abgeleitete iPSC-Zwischenprodukt alle genetischen Treiber und Modifikatoren einer bestimmten Erkrankung enthalten kann, die in einem skalierbaren Zellmodell konserviert werden können, was die Arzneimittelentdeckung bei verschiedenen Krankheiten auf der Grundlage zellulärer Phänotypen erleichtert, die unabhängig vom zugrunde liegenden biologischen Mechanismus visualisiert werden können, der schwierig aufzuklären sein kann.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Prof. Robert Campbell von der Universität Tokio für das Teilen des Materials und der wertvollen Diskussion. Dr. Chia-Lin Ho in Molecular Device für technische Unterstützung.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |