Den nuværende protokol beskriver optisk kontrol og observation af udløst cellulær aktivitet i iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM’er) til screening af lægemidler med høj kapacitet og toksicitetstest. Multi-parametrisk kvantificering af fænotypiske mønstre i tid og rum vises. Langtidsvirkninger af lægemidler over timer eller sekventielle målinger over dage demonstreres.
Det er vigtigt at forstå, hvordan spændende celler fungerer i sundhed og sygdom, og hvordan denne adfærd kan ændres af små molekyler eller genetisk manipulation. Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er) med flere emissionsvinduer kan kombineres (f.eks. til samtidig observation af forskellige subcellulære hændelser) eller anvendes i udvidede applikationer med andre lysafhængige aktuatorer i excitable celler (f.eks. ved at kombinere genetisk kodet optogenetisk kontrol med spektralt kompatible calciumindikatorer). Sådanne tilgange er blevet anvendt i primære eller stamcelleafledte neuroner, kardiomyocytter og betaceller i bugspytkirtlen. Det har imidlertid været udfordrende at øge gennemstrømningen eller varigheden af observationen af sådanne tilgange på grund af begrænsninger i instrumenterne, analysesoftwaren, indikatorydelsen og genleveringseffektiviteten. Her kombineres en højtydende grøn GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) og rødforskudt GECI, K-GECO, med optogenetisk kontrol for at opnå optisk kontrol og visualisering af cellulær aktivitet i et billeddannelsesformat med høj kapacitet ved hjælp af et billeddannelsessystem med højt indhold. Applikationer, der demonstrerer kardiotoksicitetstest og fænotypisk lægemiddelscreening med sunde og patientafledte iPSC-CM’er, vises. Derudover er multiparametriske vurderinger ved hjælp af kombinationer af spektral- og calciumaffinitetsindikatorvarianter (NIR-GECO, LAR-GECO og mtGCEPIA eller Orai1-G-GECO) også begrænset til forskellige cellulære rum demonstreret i iPSC-CM-modellen.
Human-baserede inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte modeller betragtes som en lovende løsning på 3R-målene (Replacement, Reduction, and Refinement), der er fastsat for dyreforsøg 1,2. iPSC-afledte kardiomyocytter er blevet brugt til sygdomsmodellering og lægemiddelopdagelse, da de rekapitulerer væsentlige aspekter af menneskelig biologi3. Calciumbilleddannelse, typisk med kemiske farvestoffer, er blevet brugt til at observere cellulær aktivitet før og efter lægemiddelbehandling 4,5. Imidlertid hæmmer kemiske farvestofbaserede calciumfølende sonder direkte Na, K-ATPase og forstyrrer cellulær funktion6. Således har sporing af de samme celler over timer eller dage været problematisk, når kemiske farvestoffer anvendes. Her anvendes en række genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er) 7,8,9,10 på tværs af et bredt excitations-/emissions- og calciumaffinitetsspektrum til at danne en testplatform for hjertetoksicitet, der tilbyder multiorganellemålinger i realtid over længere perioder 11.
For at videreudvikle det calciumbaserede screeningskoncept med høj kapacitet i iPSC-CM-modellen ud over den tidligere demonstrerede akademiske kontekst ved hjælp af genetisk kodede værktøjer til optisk kontrol og calciumbilleddannelse ved co-ekspression af en rødforskudt calciumindikator, R-GECO eller K-GECO med et optogenetisk værktøj, ChR212,13, er der genereret virale sæt fra hylden. Ved at overføre billeddannelse til et instrument med højt indhold udstyret med et automikrofluidisk system lægges enkeltkanals pipettering af sammensat tilsætning oven på levende cellebilleddannelse. Endelig forbedres og automatiseres begge afgørende aspekter af den eksperimentelle vej, billedbehandling og analyse.
For at kunne udføre screening med høj kapacitet skal signaler fordeles jævnt over kulturbeholderen, hvilket garanterer, at tilfældigt udvalgte interesseområder (ROI’er) kan anvendes automatisk under billeddannelse. Selvom kemiske calciumindikatorer let opfylder dette krav, har genetisk kodede sonder historisk produceret pletter snarere end ark af signal, der begrænser deres anvendelse. Brugen af et viralt transduktionssystem giver høje27,28 og ækvivalente ekspressionsniveauer af flere indikatorer blandt målcellerne sammenlignet med konventionelle transfektionsmetoder. Forskellige celletyper kan kræve forskellige promotorer, og valget af genleveringssystem skal muligvis ændres i overensstemmelse hermed 29,30,31. I heterogene cellemodeller kan transduktions- og ekspressionseffektivitet være forskellig i specifikke celletyper. På den ene side kan dette begrænse anvendelsen til bestemte celler, men fænomenet kan udnyttes til at skelne bestemte celler i et samkultursystem32.
Hovedvirkningen af denne tilgang er frigørelsen fra en-til-en-forholdet mellem eksperimentatoren og prøven ved automatisering. I et standard multi-well eksperiment, for at indsamle data på fire positioner inden for en enkelt brønd, anslår vi, at det tager cirka 15 timer ved mikroskopet at indsamle 30 s videoer fra en 96 brøndplade. I det automatiserede system tager dette ~ 4 timer. Desuden tager analyse af data manuelt langt længere tid end dataindsamling. Analysesystemet, der anvendes her, er ca. 200 gange hurtigere end den manuelle ækvivalent. Nettoresultatet er en forbedret arbejdsgang og høje omkostnings- og tidsbesparelser.
I modsætning til primære kardiomyocytter fyldt med calciumfarvestoffer, der overlever i rækkefølgen af timer, kan GECI’er udtrykt i iPSC-CM’er via virale leveringssystemer give et signal i en eksperimentel model, der lever i et par måneder. Disse modeller kan vedligeholdes i et multi-brøndformat og spores samtidigt til seriel analyse i billeddannelsessystemer med højt indhold udviklet til screening af små molekyler. Dette producerer en simpel human eksperimentel platform til at teste lægemiddeleffekter over varigheder tættere på dem, der opleves af patienter (uger eller måneder) snarere end de minutter, der typisk anvendes i toksikologiske assays.
Systemet kan udvides til at levere multiparametermålinger ved at inkludere GECI’er med forskellige emissionsegenskaber fra grøn til nær infrarød. Sådanne eksperimenter kræver korrekt excitationslys og filtersæt i det eksperimentelle design for at holde signaler adskilt. Bred anvendelse i en lægemiddelscreeningskontekst kræver robuste og effektive analyseplatforme ud over lægemiddeldispensering. Selvom den model, der er beskrevet her, fokuserer på brugen af flere dynamiske calciumindikatorer, kan dette ændres til strukturelle markører for celleform eller funktion. Disse er typisk lettere at visualisere, da de viser lidt beat-to-beat variabilitet sammenlignet med den hundrede gange variation i intracellulær calciumkoncentration. Denne tilgang kan være særlig værdifuld for sjældne sygdomme, hvor iPSC-mellemproduktet afledt af patienter kan indeholde alle de genetiske drivkræfter og modifikatorer af en bestemt tilstand, som kan bevares i en skalerbar cellemodel, hvilket letter lægemiddelopdagelse i forskellige sygdomme baseret på cellulære fænotyper, der kan visualiseres uafhængigt af den underliggende biologiske mekanisme, som kan være udfordrende at belyse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Robert Campbell ved University of Tokyo for at dele materialet og værdifulde diskussion; Dr. Chia-Lin Ho i Molecular Device til teknisk support.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |