Durchführung der In-vivo- und Ex-vivo-Impedanz-Myographie bei Nagetieren
Summary
Dieser Artikel beschreibt, wie die elektrische Impedanzmyographie in vivo (unter Verwendung von Oberflächen- und Nadelelektrodenarrays) und ex vivo (unter Verwendung einer dielektrischen Zelle) am Musculus gastrocnemius von Nagetieren durchgeführt wird. Es wird die Technik sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten demonstrieren und die verfügbaren Modifikationen (z. B. fettleibige Tiere, Welpen) detailliert beschreiben.
Abstract
Die elektrische Impedanzmyographie (EIM) ist eine praktische Technik, die in präklinischen und klinischen Studien verwendet werden kann, um die Gesundheit und Krankheit des Muskelgewebes zu beurteilen. EIM wird erhalten, indem ein richtungsfokussierter elektrischer Strom niedriger Intensität an einen Muskel von Interesse über einen Frequenzbereich (d. h. von 1 kHz bis 10 MHz) angelegt und die resultierenden Spannungen aufgezeichnet werden. Aus diesen werden mehrere Standardimpedanzkomponenten, einschließlich Reaktanz, Widerstand und Phase, erhalten. Bei Ex-vivo-Messungen an ausgeschnittenen Muskeln können auch die inhärenten passiven elektrischen Eigenschaften des Gewebes, nämlich die Leitfähigkeit und die relative Dielektrizitätskonstante, berechnet werden. EIM wurde ausgiebig bei Tieren und Menschen eingesetzt, um Muskelveränderungen bei einer Vielzahl von Krankheiten zu diagnostizieren und zu verfolgen, in Bezug auf einfache Nichtgebrauchsatrophie oder als Maßnahme der therapeutischen Intervention. Klinisch bietet EIM das Potenzial, das Fortschreiten der Krankheit im Laufe der Zeit zu verfolgen und die Wirkung therapeutischer Interventionen zu bewerten, wodurch die Möglichkeit besteht, die Dauer klinischer Studien zu verkürzen und die Anforderungen an die Stichprobengröße zu reduzieren. Da EIM sowohl in lebenden Tiermodellen als auch beim Menschen nichtinvasiv oder minimalinvasiv durchgeführt werden kann, bietet es das Potenzial, als neuartiges translationales Werkzeug zu dienen, das sowohl die präklinische als auch die klinische Entwicklung ermöglicht. Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung von In-vivo- und Ex-vivo-EIM-Messungen an Mäusen und Ratten, einschließlich Ansätzen zur Anpassung der Techniken an bestimmte Bedingungen, z. B. zur Anwendung bei Welpen oder fettleibigen Tieren.
Introduction
Die elektrische Impedanzmyographie (EIM) bietet eine leistungsstarke Methode zur Beurteilung des Muskelzustands, die möglicherweise die Diagnose neuromuskulärer Erkrankungen, die Verfolgung des Krankheitsverlaufs und die Beurteilung des Ansprechens auf Therapie 1,2,3 ermöglicht. Es kann analog auf Tierkrankheitsmodelle und Menschen angewendet werden, was eine relativ nahtlose Übertragung von präklinischen zu klinischen Studien ermöglicht. EIM-Messungen werden leicht mit vier linear angeordneten Elektroden durchgeführt, wobei die beiden äußeren einen schmerzlosen, schwachen elektrischen Strom über einen Frequenzbereich (im Allgemeinen zwischen 1 kHz und etwa 2 MHz) und die beiden inneren die resultierenden Spannungen aufzeichnen1. Aus diesen Spannungen können die Impedanzeigenschaften des Gewebes gewonnen werden, einschließlich des Widerstands (R), ein Maß dafür, wie schwierig es ist, Strom durch das Gewebe zu fließen, und die Reaktanz (X) oder “Aufladbarkeit” des Gewebes, ein Maß für die Fähigkeit des Gewebes, Ladung zu speichern (Kapazität). Aus der Reaktanz und dem Widerstand wird der Phasenwinkel (θ) über die folgende Gleichung berechnet: 
, was ein einzelnes summatives Impedanzmaß ergibt. Solche Messungen können mit jedem Multifrequenz-Bioimpedanzgerät durchgeführt werden. Da Myofasern im Wesentlichen lange Zylinder sind, ist Muskelgewebe auch stark anisotrop, wobei der Strom leichter entlang der Fasern fließt als über sie 4,5. Daher wird EIM oft in zwei Richtungen durchgeführt: mit dem Array, das entlang der Fasern so platziert ist, dass der Strom parallel zu ihnen fließt, und durch den Muskel, so dass der Strom senkrecht zu ihnen fließt. Zusätzlich können bei Ex-vivo-Messungen, bei denen ein bekanntes Gewebevolumen in einer Impedanzmesszelle gemessen wird, die inhärenten elektrischen Eigenschaften des Muskels (d. h. Leitfähigkeit und relative Permittivität) abgeleitet werden6.
Der Begriff “neuromuskuläre Erkrankungen” definiert ein breites Spektrum von primären und sekundären Erkrankungen, die zu strukturellen Muskelveränderungen und Funktionsstörungen führen. Dazu gehören amyotrophe Lateralsklerose und verschiedene Formen der Muskeldystrophie sowie einfachere Veränderungen im Zusammenhang mit dem Altern (z. B. Sarkopenie), Nichtgebrauchsatrophie (z. B. aufgrund längerer Bettruhe oder Schwerelosigkeit) oder sogar Verletzungen7. Während die Ursachen zahlreich sind und vom Motoneuron, Nerven, neuromuskulären Verbindungen oder dem Muskel selbst ausgehen können, kann EIM verwendet werden, um frühe Veränderungen im Muskel aufgrund vieler dieser Prozesse zu erkennen und das Fortschreiten oder Ansprechen auf die Therapie zu verfolgen. Bei Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) wurde beispielsweise gezeigt, dass EIM das Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf Kortikosteroide erkennt8. Jüngste Arbeiten haben auch gezeigt, dass EIM empfindlich auf unterschiedliche Nichtnutzungszustände reagiert, einschließlich der fraktionierten Schwerkraft9, wie sie auf dem Mond oder Mars auftreten würde, und der Auswirkungen des Alterns10,11. Schließlich wird es durch die Anwendung von prädiktiven und maschinellen Lernalgorithmen auf den Datensatz, der mit jeder Messung erhalten wird (multifrequenz- und richtungsabhängige Daten), möglich, histologische Aspekte des Gewebes abzuleiten, einschließlich Myofasergröße 12,13, entzündliche Veränderungen und Ödeme14 sowie Bindegewebe und Fettgehalt 15,16.
Mehrere andere nichtinvasive oder minimalinvasive Methoden werden auch verwendet, um die Muskelgesundheit bei Menschen und Tieren zu bewerten, einschließlich der Nadelelektromyographie17 und bildgebender Verfahren wie Magnetresonanztomographie, Computertomographie und Ultraschall18,19. EIM zeigt jedoch deutliche Vorteile im Vergleich zu diesen Technologien. Zum Beispiel erfasst die Elektromyographie nur die aktiven elektrischen Eigenschaften der Myofasermembranen und nicht die passiven Eigenschaften und kann daher keine echte Beurteilung der Muskelzusammensetzung oder -struktur liefern. In gewisser Hinsicht sind bildgebende Verfahren enger mit EIM verwandt, da auch sie Aufschluss über die Struktur und Zusammensetzung von Gewebe geben. Aber in gewissem Sinne liefern sie zu viele Daten, die eine detaillierte Bildsegmentierung und Expertenanalyse erfordern, anstatt nur einen quantitativen Output zu liefern. Darüber hinaus werden bildgebende Verfahren aufgrund ihrer Komplexität auch stark von den Besonderheiten der verwendeten Hard- und Software beeinflusst, was im Idealfall die Verwendung identischer Systeme erfordert, damit Datensätze verglichen werden können. Im Gegensatz dazu bedeutet die Tatsache, dass EIM viel einfacher ist, dass es weniger von diesen technischen Problemen betroffen ist und keine Form von Bildverarbeitung oder Expertenanalyse erfordert.
Das folgende Protokoll zeigt, wie In-vivo-EIM bei Ratten und Mäusen durchgeführt wird, wobei sowohl nichtinvasive (Oberflächenarray) als auch minimalinvasive (subdermale Nadelarray) Techniken sowie ex vivo EIM an frisch herausgeschnittenen Muskeln angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel werden die grundlegenden Methoden zur Durchführung von EIM bei Nagetieren sowohl in vivo als auch ex vivo beschrieben. Um zuverlässige Messungen zu erhalten, ist es wichtig, eine Reihe von Schritten durchzuführen. Zuerst muss man den Muskel von Interesse richtig identifizieren, da jeder Muskel unterschiedliche Reaktionen auf Krankheiten, Behandlung und Pathologie hat. Man muss bedenken, dass die Daten, die über einen Muskel (z. B. Gastrocnemius) erfasst wurden, nicht die gleichen I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Charley’s Fund und NIH R01NS055099 unterstützt.
Materials
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system – investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal – 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
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