본 프로토콜은 고처리량 약물 스크리닝 및 독성 테스트를 위해 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)에서 유발된 세포 활성의 전광학 제어 및 관찰을 설명합니다. 시간과 공간에서의 표현형 패턴의 다중 모수적 정량화가 도시된다. 몇 시간에 걸친 약물의 장기적인 효과 또는 며칠에 걸친 순차적 측정이 입증되었습니다.
흥분성 세포가 건강과 질병에서 어떻게 작용하는지, 그리고 그 행동이 작은 분자 또는 유전자 조작에 의해 어떻게 바뀔 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다. 다중 방출 창을 갖는 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약(GECI)은 결합되거나(예를 들어, 별개의 세포하 사건의 동시 관찰을 위해) 흥분성 세포의 다른 광 의존적 액추에이터와 함께 확장된 애플리케이션에 사용될 수 있다(예를 들어, 유전적으로 암호화된 광유전학적 제어와 스펙트럼 호환 칼슘 지시약의 결합). 이러한 접근법은 일차 또는 줄기 세포 유래 뉴런, 심근 세포 및 췌장 베타 세포에서 사용되었습니다. 그러나 기기, 분석 소프트웨어, 지표 성능 및 유전자 전달 효율성의 한계로 인해 이러한 접근 방식의 처리량 또는 관찰 기간을 늘리는 것은 어려웠습니다. 여기에서 고성능 녹색 GECI, mNeonGreen-GECO(mNG-GECO) 및 적색 편이 GECI, K-GECO가 광유전학적 제어와 결합되어 고콘텐츠 이미징 시스템을 사용하여 고처리량 이미징 형식으로 세포 활동의 모든 광학 제어 및 시각화를 달성합니다. 건강한 환자 유래 iPSC-CM을 사용한 심장 독성 테스트 및 표현형 약물 스크리닝을 입증하는 응용 프로그램이 표시됩니다. 또한, 스펙트럼 및 칼슘 친화성 지표 변이체(NIR-GECO, LAR-GECO, 및 mtGCEPIA 또는 Orai1-G-GECO)의 조합을 사용하는 다중 파라미터 평가도 iPSC-CM 모델에서 입증됩니다.
인간 기반 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 모델은 동물 연구1,2에 대해 설정된 3R 목표(대체, 감소 및 정제)에 대한 유망한 솔루션으로 간주됩니다. iPSC 유래 심근 세포는 인간 생물학의 필수 측면을 요약하기 때문에 질병 모델링 및 약물 발견에 사용되었습니다3. 일반적으로 화학 염료를 사용하는 칼슘 영상은 약물 치료 전후의 세포 활동을 관찰하는 데 사용되었습니다 4,5. 그러나 화학 염료 기반 칼슘 감지 프로브는 Na, K-ATPase를 직접 억제하고 세포 기능을 방해합니다6. 따라서 화학 염료를 사용할 때 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 동일한 세포를 추적하는 것이 문제가되었습니다. 여기에서 유전적으로 암호화된 다양한 칼슘 지표(GECI)7,8,9,10이 광범위한 여기/방출 및 칼슘 친화성 스펙트럼에 걸쳐 활용되어 장기간에 걸쳐 실시간 다중 세포 기관 측정을 제공하는 심장 독성 테스트 플랫폼을 형성합니다11.
적색 편이 칼슘 지표 R-GECO 또는 K-GECO와 광유전학 도구 ChR212,13의 공동 발현에 의한 광학 제어 및 칼슘 이미징을 위한 유전적으로 암호화된 도구를 사용하여 이전에 입증된 학문적 맥락을 넘어 iPSC-CM 모델에서 고처리량 칼슘 기반 스크리닝 개념을 더욱 발전시키기 위해 기성품 바이러스 키트가 생성되었습니다. 이미징을 자동 미세유체 시스템이 장착된 고함량 기기로 전환함으로써 화합물 첨가의 단일 채널 피펫팅이 라이브 셀 이미징 위에 계층화됩니다. 마지막으로, 실험 경로, 이미지 처리 및 분석의 두 가지 중요한 측면이 모두 개선되고 자동화됩니다.
고처리량 스크리닝을 성공적으로 수행하려면 신호가 배양 용기 전체에 고르게 분포되어 이미징 획득 중에 무작위로 선택된 관심 영역(ROI)이 자동으로 적용될 수 있어야 합니다. 화학적 칼슘 지표는 이 요구 사항을 쉽게 충족하지만 유전적으로 암호화된 프로브는 역사적으로 사용을 제한하는 신호 시트가 아닌 패치를 생성했습니다. 바이러스 형질도입 시스템의 사용은 종래의 형질주입 방법에 비해 표적 세포 사이에서 다중 지표의 높은27,28 및 동등한 발현 수준을 제공한다. 상이한 세포 유형은 상이한 프로모터를 필요로 할 수 있고, 유전자 전달 시스템의 선택은 그에 따라 변경될 필요가 있을 수 있다(29,30,31). 불균질 세포 모델에서, 형질도입 및 발현 효율은 특정 세포 유형에서 상이할 수 있다. 한편으로, 이것은 특정 세포에 대한 적용을 제한할 수 있지만, 이 현상은 공동배양 시스템(32)에서 특정 세포를 구별하기 위해 이용될 수 있다.
이 접근법의 주요 영향은 자동화를 통해 실험자와 샘플 간의 일대일 관계에서 해방된다는 것입니다. 표준 다중 웰 실험에서 단일 웰 내의 4개 위치에서 데이터를 수집하기 위해 현미경으로 96웰 플레이트에서 30초 비디오를 수집하는 데 약 15시간이 걸린다고 추정합니다. 자동화 시스템에서는 ~ 4 시간이 걸립니다. 또한 데이터를 수동으로 분석하는 것은 데이터 수집보다 훨씬 오래 걸립니다. 여기에 사용 된 분석 시스템은 수동 시스템보다 약 200 배 빠릅니다. 결과적으로 워크플로가 개선되고 비용과 시간이 크게 절약됩니다.
칼슘 염료가 적재 된 1 차 심근 세포가 몇 시간 동안 생존하는 것과는 달리, 바이러스 전달 시스템을 통해 iPSC-CM에서 발현 된 GECI는 몇 달 동안 지속되는 실험 모델에서 신호를 생성 할 수 있습니다. 이러한 모델은 멀티 웰 형식으로 유지 관리될 수 있으며 소분자 스크리닝을 위해 개발된 고함량 이미징 시스템에서 직렬 분석을 위해 동시에 추적할 수 있습니다. 이는 독성 분석에 일반적으로 사용되는 시간(몇 분 또는 몇 달)이 아닌 환자가 경험하는 기간(몇 주 또는 몇 달)에 더 가까운 기간 동안 약물 효과를 테스트할 수 있는 간단한 인간 실험 플랫폼을 생성합니다.
이 시스템은 녹색에서 근적외선까지 뚜렷한 방출 특성을 가진 GECI를 포함하여 다중 파라미터 측정을 제공하도록 확장할 수 있습니다. 이러한 실험에는 신호를 별도로 유지하기 위해 실험 설계에서 적절한 여기광과 필터 세트가 필요합니다. 약물 스크리닝 맥락에서 광범위하게 적용하려면 약물 분주 외에도 강력하고 효율적인 분석 플랫폼이 필요합니다. 여기에 설명된 모델은 여러 동적 칼슘 지표의 사용에 초점을 맞추고 있지만 이는 세포 형태 또는 기능의 구조적 마커로 수정될 수 있습니다. 이들은 일반적으로 세포 내 칼슘 농도의 100 배 변동에 비해 비트 간 변동성이 거의 없기 때문에 시각화하기가 더 쉽습니다. 이 접근법은 환자로부터 유래된 iPSC 중간체가 확장 가능한 세포 모델에서 보존될 수 있는 특정 상태의 모든 유전적 동인 및 변형자를 포함할 수 있는 희귀 질환에 특히 유용할 수 있으며, 해명하기 어려울 수 있는 토대 생물학적 메커니즘과 독립적으로 시각화할 수 있는 세포 표현형을 기반으로 다양한 질병에서 약물 발견을 용이하게 합니다.
The authors have nothing to disclose.
자료와 귀중한 토론을 공유해 주신 도쿄 대학의 Robert Campbell 교수에게 감사드립니다. 기술 지원을 위한 분자 장치의 Chia-Lin Ho 박사.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |