Denne protokollen beskriver all-optisk kontroll og observasjon av utløst cellulær aktivitet i iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) for høy gjennomstrømning narkotika screening og toksisitetstesting. Multiparametrisk kvantifisering av fenotypiske mønstre i tid og rom er vist. Langtidseffekter av legemidler over timer, eller sekvensielle målinger over dager, er demonstrert.
Å forstå hvordan spennende celler fungerer i helse og sykdom, og hvordan den oppførselen kan endres av små molekyler eller genetisk manipulasjon er viktig. Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) med flere emisjonsvinduer kan kombineres (f.eks. for samtidig observasjon av distinkte subcellulære hendelser) eller brukes i utvidede applikasjoner med andre lysavhengige aktuatorer i spennende celler (f.eks. kombinere genetisk kodet optogenetisk kontroll med spektralt kompatible kalsiumindikatorer). Slike tilnærminger har blitt brukt i primære eller stamcelleavledede nevroner, kardiomyocytter og beta-celler i bukspyttkjertelen. Det har imidlertid vært utfordrende å øke gjennomstrømningen, eller varigheten av observasjon, av slike tilnærminger på grunn av begrensninger i instrumentene, analyseprogramvare, indikatorytelse og genleveringseffektivitet. Her kombineres en høyytelses grønn GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) og rødforskjøvet GECI, K-GECO, med optogenetisk kontroll for å oppnå all-optisk kontroll og visualisering av cellulær aktivitet i et bildeformat med høy gjennomstrømning ved hjelp av et High-Content Imaging System. Søknader som demonstrerer kardiotoksisitetstesting og fenotypisk legemiddelscreening med friske og pasientavledede iPSC-CM-er er vist. I tillegg er multiparametriske vurderinger ved bruk av kombinasjoner av spektral- og kalsiumaffinitetsindikatorvarianter (NIR-GECO, LAR-GECO og mtGCEPIA eller Orai1-G-GECO) begrenset til forskjellige cellulære rom også demonstrert i iPSC-CM-modellen.
Human-based induced pluripotent stem cells (iPSC)-avledede modeller anses som en lovende løsning på 3R-målene (Replacement, Reduction, and Refinement) som er angitt for dyreforsøk 1,2. iPSC-avledede kardiomyocytter har blitt brukt til sykdomsmodellering og legemiddeloppdagelse når de rekapitulerer viktige aspekter ved menneskelig biologi3. Kalsiumavbildning, vanligvis med kjemiske fargestoffer, har blitt brukt til å observere cellulær aktivitet før og etter medikamentell behandling 4,5. Imidlertid hemmer kjemiske fargestoffbaserte kalsiumfølerprober direkte Na, K-ATPase og forstyrrer cellulær funksjon6. Dermed har sporing av de samme cellene over timer eller dager vært problematisk når kjemiske fargestoffer brukes. Her benyttes en rekke genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer)7,8,9,10 over et bredt eksitasjons- / utslipps- og kalsiumaffinitetsspekter for å danne en plattform for testing av hjertetoksisitet som tilbyr sanntids multiorganelle målinger over lengre tidsperioder 11.
For å videreutvikle det kalsiumbaserte screeningkonseptet med høy gjennomstrømning i iPSC-CM-modellen utover den tidligere demonstrerte akademiske konteksten ved hjelp av genetisk kodede verktøy for optisk kontroll og kalsiumavbildning ved samuttrykk av en rødforskjøvet kalsiumindikator, R-GECO eller K-GECO med et optogenetisk verktøy, har ChR212,13, hyllevare virale sett blitt generert. Ved å overføre avbildning til et høyt innholdsinstrument utstyrt med et auto-mikrofluidisk system, blir enkanals pipettering av sammensatt tilsetning lagdelt på toppen av levende celleavbildning. Til slutt forbedres og automatiseres både viktige aspekter ved eksperimentell vei, bildebehandling og analyse.
For å kunne utføre screening med høy gjennomstrømning, må signalene fordeles jevnt over kulturfartøyet, noe som garanterer at tilfeldig utvalgte interesseområder (ROIer) kan brukes automatisk under bildeopptak. Selv om kjemiske kalsiumindikatorer lett oppfyller dette kravet, har genetisk kodede sonder historisk produsert patcher, i stedet for ark, av signal som begrenser bruken av dem. Bruken av et viralt transduksjonssystem gir høye27,28 og ekvivalente uttrykksnivåer av flere indikatorer blant målcellene sammenlignet med konvensjonelle transfeksjonsmetoder. Ulike celletyper kan kreve forskjellige promotorer, og valget av genleveringssystem må kanskje endres tilsvarende 29,30,31. I heterogene cellemodeller kan transduksjon og ekspresjonseffektivitet være forskjellig i spesifikke celletyper. På den ene siden kan dette begrense anvendelsen til bestemte celler, men fenomenet kan utnyttes til å skille bestemte celler i et samkultursystem32.
Hovedvirkningen av denne tilnærmingen er frigjøringen fra en-til-en-forholdet mellom eksperimentøren og prøven ved automatisering. I et standard flerbrønnseksperiment, for å samle inn data på fire posisjoner i en enkelt brønn, anslår vi at det tar omtrent 15 timer ved mikroskopet å samle 30 s-videoer fra en 96-brønnplate. I det automatiserte systemet tar dette ~ 4 timer. Videre tar analyse av dataene manuelt langt lengre tid enn datainnsamling. Analysesystemet som brukes her er omtrent 200 ganger raskere enn den manuelle ekvivalenten. Nettoresultatet er en forbedret arbeidsflyt og høye kostnads- og tidsbesparelser.
I motsetning til primære kardiomyocytter lastet med kalsiumfargestoffer som overlever i størrelsesorden timer, kan GECIer uttrykt i iPSC-CM via virale leveringssystemer gi et signal i en eksperimentell modell som lever i noen måneder. Disse modellene kan vedlikeholdes i et flerbrønnsformat og spores samtidig for seriell analyse i bildesystemer med høyt innhold utviklet for screening av små molekyler. Dette gir en enkel menneskelig eksperimentell plattform for å teste legemiddeleffekter over varigheter nærmere de som oppleves av pasienter (uker eller måneder) i stedet for minuttene som vanligvis brukes i toksikologiske analyser.
Systemet kan utvides til å levere multiparametermålinger ved å inkludere GECIer med distinkte utslippsegenskaper fra grønt til nær infrarødt. Slike eksperimenter krever riktig eksitasjonslys og filtersett i eksperimentell design for å holde signaler atskilt. Bred anvendelse i rusmiddelscreening krever robuste og effektive analyseplattformer i tillegg til legemiddelutlevering. Selv om modellen beskrevet her fokuserer på bruk av flere dynamiske kalsiumindikatorer, kan dette modifiseres til strukturelle markører for celleform eller funksjon. Disse er vanligvis lettere å visualisere da de viser liten beat-to-beat-variabilitet sammenlignet med den hundre ganger variasjonen i intracellulær kalsiumkonsentrasjon. Denne tilnærmingen kan være spesielt verdifull for sjeldne sykdommer der iPSC-intermediæret avledet fra pasienter kan inneholde alle genetiske drivere og modifikatorer av en bestemt tilstand som kan bevares i en skalerbar cellemodell, noe som letter legemiddeloppdagelse i ulike sykdommer basert på cellulære fenotyper som kan visualiseres uavhengig av den underliggende biologiske mekanismen som kan være utfordrende å belyse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Robert Campbell ved University of Tokyo for å dele materialet og verdifull diskusjon; Dr. Chia-Lin Ho i Molecular Device for teknisk støtte.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |