Summary
يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لتنفيذ إعطاء جرعة بلعة متعددة عن طريق الوريد ومراقبة الدورة الدموية الغازية في الفئران. يمكن للباحثين استخدام هذا البروتوكول لفحص المركب العلاجي المستقبلي لارتفاع ضغط الدم في الشريان الرئوي.
Abstract
ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH) هو مرض تدريجي يهدد الحياة ، ويؤثر بشكل أساسي على الشرايين الرئوية الصغيرة في الرئة. حاليا ، لا يوجد علاج ل PAH. من المهم اكتشاف مركبات جديدة يمكن استخدامها لعلاج PAH. نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الماوس هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لأبحاث PAH. يلخص هذا النموذج المظاهر السريرية البشرية لمرض PAH Group 3 وهو أداة بحثية مهمة لتقييم فعالية العلاجات التجريبية الجديدة ل PAH. غالبا ما يتطلب البحث باستخدام هذا النموذج إدارة المركبات في الفئران. بالنسبة للمركب الذي يجب إعطاؤه مباشرة في مجرى الدم ، يعد تحسين الإعطاء عن طريق الوريد (IV) جزءا أساسيا من الإجراءات التجريبية. من الناحية المثالية ، يجب أن يسمح نظام الحقن الوريدي بحقن متعددة خلال دورة زمنية محددة. على الرغم من أن نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران يحظى بشعبية كبيرة في العديد من المختبرات ، إلا أنه من الصعب تقنيا إجراء جرعات متعددة من البلعة الوريدية وتقييم الدورة الدموية الغازية في هذا النموذج. في هذا البروتوكول ، نقدم إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية إجراء جرعات متعددة من البلعة الوريدية عبر الوريد الوداجي للفأر وإجراء قسطرة البطين الشرياني والأيمن لتقييم الدورة الدموية في نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران.
Introduction
يتم تعريف ارتفاع ضغط الدم في الشريان الرئوي (PAH) من خلال متوسط الضغط الانقباضي للشريان الرئوي أكبر من 20 مم زئبق في الراحة 1,2. إنه مرض تدريجي ومميت يتميز بارتفاع مستمر في الضغط الشرياني الرئوي ، مما يؤدي إلى الحمل الزائد للبطين الأيمن والموت في النهاية بسبب فشل البطين الأيمن1. حاليا ، لا يوجد علاج ل PAH.
يعد استخدام النماذج الحيوانية لارتفاع ضغط الدم الرئوي أمرا مهما لاختبار فعالية علاجات PAH التجريبية. من بين هذه النماذج ، قدم نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران رؤى رئيسية حول تطور مرض PAH 3 البشري 3,4. غالبا ما يتطلب البحث باستخدام هذا النموذج إدارة المركبات في الفئران لتقييم فعالية المركب الجديد وسلامته. لذلك ، يحتاج الباحثون إلى إجراء تجريبي مفصل للجرعات المركبة وقياسات الدورة الدموية لضمان اتساق الحقن واستنساخ قياس ضغط الدم من البداية إلى النهاية.
تم الإبلاغ عن طرق الحقن في الوريد (IV) وقياس ضغط الدم في الأدبيات 5,6. ومع ذلك ، تفتقر المنهجية إلى التوضيح البصري والوصف التفصيلي. نوضح هنا الخطوات الرئيسية لحقن البلعة الوريدية الناجحة والقياس والتسجيل الدقيق لضغط الدم الجهازي والبطين الأيمن. تعد الإجراءات المعروضة هنا موردا مهما للباحثين المهتمين بالمسار الوريدي لمنصة الإدارة المركبة لتطوير علاج ل PAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل لجان رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ييل.
1. تحضير والأدوات ومعدات قياس ضغط الدم وغرفة نقص الأكسجة
- تأقلم.
ملاحظة: كانت التجارب المستخدمة في هذه الدراسة من ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع والتي تزن 25-27 جم. يجب مراعاة عدة عوامل عند تقدير عدد المطلوبة للتجربة ، بما في ذلك الوفيات المرتبطة بالجراحة ، والمضاعفات الجراحية غير المتوقعة ، والموت المفاجئ غير المتوقع. استخدم ما لا يقل عن 10 فئران لكل مجموعة للوصول إلى القوة الإحصائية وتجنب الدراسات الضعيفة.- عند الاستقبال ، قم بإيواء في أقفاص قوارض جيدة التهوية (مجموعات من خمسة لكل قفص) مزودة بفراش مناسب وتشاو القوارض والماء. دع تتأقلم مع البيئة الجديدة (دورة الضوء والظلام لمدة 12 ساعة عند 18-20 درجة مئوية) لمدة 3 أيام على الأقل.
- قم بتعيينهم عشوائيا إلى المجموعات التالية: Normoxia (المجموعة 1) ، نقص الأكسجة (المجموعة 2) ، ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA (المجموعة 3).
- إعداد الأدوات الجراحية ومعدات قياس ضغط الدم.
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم (الشكل 1 أ).
- قم بإعداد منصة حقن مؤقتة مع مخروط أنف تخدير محلي الصنع (الشكل 1 ب) ، وحزم خياطة (الشكل 1 ج) ، ومعدات لإجراء PAH (الشكل 1D-F).
- الإعداد التجريبي لتحريض ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PAH).
- اضبط خزان N2 ومستشعر الأكسجين وغرفة نقص الأكسجة شبه القابلة للإغلاق (الشكل 2 أ).
- قم بإنشاء نقطة ضبط بنسبة 10٪ O2 في مستشعر الأكسجين ودع النظام يصل إلى الحالة المستقرة (الشكل 2B ، C).
- الحفاظ على نقص الأكسجة (المجموعة 2) ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA (المجموعة 3) في نقص الأكسجة (10٪ O2) لمدة 3 أسابيع. بعد 3 أسابيع من نقص الأكسجة ، ضع تحت ظروف normoxic لمدة 1 أسبوع (الشكل 2D). تبقى مجموعة normoxic (المجموعة 1) في normoxia لمدة 4 أسابيع.
ملاحظة: (1) 3 أسابيع من نقص الأكسجة تليها أسبوع واحد من normoxia هي طريقة راسخة لتطوير PAH وفشل القلب البطين الأيمن7. يكتشف مستشعر الأكسجين تركيز O2 داخل غرفة نقص الأكسجة شبه القابلة للإغلاق ويصححها عن طريق ضخ غاز N2 عبر أنبوب ضخ الغاز. - فحص يوميا طوال مدة التجربة (3 أسابيع). استشر الطبيب البيطري إذا ظهرت على علامات الضيق مثل فقدان الوزن بشكل كبير وصعوبة التنفس. إذا كان القتل الرحيم ضروريا للحيوانات التي تعاني من ضائقة شديدة ، استبعد من الدراسة.
ملاحظة: التعرض لنقص الأكسجة يسبب فقدان وزن جسم الفأر. عادة ما يتم استخدام فقدان 10٪ من وزن الجسم كمؤشر موثوق لتطور PAH. - تجنب الفتح المكثف لغرفة نقص الأكسجة. لتنظيف القفص ، وتجديد الطعام ، وتغيير زجاجات المياه ، والإدارة المركبة ، افتح الغرف لمدة لا تزيد عن 1 ساعة في الأسبوع.
2. حقن البلعة الوريدية عن طريق الوريد الوداجي
- إعداد الماوس والتخدير.
- أخرج نقص الأكسجة (المجموعة 2) ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA (المجموعة 3) أقفاص الماوس من غرفة نقص الأكسجة وقم بإزالة برفق من القفص.
ملاحظة: نظام الجرعة ل 7C1 / let-7 miRNA (1.5 ملغ / كغ من الوريد / الجرعة) هو مرتين في الأسبوع لمدة 4 أسابيع من العلاج. يوصى بأن يأخذ الباحثون كلا من أقفاص نقص الأكسجة ونقص الأكسجة + العلاج المركب من غرفة نقص الأكسجة أثناء الحقن الوريدي للتأكد من أن جميع تتلقى نفس الحجم من التعرض لنقص الأكسجة في كل فترة زمنية. - وزن الماوس باستخدام مقياس دقيق وتسجيل وزنه (الشكل 3 أ).
- ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير المتصلة بجهاز تبخير التخدير وأغلقه (الشكل 3 ب). توفير الدعم الحراري وتطبيق مزلق العين على كلتا العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير. تعريض الماوس ل 3٪ إيزوفلوران حتى يفقد الوعي (الشكل 3C-D).
- أخرج الماوس من الحجرة وحلق الفراء من الفك الجمجمة إلى منتصف القص الذيلي. أفقيا ، احلق الفراء من زوايا الفك ، من خلال جانبي الرقبة ، ونحو الكتفين (الشكل 3E).
- ضع الفأر المخدر بالإيزوفلوران في وضع ضعيف (جانب البطن لأعلى) على منصة حقن أسفل مجهر التشريح. حافظ على التخدير عن طريق مخروط الأنف بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران وقم بتقييد الأرجل الأربعة برفق بشريط لاصق لشل حركة الجسم (الشكل 3F).
- ضع محفزا ضارا (أي قرصة إصبع القدم) باستخدام ملقط مستقيم لضمان مستوى مناسب من التخدير. يجب ألا يستجيب الفأر المخدر للتحفيز قبل وأثناء العملية الجراحية.
- أخرج نقص الأكسجة (المجموعة 2) ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA (المجموعة 3) أقفاص الماوس من غرفة نقص الأكسجة وقم بإزالة برفق من القفص.
- إعداد عامل الحقن.
- تحضير مركب حقن أحادي الجرعة بجرعة 1.5 ملغ/كغ تحت ظروف معقمة.
ملاحظة: قم بتسخين مركب الحقن إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لأن حقن المواد الباردة يمكن أن يسبب عدم الراحة وانخفاض درجة حرارة جسم الماوس (إذا كان هذا لا يضر المركب). تستند الجرعة المثلى ومدة المركب 7C1 / let-7 miRNA المستخدم في هذه الدراسة إلى المنشورات السابقة 8,9. - قم بتحميل المحقنة المعقمة ذات الاستخدام الواحد بالحجم المراد حقنه. امسك المحقنة في وضع مستقيم وادفع المكبس لطرد الهواء من المحقنة. لا تعيد استخدام المحقنة.
- الحد من حجم الحقن إلى 200 ميكرولتر في فأر 25 غرام للحد من حدوث تخفيف الدم والآثار القلبية غير الطبيعية على. إذا كانت هناك حاجة إلى حجم أكبر ، قسم مركب الحقن إلى حقنتين بفاصل 10 دقائق.
- تحضير مركب حقن أحادي الجرعة بجرعة 1.5 ملغ/كغ تحت ظروف معقمة.
- تحضير الماوس للحقن الوريدي.
- افرك المنطقة الجراحية برفق ثلاث مرات بثلاث جولات متناوبة من محلول البوفيدون واليود و 70٪ إيثانول. تطبيق البوبرينورفين (0.05 ملغ/ كغ، SQ) قبل 30 دقيقة من العملية الجراحية.
- قم بعمل قطع طولي 0.5 سم قليلا على يمين خط الوسط من الرقبة باستخدام شفرة مشرط (الشكل 3G).
- استخدم الملقط لفصل العضلات والأنسجة الدهنية لتحديد موقع الوريد الوداجي الخارجي الأيمن (الشكل 3H).
ملاحظة: قم بتدوير مواقع الحقن في كل مرة لتجنب تكوين ندبة. - استخدم عدسة موضوعية عالية الطاقة للسماح بتصور سهل لمنطقة الحقن (الشكل 3I).
- الحقن الوريدي
- أدخل إبرة معقمة 28 جم في الوريد الوداجي مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى (الشكل 3J ، K).
ملاحظة: حقن الوريد الذيل هو بديل لحقن الوريد الوداجي. ومع ذلك ، يصعب تنفيذ هذه التقنية للجرعات المتكررة بسبب التباين في عمق الوريد ولون جلد ذيل الفئران وصلابة الجلد. - اضغط ببطء على مكبس المحقنة لحقن المركب في الوريد. اترك الإبرة تبقى داخل الوريد لمدة 10 ثوان إضافية لمنع ارتجاع الحاقن (الشكل 3L).
ملاحظة: تسمح الصبغة المزرقة بتصور سهل للحقن. لا تقم بتضمين الصبغة عند حقن مواد الاختبار. سيؤدي الحقن غير الدقيق إلى تراكم صبغة مزرقة حول موقع الحقن الوريدي. - قم بإزالة الإبرة واستخدم قطعة قطن للضغط على موقع الحقن لمنع النزيف (الشكل 3M).
- خياطة الجلد مع خياطة 5-0 (الشكل 3N). بعد الجراحة ، انقل إلى منطقة دافئة ونظيفة وجافة وقدم ميلوكسيكام (1 مجم / كجم ، SQ، q24h). ضع في قفص استرداد نظيف بدون فراش ولكن الجزء السفلي مغطى بمنشفة ورقية.
ملاحظة: يجب أن يكون الفأر مستيقظا من التخدير ويستعيد وعيه في غضون 5 دقائق بمجرد عودته إلى قفص التعافي. راقب الماوس بحثا عن علامات الضيق. - أعد إلى قفص منزلها وأعد قفص الماوس إلى غرفة نقص الأكسجة.
ملاحظة: يستغرق الإجراء بأكمله ، من تخدير الفأر إلى الانتهاء من حقن الوريد الوداجي ، حوالي 10-15 دقيقة بواسطة مجرب واحد. لتقصير التعرض للنورموكسيا في الفئران ، يوصى بأن يتعاون اثنان على الأقل من الباحثين لإنجاز إجراء حقن الوريد الوداجي.
- أدخل إبرة معقمة 28 جم في الوريد الوداجي مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى (الشكل 3J ، K).
3. قياس ضغط الدم
- إعداد أدوات لقياس ضغط الدم.
- انقع طرف قسطرة 1.0 فهرنهايت في 37 درجة مئوية مسخنة مسبقا قبل 30 دقيقة على الأقل من قياس الدورة الدموية (الشكل 4 أ).
- قم بقياس المسافة من موقع إدخال القسطرة إلى موقع طرف القسطرة المطلوب. على سبيل المثال ، تبلغ المسافة بين الشريان الأورطي الصاعد للفأر إلى منتصف الرقبة حوالي 1-1.2 سم. المسافة بين البطين الأيمن للقلب إلى منتصف الرقبة حوالي 2.3-2.8 سم.
- ضع علامة على علامتين لمسافة القسطرة لتوفير مؤشر مرئي لعمق الإدخال (الشكل 4 ب).
- قم بتوصيل القسطرة بمحول الضغط ، وقم بتوصيل محول الضغط بقناة الإدخال 1 على جهاز الحصول على البيانات ، وقم بتشغيل وحدة التحكم في حجم الضغط ، وابدأ برنامج تحليل ضغط الدم للحصول على البيانات. قم بإنشاء مستند جديد لتحليل ضغط الدم واضبط القناة 1 للضغط.
- قم بإجراء معايرة الضغط وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. اسمح للإعداد بأكمله بالاستقرار لمدة 5 دقائق على الأقل (الشكل 4C).
- في برنامج تحليل ضغط الدم ، حدد تحويل الوحدات من القائمة المنسدلة للقناة 1 (الشكل 4D ، السهم الأحمر).
- قم بتعيين قيم تحويل الوحدات الافتراضية (الشكل 4E).
ملاحظة: يتم تمثيل ضغط الدم كمليمترات من الزئبق (مم زئبق). خرج الضغط القياسي من وحدة التحكم في الضغط هو 1 فولت لكل 100 مم زئبق. 25 مم زئبق يتوافق مع إخراج 0.25 فولت ، و 100 مم زئبق يتوافق مع خرج 1 فولت.
- تحضير الماوس لإجراء قياس ضغط الدم.
- تخدير الماوس مع استنشاق الأيزوفلوران بنسبة 3 ٪ من خلال مخروط الأنف.
- ضع المرهم البيطري مباشرة على سطح العين لعيون الفأر لمنع الجفاف ، حيث لا يستطيع الفأر إغلاق عينيه تحت التخدير. احلق الفراء من رقبة الفأر أثناء التخدير.
- افرك المنطقة المحلوقة بثلاث جولات متناوبة من محلول البوفيدون واليود ومسحة الإيثانول بنسبة 70٪. ضع الفأر المخدر في وضع ضعيف على منصة حقن أسفل مجهر التشريح. ضع أنف الفأر في مخروط الأنف للحفاظ على التخدير (1.5٪ إيزوفلوران) طوال العملية الجراحية.
- اختبر الاستجابة الحركية للفأر المخدر للتحفيز الضار. يجب ألا يستجيب الفأر المخدر لمحفز ضار قبل وأثناء الجراحة.
ملاحظة: يمكن للمخدرات القابلة للاستنشاق (الأيزوفلوران) والحقن (الكيتامين / الزيلازين) أن تقلل من ضغط الدم. بشكل عام ، التخدير باستنشاق الأيزوفلوران له تأثير طفيف على خفض ضغط الدم من الكيتامين / الزيلازين. لذلك ، فإن الأيزوفلوران هو مخدر الاستنشاق المفضل على الكيتامين / الزيلازين. يعد تحقيق عمق التخدير المناسب أمرا بالغ الأهمية لإجراء قياسات الدورة الدموية الدقيقة والقابلة للتكرار. يحتاج المحقق إلى الحفاظ على عمق التخدير ثابتا لكل فأر.
- قسطرة الشريان الأورطي الصاعد
- ضع محفزا ضارا (أي قرصة إصبع القدم) باستخدام ملقط مستقيم لضمان مستوى مناسب من التخدير. قم بعمل شق في خط الوسط للجلد من الفك السفلي إلى القص (الشكل 5 أ).
- افصل الغدد اللعابية وكشف القصبة الهوائية (الشكل 5 ب).
- استخدم الملقط لتنظيف الأنسجة الرخوة على طول الأوعية لكشف الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي الخارجي الأيمن (الشكل 5C).
- ضع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في التجويف لإبطاء تطور التشنج الوعائي أثناء التلاعب بالشريان السباتي.
- اعزل بعناية قسما بحجم 5 مم من الشريان السباتي الأيمن. ضع قطعة من الورق الأبيض المعقم أسفل الوعاء كخلفية لجعل الشريان أكثر وضوحا (الشكل 5 د).
ملاحظة: افصل بعناية العصب المبهم (الأبيض) عن الشريان وتأكد من عدم قطع أو إتلاف العصب أو الشريان. - باستخدام 8-0 ربط خياطة عقدة دائمة لإغلاق نهاية الجمجمة من السفينة (الشكل 5E).
- اربط أول عقدة فضفاضة لعرقلة تدفق الدم مؤقتا من الشريان الأورطي. ثم اربط عقدة ثانية فضفاضة (# 3) بين أول خيطين (الشكل 5F). سيتم استخدام العقدة الثانية السائبة (# 3) لتأمين القسطرة بسرعة بعد وضعها.
- باستخدام إبرة 25 G ، قم بعمل ثقب صغير ، كبير بما يكفي لتمرير القسطرة ، بما يتماشى مع الوعاء بين الأحرف المركبة # 3 و # 1 (الشكل 5G).
ملاحظة: تحمل الشرايين السباتية الدم المؤكسج من القلب ولها ضغط مرتفع للغاية. إذا تم قطع الشريان السباتي ، فإن هذا الضغط سيؤدي إلى تدفق الدم (الشكل 5H). - أمسك القسطرة على بعد 1.5 بوصة من الطرف وأدخل طرف القسطرة برفق من خلال فتحة الشريان (علامة X). شد عقدة الخياطة الوسطى (# 3) حول القسطرة والوعاء الذي لا يزال يسمح بمرور القسطرة (الشكل 5I-J).
ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب الممارسة. تشمل المضاعفات المحتملة لهذه الخطوة النزيف في موقع إدخال القسطرة والتشنج الوعائي. عند حدوث النزيف ، يقلل فقدان الدم من الشريان النازف من حجم الدم ، مما يؤدي إلى انخفاض حاد في ضغط الدم النظامي. بسبب الشدة ، وصل إلى نقطة نهاية إنسانية ويجب القتل الرحيم. بالنسبة للتشنج الوعائي المستحث ميكانيكيا ، يحدث عادة أثناء إدخال القسطرة الناجم عن الانقباض المستمر للأوعية الدموية. هذا يجعل فتحة الأوعية الدموية أصغر ويمنع تقدم القسطرة إلى الشريان السباتي. لا تستخدم القوة المفرطة ضد المقاومة لدفع القسطرة. عند مواجهة مقاومة التشنج الوعائي المعتدلة أو الشديدة ، حاول مرة أخرى بعد قليل أو استخدم قسطرة أصغر (على سبيل المثال ، 1.0 فهرنهايت). يمكن للجراحين المجهريين ذوي الخبرة تحقيق معدلات نجاح بنسبة 100٪ لقسطرة الشريان الأورطي الصاعد. - بعد أن تجتاز القسطرة العقدة السائبة الأولى بطرف المستشعر ، اربط العقدة السائبة الثانية (# 3) بإحكام أكثر لتأمين القسطرة وحرر العقدة السائبة الأولى برفق (الشكل 5K ، L).
- استمر في إدخال القسطرة باتجاه الشريان الأورطي الصاعد وفقا للعلامة الموجودة على القسطرة (الشكل 4 ب) حتى يظهر تحليل الضغط ملف ضغط الدم الشرياني (الشكل 5M). تسجيل بيانات ضغط الدم النظامي (SBP) باستخدام نظام الحصول على البيانات والبرمجيات.
- قم بفك عقدة الخيط الوسطى (# 3) للسماح بسحب القسطرة (الشكل 5N).
- اربط عقدة الخيط الوسطى (# 3) حول الوعاء قبل سحب القسطرة من الشريان السباتي (الشكل 5O-P).
- ضع القسطرة في برنامج تلفزيوني.
- قسطرة القلب الأيمن.
- اعزل الوريد الوداجي الخارجي الأيمن بعناية عن النسيج الضام المحيط واربط جميع الفروع الصغيرة ب 8-0 خياطة (رؤوس الأسهم الزرقاء) (الشكل 6 أ).
ملاحظة: بالنسبة لقسطرة القلب اليمنى ، يتم الوصول إلى القلب بشكل شائع عبر الوريد الوداجي الأيمن. - باستخدام 8-0 خياطة ، اربط عقدة دائمة لإغلاق نهاية الجمجمة للوعاء (الشكل 6 ب). ثم اربط عقدة فضفاضة على الطرف الذيلي للوعاء (الشكل 6C).
- استخدم إبرة 25 جم لعمل ثقب صغير بالقرب من العقدة الدائمة (الشكل 6 د).
ملاحظة: تحمل الأوردة الوداجية الدم غير المؤكسج إلى القلب ولديها ضغط منخفض. إذا تم قطع الوريد الوداجي ، فلن يندفع الدم (الشكل 6D ، E). - امسك القسطرة وأدخل القسطرة في قطع الوريد (علامة X) (الشكل 6E) وشد العقدة الذيلية حول القسطرة والوعاء (الشكل 6F).
- ادفع القسطرة ببطء ورفق إلى القلب الأيمن. راقب عمق طرف القسطرة بناء على علامة القسطرة (الشكل 4 ب).
ملاحظة: يمثل تقييم الضغط الانقباضي البطيني الأيمن (RVSP) في الفئران المغلقة الصدر تحديا بسبب تشريح وهيكل RV المعقد. تتطلب هذه الخطوة مستوى عال من الخبرة والكثير من الممارسة. في أيدي جراح مجهري متمرس ، يمكن أن يقترب المعدل الناجح لقسطرة البطين الأيمن من 90٪. - قم بتقييم موضع طرف القسطرة وفقا لتتبع موجة الضغط في البرنامج. عندما يكون طرف القسطرة في البطين الأيمن ، ستظهر الشاشة تتبعا نموذجيا ل RVSP (الشكل 6G ، H).
ملاحظة: عندما يبدو شكل منحنيات الضغط الرئوي غير نمطي (على سبيل المثال ، منحنيات شائكة) ، فهذا يعني وضع القسطرة بشكل غير صحيح. اضبط موضع القسطرة عن طريق سحب القسطرة برفق للخلف قليلا، ثم دفع القسطرة ببطء إلى وضع أكثر مركزية داخل البطين الأيمن. لتجنب توليد القطع الأثرية في بيانات البحث ، يجب على الباحث تجنب المحاولات المطولة (لا تزيد عن 1 دقيقة) أو المتكررة (ليس أكثر من محاولتين) في قسطرة البطين الأيمن. - حافظ على القسطرة غير متحركة واجمع البيانات لمدة 5 دقائق.
- بعد اكتمال التسجيل ، اسحب القسطرة بعناية واربط العقدة الذيلية حول الوعاء (الشكل 6I). ضع القسطرة مرة أخرى في محلول PBS.
ملاحظة: بعد الانتهاء من التجربة ، قم بتنظيف القسطرة بمحلول إنزيم هضمي بنسبة 1٪ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالإضافة إلى تقييم حالة الدورة الدموية ، قد يحصد الباحثون القلوب والرئتين لفحص PAH النسيجي المرضي. لضمان فعالية جرعات البلعة الوريدية المتعددة ، يمكن للباحثين عزل الخلايا البطانية للرئة وقياس مستويات let-7 miRNA.
- اعزل الوريد الوداجي الخارجي الأيمن بعناية عن النسيج الضام المحيط واربط جميع الفروع الصغيرة ب 8-0 خياطة (رؤوس الأسهم الزرقاء) (الشكل 6 أ).
4. تحليل بيانات ضغط الدم
- افحص تسجيل ضغط الدم.
- افتح ملف بيانات برنامج تحليل ضغط الدم (PAH JOVE.adicht).
- في القناة 1 ، حدد منطقة تمثل إشارة الضغط وضع مؤشر شكل الموجة على الذروة (علامة X) لقياس سعة الضغط (الشكل 7 أ).
- أوجد السعة القصوى لموجة الضغط. هذا يمثل الضغط الانقباضي (الشكل 7 أ ، السهم الأحمر).
- استخرج منطقة الاهتمام (الشكل 7B المنطقة الرمادية) من الصورة بالضغط على Shift + Command + 3 (لنظام التشغيل Mac) أو Windows + Shift + S (لأجهزة الكمبيوتر التي تعمل بنظام Windows) والصقها في ملف رسومات.
- التحليل الإحصائي لبيانات ضغط الدم.
- أدخل بيانات ضغط دم الماوس الفردية في برنامج التحليل الإحصائي.
- قم بإجراء اختبار t للطالب غير المزاوج للتحليل الإحصائي لمجموعتين من الدراسة (normoxia مقابل نقص الأكسجة ؛ نقص الأكسجة مقابل نقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA). ضع في اعتبارك الاختلافات في القيم المتوسطة بنفس أهمية p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التخدير غالبا ما يقلل من ضغط الدم. لذلك ، تم استخدام جرعة دنيا من التخدير لإلغاء الحركات استجابة لحافز ضار. يمكن تصور الوصول الناجح إلى غرفة البطين الأيمن مع تغير شكل موجة الدورة الدموية في مناطق مختلفة من الأنظمة الوريدية (الشكل 8).
في هذه الدراسة ، تم تعيين الفئران بشكل عشوائي لمجموعة normoxic (21٪ O2) (n = 10) ، أو مجموعة نقص الأكسجة (10٪ O2) (n = 10) ، أو مجموعة علاج نقص الأكسجة + 7C1 / let-7 (n = 10). لفحص تأثير let-7 miRNA في قمع تطور PAH الناجم عن نقص الأكسجة ، تم إعطاء 7C1 / let-7 miRNA المركب إلى الفئران C57BL / 6 عن طريق الوريد بجرعة 1.5 مجم / كجم مرتين في الأسبوع لمدة 4 أسابيع (الشكل 2D).
بعد 4 أسابيع من التعرض لنقص الأكسجة أو normoxia ، تم قياس SBP و RVSP في فأر مغلق الصدر. يوضح الشكل 9 أ منحنى ضغط الدم التمثيلي من مجموعات العلاج المعيارية أو نقص الأكسجة أو نقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA. بالمقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة التحكم normoxia ، تم زيادة RVSP بشكل ملحوظ في مجموعة نقص الأكسجة. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع مجموعة نقص الأكسجة ، أدى العلاج بمركب 7C1 / let-7 miRNA في الفئران إلى انخفاض كبير في RVSP (الشكل 9B). ولم يتغير البرنامج في أي مجموعة، وهو ما يتسق مع التقارير السابقة7. يستهدف 7C1 / let-7 miRNA الخلايا البطانية ويقلل من سلسلة إشارات TGFβ8. تظهر البيانات أن 7C1 / let-7 miRNA 1.5 mg / kg فعال للغاية في خفض ضغط الدم في البطين الأيمن ، مما يدل على فعالية جرعات البلعة الوريدية المتعددة.
الشكل 1: الأدوات الجراحية ومعدات قياس ضغط الدم اللازمة لإجراءات ارتفاع ضغط الدم في الشريان الرئوي. (أ) الأدوات الجراحية المستخدمة في إجراء PAH. (ب) منصة حقن مؤقتة مصنوعة من وسادة ماصة ملفوفة حول رف الستايروفوم من عبوة مخروطية سعة 50 مل. توصيل أنبوب تخدير بطول 10 سم بمنصة الحقن كمخروط أنف مع نوع. ج: حزم خياطة. 5-0 خياطة لإغلاق الشق و 8-0 خياطة للربط. (مد-واو) معدات قياس ضغط الدم المستخدمة في إجراء PAH. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإعداد التجريبي لتحريض PAH. (أ) صورة فوتوغرافية لإعداد نظام BioSpherix لنقص الأكسجة. يشار إلى أجزاء مختلفة من نظام الحث. (ب-ج) مستشعر الأكسجين يراقب تركيز غرفة نقص الأكسجة O2. (د) الجدول الزمني التجريبي للمعالجة المركبة 7C1 / let-7 miRNA والتعرض لمستوى الأكسجين لجميع المجموعات الحيوانية أثناء تحريض PAH. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور فوتوغرافية للخطوات الجراحية الرئيسية لحقن الوريد الوداجي. أ: الماوس على مقياس الوزن. (ب) إعداد نظام تحريض تخدير القوارض. يشار إلى أجزاء مختلفة من نظام الحث. (ج-د) صور لفأر مخدر إيزوفلوران في غرفة الحث. (ه) إزالة الفراء المنطقة الجراحية. (F) فأر وضع على منصة حقن وتنفس 1.5٪ إيزوفلوران من خلال مخروط أنف من مبخر. (ز) شق الجلد لنهج الوريد الوداجي. (ح) التشريح الجراحي للوريد الوداجي الخارجي الأيمن. (I) تصوير تكبير أعلى يظهر الوريد الوداجي الأيمن المعزول. لاحظ ورقة بيضاء أسفل الوعاء الدموي ، مما يجعل الوريد أكثر وضوحا. (ي-ك) إدخال إبرة الوريد الوداجي الأيمن مع شطبة لأعلى. (L) حقن مركب ذو صبغة مزرقة في الوريد الوداجي. (M) الضغط على موقع الحقن باستخدام قطعة قطن بعد سحب الإبرة. (ن) خياطة الجرح بخياطة 5-0. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معايرة القسطرة. (أ) نقع طرف قسطرة 1.0 فهرنهايت في برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا 37 درجة مئوية. ب: علامات المسافة على القسطرة للمساعدة في تقدير عمق إدخال القسطرة في الشريان الأورطي الصاعد والبطين الأيمن. (ج) أجهزة قياس ضغط الدم التي تخضع لمعايرة خط الأساس الصفري. (كاليفورنيا) لقطة شاشة لتحليل خط الأساس للقسطرة المستندة إلى برنامج تحليل ضغط الدم. (د) ضمن القائمة المنسدلة للقناة 1 ، حدد مربع حوار تحويل الوحدات في برنامج تحليل ضغط الدم. (ه) تعيين قيم تحويل الوحدات الافتراضية لتحويل إشارة جهد الدخل إلى وحدة مم زئبق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الإجراءات الجراحية لقياسات ضغط الدم الجهازي (SBP). أ: شق خط الوسط من الفك السفلي إلى القص على جلد الرقبة. ب: انفصال الغدة اللعابية لكشف القصبة الهوائية. ج: الشريان السباتي الأيمن المكشوف والوريد الوداجي الخارجي الأيمن بعد تشريح الأنسجة. د: جزء معزول من الشريان السباتي طوله 5 مم. (ه، و) خياطة عقدة دائمة في طرف الجمجمة وعقدتين فضفاضتين في الطرف الذيلي. (ز ، ح) صنع ثقب صغير (علامة X) على الشريان السباتي فقط الذيلية إلى العقدة الدائمة . (I) إدخال القسطرة في الشريان السباتي. (ي) تأمين القسطرة بعقدة خياطة وسطى (# 3). (ك ، ل) الافراج بلطف عن أول عقدة فضفاضة . (م) موجات الضغط الشرياني التمثيلية. (N) تخفيف عقدة الخياطة الوسطى (# 3). (O,P) تشديد عقدة خياطة الوسطى (# 3) حول الوعاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: العمليات الجراحية لقياسات الضغط الانقباضي للبطين الأيمن (RVSP). أ: ربط الفروع الصغيرة للوريد الوداجي الأيمن (رؤوس الأسهم الزرقاء). ب: عقدة دائمة (# 1) على الطرف القحفي للوريد الوداجي. ج: عقدة فضفاضة على الطرف الذيلي للوريد الوداجي. د: عمل ثقب صغير في الوريد الوداجي الأيمن الذيلي للعقدة الدائمة (# 1). (ه) إدخال قسطرة في الوريد الوداجي من خلال ثقب صغير (علامة X). (و) شد العقدة الذيلية حول القسطرة والوعاء. ز: دفع القسطرة إلى البطين الأيمن للقلب. (ح) ممثل RVSP. (I) شد العقدة الذيلية حول الوعاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليل بيانات برنامج تحليل ضغط الدم بعد التسجيل. (أ) استخدام مؤشر الشكل الموجي لقياس سعة الضغط من بيانات برنامج تحليل ضغط الدم الخام في القناة 1. (ب) استخراج المنطقة محل الاهتمام من صورة بيانات برنامج تحليل ضغط الدم الخام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الانتقال الموجي الديناميكي الدموي أثناء قسطرة البطين الأيمن. (A-D) آثار تمثيلية لتغيرات الضغط أثناء قسطرة البطين الأيمن للفأر C57BL / 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: أرقام تمثيل تحليل ضغط الدم وتحليل البيانات. (أ) منحنيات SBP و RVSP التمثيلية في الفئران المعالجة ب normoxia ونقص الأكسجة ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA المعالج. (ب) مخططات موجزة ل SBP و RVSP في normoxia ونقص الأكسجة ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA الفئران المعالجة (NS: ليست كبيرة ؛ ** p < 0.01 ؛ ***p < 0.001 ؛ اختبار t للطالب ثنائي الذيل غير المزاوج). N = 10 لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية لارتفاع ضغط الدم الرئوي لتقليد أحداث المقاومة الوعائية الرئوية المرتفعة في البشر. من بينها ، تم استخدام نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران على نطاق واسع لتقييم فعالية العلاجات التجريبية الجديدة ل PAH. غالبا ما يتطلب البحث باستخدام هذا النموذج إعطاء مركبات للفئران. بالمقارنة مع بروتوكولات الحقن الوريدي (IV) الأخرى المنشورة وتقييم الدورة الدموية الغازية ، توفر هذه الطريقة كلا من التوضيح البصري والوصف التفصيلي.
هناك ثلاث خطوات حاسمة للتنفيذ الناجح للإجراء والحصول على قياسات دقيقة وقابلة للتكرار. أولا ، تأكد من وضع إبرة المحقنة بشكل صحيح في الوريد الوداجي. قد يؤدي حقن الوريد الوداجي غير الصحيح إلى الحقن تحت الجلد. ثانيا ، تأكد من عمق التخدير الكافي. يعد عمق التخدير المتسق في كل ماوس أمرا مهما لتوليد البيانات القابلة للمقارنة بين المجموعات. التخدير العميق جدا يمكن أن يسبب انخفاضا كبيرا في مستويات ضغط الدم. بالإضافة إلى تخدير استنشاق الأيزوفلوران ، فإن الحقن داخل الصفاق للكيتامين / الزيلازين هو طريقة مخدرة أخرى مستخدمة على نطاق واسع لجراحة الفئران. كلتا الطريقتين لها مزايا وعيوب. يتميز تخدير استنشاق الأيزوفلوران بالعديد من المزايا مقارنة بالكيتامين / الزيلازين عن طريق الحقن ، بما في ذلك البداية السريعة ، وعدم وجود أدوية خاضعة للرقابة ، والتعافي السريع ، وهو أسهل بكثير للتحكم في عمق التخدير. العيوب هي تكلفة المعدات ، والرائحة الكريهة ، والتعرض البشري لغازات التخدير النفايات. ثالثا ، تأكد من وجود القسطرة داخل البطين الأيمن للقلب. يمكن أن تتسبب المحاولات الفاشلة المطولة أو المتعددة في قسطرة البطين الأيمن في قراءات خاطئة لضغط الدم.
يتم إعطاء الحقن الوريدي في الفئران في الغالب عبر أوردة الذيل الجانبية. في حين أنه من السهل الوصول إلى هذا الطريق بالإبر ، إلا أنه من الصعب أحيانا إجراء جرعات متعددة من البلعة الوريدية لهذه التقنية. يتمثل التحديان الرئيسيان في أداء هذه التقنية في التباين في عمق الوريد وصعوبة تصور الإبرة بسبب لون جلد ذيل الفئران وصلابة الجلد. الأهم من ذلك ، لا توجد طريقة لتأكيد ما إذا كانت محتويات الحقن بأكملها قد دخلت بنجاح إلى مجرى الدم وليس الأنسجة المحيطة. الوريد الوداجي هو موقع وصول مفضل لأنه (1) ذو صلة سريريا ، (2) يوفر تأكيدا مرئيا لتوصيل الحقن إلى الوريد ، (3) يسمح بحقن متعددة لمجموعة من أثناء التجربة ، و (4) تقنية الحقن هذه آمنة ، ولا يسبب الإجراء أي آثار جانبية.
هناك ثلاث طرق لتسجيل ضغط الدم في الفئران: (1) تخطيط التحجم غير الجراحي لكفة الذيل10. تتيح الأنظمة إجراء قياسات متكررة على مدار دراسة طولية. (2) القياس عن بعد الراديوي11. تتيح الأنظمة مراقبة ضغط الدم في الوقت الفعلي في المختبر المستيقظة والمتحركة بحرية. (3) القسطرة الغازية داخل الشرايين12. تتيح الأنظمة قياسات SBP و RVSP الحادة. في هذا البروتوكول ، اخترنا قسطرة ضغط لقياسات ضغط البطين الأيمن والجهازية عالية الدقة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها بعض القيود. أولا ، قسطرة الضغط وأجهزة قياس ضغط الدم باهظة الثمن (الشكل 1E-F). ثانيا ، يتطلب تخدير ، وهذا يسبب انخفاض في ضغط الدم. ثالثا ، قسطرة القلب الأيمن هي إجراء نهائي لا يسمح بالقياسات التسلسلية. رابعا ، ليس من السهل تعلم الإجراء حتى من قبل جراح دقيق مدرب جيدا.
بمجرد تسجيل ضغط الدم ، يمكن للمحقق عزل القلوب والرئتين عن لتوصيف PAH النسيجي. على سبيل المثال ، قياسات سمك جدار البطين الأيمن لتضخم البطين الأيمن وتحليل الأوعية الرئوية البعيدة العضلية لإعادة تشكيل الشريان الرئوي العضلي. تظهر البيانات أن 7C1 / let-7 miRNA فعال للغاية في خفض ضغط الدم الرئوي مما يدل على فعالية جرعات البلعة الوريدية المتعددة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين عزل الخلايا البطانية للرئة من الرئة الكاملة المعزولة حديثا لتقييم فعالية المواد المحقونة.
باختصار ، يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لتنفيذ جرعات متعددة من البلعة الوريدية ومراقبة الدورة الدموية الغازية في نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران. يمكن للباحثين استخدام حقن الوريد الوداجي وتقنيات قسطرة البطين الشرياني / الأيمن الموصوفة هنا لمجموعة متنوعة من نماذج القوارض التي تتطلب الحقن الوريدي ومراقبة الدورة الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
K Zsebo و M Simons و P-Y Chen هم مؤسسون ومساهمون علميون في VasoRx، Inc. M Simons عضو في المجلس الاستشاري العلمي لشركة VasoRx، Inc. HJ Duckers هو موظف ومساهم في VasoRx. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من خلال منحة صغيرة مشتركة لاتحاد علم الأحياء المقدم بموجب P30AR070253 منحة المعاهد الوطنية للصحة (PYC) ، وصندوق تعليم البحوث الطبية للقلب والأوعية الدموية (PYC) ، وصندوق VasoRx، Inc. (MS) ومنح المعاهد الوطنية للصحة HL135582 (MS) ، HL152197 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 prolene suture pack | Ethicon | 8698G | for incision closure |
| 8-0 nylon suture pack | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | for ligation |
| Anesthesia induction chamber | VETEQUIP | #941444 | Holds the animal during anesthesia exposure |
| Catheter Interface Cable PEC-4D | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000 | |
| Charcoal canister filters | VETEQUIP | #931401 | to help remove waste anesthetic gases |
| Cotton swabs | McKesson | 24-106 | for applying pressure to the injection site to prevent bleeding |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Surgical tools |
| Insulin syringe 28 G | EXEL | 26027 | for jugular vein IV injection |
| Isoflurane | COVETRUS | #029405 | for mouse anesthesia |
| LabChart 8 Software | ADInstruments | for data analysis | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) | Millar | for invasive blood pressure measurement | |
| Needle-25 G | BD | 305124 | for making a samll hole in a vessel |
| Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor | BioSpherix | E702 | for oxygen concentration monitoring |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation. |
|
| Prism 8 | GraphPad | for statistics and scientific graphing | |
| Semisealable hypoxia chamber | BioSpherix | an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | Surgical tools |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | Surgical tools |
| VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | Lot# B2-L-16Apr | IV injection compound |
| VIP 3000 Veterinary Vaporizer | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | for accurate anesthesia delivery |
References
- McLaughlin, V. V., McGoon, M. D.
- Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
- Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
- Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512 (2021).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739 (2012).
- Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088 (2020).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
- Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
- Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291 (2009).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090 (2019).
