El presente protocolo describe el control totalmente óptico y la observación de la actividad celular desencadenada en cardiomiocitos derivados de iPSC (iPSC-CM) para la detección de fármacos de alto rendimiento y pruebas de toxicidad. Se muestra la cuantificación multiparamétrica de patrones fenotípicos en el tiempo y el espacio. Se demuestran los efectos a largo plazo de los medicamentos durante horas, o mediciones secuenciales durante días.
Es importante comprender cómo funcionan las células excitables en la salud y la enfermedad y cómo ese comportamiento puede ser alterado por moléculas pequeñas o manipulación genética. Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) con múltiples ventanas de emisión pueden combinarse (por ejemplo, para la observación simultánea de distintos eventos subcelulares) o usarse en aplicaciones extendidas con otros actuadores dependientes de la luz en células excitables (por ejemplo, combinando control optogenético codificado genéticamente con indicadores de calcio espectralmente compatibles). Tales enfoques se han utilizado en neuronas primarias o derivadas de células madre, cardiomiocitos y células beta pancreáticas. Sin embargo, ha sido difícil aumentar el rendimiento, o la duración de la observación, de tales enfoques debido a las limitaciones de los instrumentos, el software de análisis, el rendimiento de los indicadores y la eficiencia de la entrega de genes. Aquí, un GECI verde de alto rendimiento, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) y GECI CON DESPLAZAMIENTO AL ROJO, K-GECO, se combina con el control optogenético para lograr un control totalmente óptico y la visualización de la actividad celular en un formato de imágenes de alto rendimiento utilizando un sistema de imágenes de alto contenido. Se muestran las aplicaciones que demuestran pruebas de cardiotoxicidad y detección fenotípica de fármacos con iPSC-CM sanos y derivados del paciente. Además, las evaluaciones multiparamétricas utilizando combinaciones de variantes espectrales e indicadores de afinidad cálcica (NIR-GECO, LAR-GECO y mtGCEPIA u Orai1-G-GECO) también se delimitan a diferentes compartimentos celulares y también se demuestran en el modelo iPSC-CM.
Los modelos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de origen humano se consideran una solución prometedora para los objetivos de las 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento) establecidos para los estudios en animales 1,2. Los cardiomiocitos derivados de iPSC se han utilizado para el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos, ya que recapitulan aspectos esenciales de la biología humana3. La imagen de calcio, típicamente con colorantes químicos, ha sido utilizada para observar la actividad celular antes y después del tratamiento farmacológico 4,5. Sin embargo, las sondas sensibles al calcio basadas en colorantes químicos inhiben directamente la Na, K-ATPasa e interrumpen la función celular6. Por lo tanto, el seguimiento de las mismas células durante horas o días ha sido problemático cuando se utilizan tintes químicos. Aquí, una gama de indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs)7,8,9,10 se utilizan en un amplio espectro de excitación/emisión y afinidad de calcio para formar una plataforma de pruebas de toxicidad cardíaca que ofrece mediciones de múltiples orgánulos en tiempo real durante largos períodos de tiempo 11.
Para desarrollar aún más el concepto de cribado basado en calcio de alto rendimiento en el modelo iPSC-CM más allá del contexto académico previamente demostrado utilizando herramientas codificadas genéticamente para el control óptico y las imágenes de calcio mediante la coexpresión de un indicador de calcio desplazado al rojo, R-GECO o K-GECO con una herramienta optogenética, se han generado kits virales listos para usar ChR212,13. Al hacer la transición de las imágenes a un instrumento de alto contenido equipado con un sistema automicrofluídico, el pipeteo de un solo canal de adición de compuestos se superpone a las imágenes de células vivas. Finalmente, ambos aspectos cruciales de la vía experimental, el procesamiento de imágenes y el análisis se mejoran y automatizan.
Para realizar con éxito el cribado de alto rendimiento, las señales deben distribuirse uniformemente en todo el recipiente de cultivo, lo que garantiza que las regiones de interés (ROI) seleccionadas al azar se puedan aplicar automáticamente durante la adquisición de imágenes. Aunque los indicadores químicos de calcio cumplen fácilmente con este requisito, las sondas codificadas genéticamente han producido históricamente parches, en lugar de hojas, de señal que limitan su uso. El uso de un sistema de transducción viral proporciona altos niveles de expresión de27,28 y equivalentes de múltiples indicadores entre las células diana en comparación con los métodos de transfección convencionales. Diferentes tipos de células pueden requerir diferentes promotores, y la elección del sistema de administración de genes puede necesitar cambiar en consecuencia 29,30,31. En modelos celulares heterogéneos, la transducción y la eficiencia de expresión pueden ser diferentes en tipos celulares específicos. Por un lado, esto puede limitar la aplicación a células particulares, pero el fenómeno puede ser explotado para distinguir células particulares en un sistema de cocultivo32.
El principal impacto de este enfoque es la liberación de la relación uno a uno entre el experimentador y la muestra mediante la automatización. En un experimento estándar de múltiples pozos, para recopilar datos en cuatro posiciones dentro de un solo pozo, estimamos que se necesitan aproximadamente 15 h en el microscopio para recopilar videos de 30 s de una placa de 96 pocillos. En el sistema automatizado, esto toma ~ 4 h. Además, el análisis manual de los datos lleva mucho más tiempo que la adquisición de datos. El sistema de análisis utilizado aquí es aproximadamente 200 veces más rápido que el equivalente manual. El resultado neto es un flujo de trabajo mejorado y un alto ahorro de costos y tiempo.
A diferencia de los cardiomiocitos primarios cargados con colorantes de calcio que sobreviven en el orden de horas, los GECI expresados en iPSC-CM a través de sistemas de administración viral pueden producir una señal en un modelo experimental que vive durante unos pocos meses. Estos modelos pueden mantenerse en un formato de múltiples pocillos y rastrearse simultáneamente para el análisis en serie en sistemas de imágenes de alto contenido desarrollados para el cribado de moléculas pequeñas. Esto produce una plataforma experimental humana simple para probar los efectos de los medicamentos en duraciones más cercanas a las experimentadas por los pacientes (semanas o meses) en lugar de los minutos típicamente utilizados en los ensayos de toxicología.
El sistema se puede ampliar para ofrecer mediciones multiparamétricas mediante la inclusión de GECI con distintas propiedades de emisión desde el verde hasta el infrarrojo cercano. Tales experimentos requieren luz de excitación adecuada y conjuntos de filtros en el diseño experimental para mantener las señales separadas. La amplia aplicación en un contexto de detección de drogas requiere plataformas de análisis robustas y eficientes, además de la dispensación de drogas. Aunque el modelo descrito aquí se centra en el uso de múltiples indicadores dinámicos de calcio, esto podría modificarse a marcadores estructurales de forma o función celular. Estos son típicamente más fáciles de visualizar, ya que muestran poca variabilidad latido a latido en comparación con la variación de cien veces en la concentración de calcio intracelular. Este enfoque puede ser particularmente valioso para enfermedades raras donde el intermediario iPSC derivado de pacientes puede contener todos los impulsores y modificadores genéticos de una condición particular que pueden preservarse en un modelo celular escalable, facilitando el descubrimiento de fármacos en diversas enfermedades basadas en fenotipos celulares que se pueden visualizar independientemente del mecanismo biológico subyacente que puede ser difícil de dilucidar.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Prof. Robert Campbell de la Universidad de Tokio por compartir el material y la valiosa discusión; Dr. Chia-Lin Ho en Dispositivo Molecular para soporte técnico.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |