Summary
Detta protokoll tillhandahåller en steg-för-steg-procedur för att utföra multipel intravenös bolusdosadministrering och invasiv hemodynamisk övervakning på möss. Utredare kan använda detta protokoll för framtida screening av terapeutiska föreningar för pulmonell artärhypertoni.
Abstract
Pulmonell arteriell hypertension (PAH) är en progressiv livshotande sjukdom som främst drabbar små lungarterioler i lungan. För närvarande finns det inget botemedel mot PAH. Det är viktigt att upptäcka nya föreningar som kan användas för att behandla PAH. Hypoxi-inducerad PAH-modell hos möss är en allmänt använd modell för PAH-forskning. Denna modell rekapitulerar mänskliga kliniska manifestationer av PAH grupp 3-sjukdom och är ett viktigt forskningsverktyg för att utvärdera effektiviteten av nya experimentella terapier för PAH. Forskning som använder denna modell kräver ofta administrering av föreningar i möss. För en substans som måste ges direkt i blodomloppet är optimering av intravenös (IV) administrering en viktig del av de experimentella procedurerna. Helst bör intravenöst injektionssystem tillåta flera injektioner under en viss tid. Även om den hypoxi-inducerade PAH-modellen hos möss är mycket populär i många laboratorier, är det tekniskt utmanande att utföra multipel IV-bolusdosering och invasiv hemodynamisk bedömning i denna modell. I detta protokoll presenterar vi steg-för-steg-instruktioner om hur man utför multipel IV-bolusdosering via musens halsven och utför arteriell och höger kammarkateterisering för hemodynamisk bedömning i mushypoxi-inducerad PAH-modell.
Introduction
Pulmonell artärhypertension (PAH) definieras av ett genomsnittligt systoliskt tryck i lungartären som är högre än 20 mmHg i vila 1,2. Det är en progressiv och dödlig sjukdom som kännetecknas av en ihållande förhöjning av lungartärtrycket, vilket leder till överbelastning av höger kammare och slutligen död på grund av högerkammarsvikt1. För närvarande finns det inget botemedel mot PAH.
Användningen av djurmodeller av pulmonell hypertension är viktig för att testa effektiviteten av experimentella PAH-behandlingar. Bland dessa modeller har den hypoxi-inducerade PAH-modellen hos möss gett viktiga insikter om utvecklingen av PAH grupp 3-sjukdom hos människa 3,4. Forskning som använder denna modell kräver ofta administrering av föreningar i möss för att utvärdera den nya föreningens effektivitet och säkerhet. Därför behöver utredarna en detaljerad experimentell procedur för dosering av föreningar och hemodynamiska mätningar för att säkerställa injektionskonsistens och reproducerbarhet av blodtrycksmätningen från början till slut.
Metoder för intravenös (IV) injektion och blodtrycksmätning har rapporterats i litteraturen 5,6. Metodiken saknar dock visuell illustration och detaljerad beskrivning. Här illustrerar vi de viktigaste stegen för en framgångsrik intravenös bolusinjektion och noggrann mätning och registrering av systemiskt blodtryck och blodtryck i höger kammare. Procedurerna som presenteras här är en viktig resurs för prövare som är intresserade av intravenös administrering av substans för att utveckla en behandling för PAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt protokoll som godkänts av Yale University Institutional Animal Care and Use Committees.
1. Förberedelse av djur, verktyg, blodtrycksmätningsutrustning och hypoxikammare
- Acklimatisering av djur.
OBS: Försöksdjur som användes för denna studie var hanar, 8 veckor gamla C57BL/6-möss som vägde 25-27 g. Flera faktorer bör beaktas vid uppskattningen av antalet djur som krävs för försöket, bland annat kirurgirelaterad dödlighet, oväntade kirurgiska komplikationer och plötslig oväntad död. Använd minst 10 möss per grupp för att nå statistisk styrka och undvika underdrivna studier.- Vid mottagandet ska djuren placeras i ventilerade gnagarburar (grupper om fem djur per bur) med lämpligt strö, gnagarmat och vatten. Låt djuren acklimatisera sig till den nya miljön (12 timmars ljus-mörkercykel vid 18-20 °C) i minst 3 dagar.
- Tilldela dem slumpmässigt till följande grupper: Normoxia (grupp 1), hypoxi (grupp 2) och hypoxi + 7C1/let-7 miRNA (grupp 3).
- Förberedelse av kirurgiska verktyg och blodtrycksmätningsutrustning.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg genom autoklavering (Figur 1A).
- Förbered en provisorisk injektionsplattform med en hemmagjord anestesinäskon (Figur 1B), suturförpackningar (Figur 1C) och utrustning för PAH-proceduren (Figur 1D-F).
- Experimentell miljö för induktion av pulmonell artärhypertension (PAH).
- Ställ in N2-tanken , syresensorn och den halvt förslutningsbara hypoxikammaren (Figur 2A).
- Upprätta ett börvärde på 10 %O2 i syresensorn och låt systemet nå stabilt tillstånd (Figur 2B, C).
- Håll hypoxi (grupp 2) och hypoxi + 7C1/let-7 miRNA (grupp 3) djur i hypoxi (10 %O2) i 3 veckor. Efter 3 veckors hypoxi ska djuren vistas under normoxiska förhållanden i 1 vecka (Figur 2D). Den normoxiska gruppen (grupp 1) stannar i normoxia i 4 veckor.
OBS: (1) 3 veckors hypoxi följt av 1 veckas normoxi är en väletablerad metod för att utveckla PAH ochhjärtsvikt i höger kammare. Syresensorn känner avO2-koncentrationen inuti den halvförslutningsbara hypoxikammaren och korrigerar den genom att infunderaN2-gas genom gasinfusionsröret. - Inspektera djuren dagligen under hela försöket (3 veckor). Rådgör med en veterinär om djuren uppvisar tecken på lidande som dramatisk viktminskning och andningssvårigheter. Om avlivning är nödvändig för djur i svår nöd ska djuret uteslutas från undersökningen.
OBS: Exponering för hypoxi orsakar viktminskning hos möss. En viktminskning på 10 % används vanligtvis som en tillförlitlig indikation på PAH-utveckling. - Undvik omfattande öppning av hypoxikammaren. För rengöring av burar, påfyllning av mat, byte av vattenflaskor och administrering av föreningar, öppna kamrarna i högst 1 timme per vecka.
2. Intravenös bolusinjektion via halsvenen
- Musförberedelse och anestesi.
- Ta ut hypoxi (grupp 2) och hypoxi + 7C1/let-7 miRNA (grupp 3) musburar från hypoxikammaren och ta försiktigt ut djuret ur buren.
OBS: Doseringsregimen för 7C1/let-7 miRNA (1,5 mg/kg IV/dos) är två gånger per vecka under 4 veckors behandling. Det rekommenderas att utredarna tar ut både hypoxi och hypoxi + sammansatta behandlingsburar ur hypoxikammaren under intravenös injektion för att säkerställa att alla djur får samma mängd hypoxiexponering per tidsintervall. - Väg musen med en precisionsvåg och registrera dess vikt (Figur 3A).
- Placera musen i en anestesiinduktionskammare ansluten till anestesiförångaren och stäng den (Figur 3B). Ge termiskt stöd och applicera ögonsmörjmedel på båda ögonen för att förhindra uttorkning under bedövning. Utsätt musen för 3 % isofluran tills den är medvetslös (Figur 3C-D).
- Ta bort musen från kammaren och raka pälsen från käken kraniellt till mitten av bröstbenet. Raka pälsen i sidled från käkvinklarna, genom sidorna av nacken och mot axlarna (Figur 3E).
- Placera den isofluransövda musen på rygg (med buksidan uppåt) på en injektionsplattform under ett dissektionsmikroskop. Upprätthåll bedövningen via en näskon med 1,5 % isofluran och håll försiktigt fast de fyra benen med tejp för att immobilisera kroppen (Figur 3F).
- Applicera en skadlig stimulans (dvs. tånyp) med rak pincett för att säkerställa en tillräcklig nivå av anestesi. Den sövda musen ska inte svara på stimuleringen före och under det kirurgiska ingreppet.
- Ta ut hypoxi (grupp 2) och hypoxi + 7C1/let-7 miRNA (grupp 3) musburar från hypoxikammaren och ta försiktigt ut djuret ur buren.
- Beredning av injektionsmedel.
- Bered en endos injektionsförening i en dos på 1,5 mg/kg under sterila förhållanden.
OBS: Värm injektionsmassan till rumstemperatur (RT) eftersom injektion av kalla ämnen kan orsaka obehag och en sänkning av musens kroppstemperatur (om detta inte skadar substansen). Den optimala dosen och varaktigheten av substansen 7C1/let-7 miRNA som används i denna studie är baserad på tidigare publikationer 8,9. - Fyll den sterila engångssprutan med den volym som ska injiceras. Håll sprutan upprätt och för fram kolven för att driva ut luften ur sprutan. Återanvänd inte sprutan.
- Begränsa injektionsvolymen till 200 μl i en mus på 25 g för att minska incidensen av hemodilution och onormala hjärteffekter på djuren. Om en större volym krävs, dela upp injektionsmassan i två injektioner med ett intervall på 10 minuter.
- Bered en endos injektionsförening i en dos på 1,5 mg/kg under sterila förhållanden.
- Förbered musen för intravenös injektion.
- Skrubba försiktigt operationsområdet tre gånger med tre alternerande omgångar av povidon-jodlösning och 70 % etanol. Administrera buprenorfin (0,05 mg/kg, SQ) 30 minuter före det kirurgiska ingreppet.
- Gör ett 0,5 cm längsgående snitt något till höger om halsens mittlinje med hjälp av ett skalpellblad (Figur 3G).
- Använd en pincett för att separera muskeln och fettvävnaden för att lokalisera den högra yttre halsvenen (Figur 3H).
OBS: Växla injektionsstället varje gång för att undvika ärrbildning. - Använd en objektivlins med hög effekt för att möjliggöra enkel visualisering av injektionsområdet (Figur 3I).
- Intravenös injektion
- Stick in en 28 G steril nål i halsvenen med nålavfasningen uppåt (Figur 3J, K).
OBS: Svansvensinjektion är ett alternativ till jugular veninjektion. Denna teknik är dock svår att utföra upprepad dosering på grund av variationen i vendjup, hudfärg på mösssvans och hudhårdhet. - Tryck långsamt på sprutkolven för att injicera substansen i venen. Låt nålen sitta kvar i venen i ytterligare 10 sekunder för att förhindra återflöde av injektionsvätskan (Figur 3L).
OBS: Det blåaktiga färgämnet gör det enkelt att visualisera injektionen. Inkludera inte färgämnet vid injicering av testmaterial. En felaktig injektion kommer att resultera i ansamling av blåaktigt färgämne runt intravenöst injektionsställe. - Ta bort nålen och använd en bomullspinne för att trycka på injektionsstället för att förhindra blödning (Figur 3M).
- Suturera huden med 5-0 sutur (Figur 3N). Efter operationen ska djuret flyttas till ett varmt, rent och torrt område och meloxikam (1 mg/kg, SQ, q24h). Placera djuret i en ren uppvakningsbur utan strö men med botten täckt av en pappershandduk.
OBS: Musen ska vara vaken från narkos och återfå medvetandet inom 5 minuter när den väl är tillbaka till uppvakningsburen. Övervaka musen för tecken på nöd. - Sätt tillbaka djuren i deras hembur och sätt tillbaka musburen i syrebristkammaren.
OBS: Hela proceduren, från att bedöva en mus till att avsluta jugular veninjektion, tar cirka 10-15 minuter av en enda experimentledare. För att förkorta normoxiexponeringen hos möss rekommenderas att minst två utredare samarbetar för att utföra en injektion av halsvenen.
- Stick in en 28 G steril nål i halsvenen med nålavfasningen uppåt (Figur 3J, K).
3. Mätning av blodtryck
- Förbered instrument för blodtrycksmätning.
- Blötlägg spetsen på 1.0 F-katetern i 37 °C förvärmd PBS minst 30 minuter före hemodynamisk mätning (Figur 4A).
- Mät avståndet från kateterns insättningsställe till önskad plats på kateterspetsen. Till exempel är avståndet mellan musens stigande aorta till mitten av halsen cirka 1-1,2 cm. Avståndet mellan hjärtats högra kammare och mitten av halsen är cirka 2,3-2,8 cm.
- Markera två kateteravståndsmarkeringar för att ge en visuell indikation på införingsdjupet (Figur 4B).
- Fäst katetern på tryckgivaren, anslut tryckgivaren till ingångskanal 1 på datainsamlingsenheten, slå på tryckvolymkontrollenheten och initiera programvara för datainsamling för blodtrycksanalys. Skapa ett nytt blodtrycksanalysdokument och ställ in kanal 1 för tryck.
- Utför en tryckkalibrering enligt tillverkarens protokoll. Låt hela installationen stabiliseras i minst 5 minuter (Figur 4C).
- I programvaran för blodtrycksanalys väljer du Enhetskonvertering från rullgardinsmenyn Kanal 1 (Figur 4D, röd pil).
- Ställ in standardkonverteringsvärdena för enheter (Figur 4E).
OBS: Blodtrycket representeras som millimeter kvicksilver (mmHg). Det standardiserade tryckuttaget från tryckregleringsenheten är 1 V per 100 mmHg. 25 mmHg motsvarar 0,25 V utgång och 100 mm Hg motsvarar 1 V utgång.
- Förbered musen för blodtrycksmätning.
- Bedöva musen med 3% isofluraninhalation genom en näskon.
- Applicera den veterinära salvan direkt på ögat på musögonen för att förhindra torrhet, eftersom musen inte kan sluta ögonen under narkos. Raka pälsen från musens hals under narkos.
- Skrubba det rakade området med tre alternerande omgångar av povidon-jodlösning och 70 % etanolpinne. Placera den sövda musen på rygg på en injektionsplattform under ett dissektionsmikroskop. Placera musens nos i noskonen för att bibehålla anestesi (1,5 % isofluran) under hela det kirurgiska ingreppet.
- Testa den sövda musens motoriska svar på den skadliga stimulansen. Den sövda musen ska inte svara på ett skadligt stimulus före och under operationen.
OBS: Inhalerbara (isofluran) och injicerbara (ketamin/xylazin) bedövningsmedel kan sänka blodtrycket. I allmänhet har isofluraninhalationsanestesi en liten effekt på att sänka blodtrycket än ketamin/xylazin. Därför är isofluran det föredragna inhalationsbedövningsmedlet framför ketamin/xylazin. Att uppnå lämpligt anestesidjup är avgörande för noggranna och reproducerbara hemodynamiska mätningar. Utredaren måste hålla anestesidjupet konstant för varje mus.
- Stigande aortakatetraisering
- Applicera en skadlig stimulans (dvs. tånyp) med rak pincett för att säkerställa en tillräcklig nivå av anestesi. Gör ett snitt i mitten av huden från underkäken till bröstbenet (Figur 5A).
- Separera spottkörtlarna och exponera luftstrupen (Figur 5B).
- Använd en pincett för att rensa mjukvävnaden längs kärlen för att exponera den högra halspulsådern och den högra yttre halsvenen (Figur 5C).
- Sätt 0,5 ml PBS i hålrummet för att bromsa utvecklingen av vasospasm samtidigt som du manipulerar halspulsådern.
- Isolera försiktigt en 5 mm stor del av den högra halspulsådern. Placera en bit sterilt vitt papper under kärlet som bakgrund för att göra artären mer synlig (Figur 5D).
OBS: Separera försiktigt vagusnerven (vit) från artären och se till att inte skära eller skada nerven eller artären. - Att använda en 8-0 sutur knyt en permanent knut (#1) för att stänga av kärlets kraniala ände (Figur 5E).
- Knyt en första lös knut (#2) för att tillfälligt täppa till blodflödet från aortan. Knyt sedan en andra lös knut (#3) mellan de två första suturerna (Figur 5F). Den andra lösa knuten (#3) kommer att användas för att snabbt säkra katetern efter placering.
- Använd en 25 G nål och gör ett litet hål, tillräckligt stort för att föra katetern, i linje med kärlet mellan #3 och #1 ligaturer (Figur 5G).
OBS: Halspulsådrorna transporterar syresatt blod från hjärtat och har mycket högt tryck. Om halspulsådern skärs av kommer det trycket att få blodet att spruta ut (Figur 5H). - Håll katetern 1.5 tum från spetsen och för försiktigt in kateterns spets genom hålet i artären (X-märke). Dra åt den mellersta suturknutan (#3) runt katetern och kärlet som fortfarande tillåter passage av katetern (Figur 5I-J).
OBS: Detta steg kräver övning. De potentiella komplikationerna med detta steg inkluderar blödning vid kateterinsättningsstället och vasospasm. När blödning uppstår minskar blodförlusten från den blödande artären blodvolymen, vilket leder till ett kraftigt blodtrycksfall. På grund av allvarlighetsgraden har djuret nått en human slutpunkt och måste avlivas. För mekaniskt inducerad vasospasm inträffar det vanligtvis under kateterinsättning orsakad av en ihållande sammandragning av blodkärlen. Detta gör att blodkärlsöppningen blir mindre och förhindrar att katetern avancerar till halspulsådern. Använd inte överdriven kraft mot motståndet för att föra katetern framåt. När måttlig eller svår vasospasmresistens påträffas, försök igen om en liten stund eller använd en mindre kateter (t.ex. 1,0 F). Erfarna mikrokirurger kan uppnå 100 % framgång för stigande aortakatetrarisering. - När katetern har passerat den första lösa knuten (#2) med sensorspetsen, fäst den andra lösa knuten (#3) hårdare för att säkra katetern och släpp försiktigt den första lösa knuten (#2) (#2) (Figur 5K, L).
- Fortsätt att föra in katetern mot den uppåtgående aortan enligt markeringen på katetern (Figur 4B) tills tryckanalysen visar en arteriell blodtrycksprofil (Figur 5M). Registrera systemiskt blodtryck (SBP) med hjälp av datainsamlingssystemet och programvaran.
- Lossa den mellersta suturknutan (#3) så att katetern kan dras ut (Figur 5N).
- Knyt den mellersta suturknutan (#3) runt kärlet innan du drar ut katetern ur halspulsådern (Figur 5O-P).
- Placera katetern i PBS.
- Höger hjärtkateterisering.
- Isolera försiktigt den högra yttre halsvenen från den omgivande bindväven och ligera alla små grenar med 8-0 sutur (blå pilspetsar) (Figur 6A).
OBS: Vid kateterisering av höger hjärta nås hjärtat vanligen via höger halsven. - Att använda en 8-0 sutur, knyt en permanent knut (#1) för att stänga av kärlets kraniala ände (Figur 6B). Knyt sedan en lös knut (#2) på den kaudala änden av kärlet (Figur 6C).
- Använd en 25 G nål för att göra ett litet hål proximalt om den permanenta knuten (#1) (Figur 6D).
OBS: Jugularvener transporterar syrefattigt blod till hjärtat och har lågt tryck. Om halsvenen skärs av kommer blodet inte att spruta ut (Figur 6D, E). - Håll i katetern och för in katetern i vensnittet (X-märket) (Figur 6E) och dra åt svansknuten (#2) runt katetern och kärlet (Figur 6F).
- Tryck långsamt och försiktigt in katetern i höger hjärta. Övervaka kateterspetsens djup baserat på katetermärket (Figur 4B).
OBS: Bedömning av det systoliska trycket i höger kammare (RVSP) hos möss med sluten bröstkorg är en utmaning på grund av den komplexa RV-anatomin och strukturen. Detta steg kräver en hög kompetensnivå och mycket övning. I händerna på en erfaren mikrokirurg kan den framgångsrika frekvensen för högerkammarkateterisering närma sig 90 %. - Bedöm kateterspetsens position enligt tryckvågsspårningen i programvaran. När kateterns spets är i höger kammare visar monitorn en typisk RVSP-spårning (Figur 6G, H).
OBS: När formen på lungtryckskurvorna ser atypisk ut (t.ex. taggiga kurvor) innebär detta felaktig placering av katetern. Justera kateterns position genom att försiktigt dra katetern en liten bit bakåt och sedan långsamt föra katetern till en mer central position i höger kammare. För att undvika generering av artefakter i forskningsdata bör utredaren undvika långvariga (högst 1 min) eller upprepade försök (högst två försök) med högerkammarkateterisering. - Håll katetern orörlig och samla in data i 5 minuter.
- När inspelningen är klar drar du försiktigt ut katetern och knyter svansknuten (#2) runt kärlet (Figur 6I). Sätt tillbaka katetern i PBS-lösning.
OBS: Efter avslutat experiment, rengör katetern med 1 % matsmältningsenzymlösning enligt tillverkarens instruktioner. Förutom att bedöma hemodynamisk status kan utredarna skörda hjärtan och lungor för histopatologisk undersökning av PAH. För att säkerställa effektiviteten av multipel IV-bolusdosering kan utredare isolera lungendotelceller och mäta let-7 miRNA-nivåer.
- Isolera försiktigt den högra yttre halsvenen från den omgivande bindväven och ligera alla små grenar med 8-0 sutur (blå pilspetsar) (Figur 6A).
4. Analys av blodtrycksdata
- Undersök blodtrycksregistreringen.
- Öppna datafilen för programvaran för blodtrycksanalys (PAH JOVE.adicht).
- I kanal 1, välj ett område som representerar trycksignalen och placera vågformsmarkören på toppen (X-märket) för att mäta trycket amplitud (Figur 7A).
- Bestäm tryckvågens maximala amplitud. Detta representerar det systoliska trycket (Figur 7A, röd pil).
- Extrahera intresseområdet (Figur 7B grått område) från bilden genom att trycka på Skift + Kommando + 3 (för Mac) eller Windows + Skift + S (för Windows PC) och klistra in det i en grafikfil.
- Statistisk analys av blodtrycksdata.
- Ange de enskilda musblodtrycksdata i programvara för statistisk analys.
- Utför ett oparat studentens t-test för statistisk analys av två studiegrupper (normoxi vs. hypoxi; hypoxi vs. hypoxi + 7C1/let-7 miRNA). Betrakta skillnaderna i medelvärden som så signifikanta som p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anestesi sänker ofta blodtrycket. Därför användes en minimidos av anestesi för att eliminera rörelserna som svar på ett skadligt stimulus. Framgångsrik åtkomst till höger kammare kan visualiseras när den hemodynamiska vågformen förändras i olika regioner av vensystemet (Figur 8).
I denna studie randomiserades möss till den normoxiska (21 % O2) gruppen (n = 10), hypoxi (10 % O2) gruppen (n = 10) eller hypoxi + 7C1/let-7 behandlingsgruppen (n = 10). För att undersöka effekten av let-7 miRNA vid undertryckande av hypoxi-inducerad PAH-utveckling, administrerades formulerat 7C1/let-7 miRNA till C57BL/6-mössen intravenöst i en dos på 1,5 mg/kg två gånger per vecka i 4 veckor (Figur 2D).
4 veckor efter exponering för hypoxi eller normoxi mättes SBP och RVSP i en mus med stängd bröstkorg. Figur 9A visar den representativa blodtryckskurvan från normoxiska, hypoxi eller hypoxi + 7C1/let-7 miRNA-behandlingsgrupper. Jämfört med dem i normoxia-kontrollgruppen var RVSP signifikant förhöjt i hypoxigruppen. Dessutom, jämfört med hypoxigruppen, resulterade behandling med 7C1/let-7 miRNA-förening på möss i signifikant minskad RVSP (Figur 9B). SBP förändrades inte i någon grupp, vilket överensstämmer med tidigare rapporter7. 7C1/let-7 miRNA riktar sig mot endotelceller och minskar TGFβ-signaleringkaskad 8. Data visar att 7C1/let-7 miRNA 1,5 mg/kg är mycket effektivt för att sänka blodtrycket i höger kammare, vilket visar effektiviteten av multipel intravenös bolusdosering.
Figur 1: Kirurgiska instrument och blodtrycksmätningsutrustning som krävs för pulmonell artärhypertoni. A) Kirurgiska verktyg som används för PAH-ingrepp. (B) En provisorisk injektionsplattform gjord av en absorberande dyna lindad runt ett frigolitställ från en 50 ml konisk förpackning. Fäst en 10 cm lång anestesislang på injektionsplattformen som näskon med typ. (C) Suturförpackningar. 5-0 sutur för stängning av snittet och 8-0 sutur för ligering. (D-F) Blodtrycksmätningsutrustning som används för PAH-proceduren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Experimentell miljö för PAH-induktion. (A) Fotografi av installation av BioSpherix hypoxiska system. Olika delar av induktionssystemet indikeras. (B-C) Syresensor som övervakar hypoxikammarens O2 koncentration. (D) Experimentell tidslinje för behandling med 7C1/let-7 miRNA-föreningar och exponering för syrenivå för alla djurgrupper under PAH-induktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fotografier av viktiga kirurgiska steg för injektion av halsvenen. (A) Mus på en våg. (B) Inställning av induktionssystem för anestesi hos gnagare. Olika delar av induktionssystemet indikeras. (C-D) Bilder på en isofluranbedövad mus i en induktionskammare. (E) Päls borttagen kirurgisk zon. (F) En mus placerades på en injektionsplattform och andades in 1,5 % isofluran genom en noskon från en förångare. G) Hudsnitt för halsvensgång. H) Kirurgisk dissektion av höger yttre halsven. (I) Högre förstoringsavbildning som visar den isolerade högra halsvenen. Lägg märke till ett vitt papper under kärlet, vilket gör venen mer synlig. (J-K) Höger halsvennål med fasningen uppåt. (L) Injektion av en förening med blåaktigt färgämne i halsvenen. (M) Tryck på injektionsstället med en bomullspinne efter att nålen har dragits ut. (N) Suturera såret med en 5-0 sutur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kalibrering av katetern. (A) Blötläggning av 1.0 F kateterspets i 37 °C förvärmd PBS. (B) Avståndsmarkeringar på katetern för att hjälpa till att uppskatta djupet för införandet av katetern i den uppåtgående aortan och höger kammare. C) Utrustning för blodtrycksmätning som genomgår en nollkalibrering vid baslinjen. (Ca') Skärmdump av mjukvarubaserad kateterbaslinjeanalys för blodtrycksanalys. (D) Under rullgardinsmenyn Kanal 1 väljer du dialogrutan Enhetskonvertering i programvaran för blodtrycksanalys. (E) Ställa in standardenhetsomvandlingsvärden för att omvandla ingångsvolymentage signal till mmHg-enhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kirurgiska ingrepp för mätning av systemiskt blodtryck (SBP). A) Ett snitt i mittlinjen från underkäken till bröstbenet på huden på halsen. B) Spottkörteln separeras för att exponera luftstrupen. (C) Exponerad höger halspulsåder och höger yttre halsven efter vävnadsdissektion. (D) Ett isolerat 5 mm snitt av halspulsådern. (E,F) Sutur: permanent knuta vid kranialextremiteten och två lösa knutar vid stjärtextreman. (G,H) Att göra ett litet hål (X-märke) på halspulsådern precis i svansen till den permanenta knuten (#1). (I) Införande av katetern i halspulsådern. (J) Säkra katetern med en mellersta suturknut (#3). (K,L) Lossa försiktigt den första lösa knuten (#2). (M) Representativa artärtrycksvågor. (N) Lossa den mellersta suturnoden (#3). (O,P) Dra åt den mellersta suturnoden (#3) runt kärlet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Kirurgiska ingrepp för systoliskt tryck i höger kammare (RVSP). (A) Ligering av de små grenarna i den högra halsvenen (blå pilspetsar). (B) En permanent knut (#1) på kranialänden av halsvenen. (C) En lös knut (#2) på svansänden av halsvenen. (D) Gör ett litet hål på höger halsvenstjärt till den permanenta knuten (#1). (E) Införande av en kateter i halsvenen genom ett litet hål (X-märke). (F) Dra åt svansknuten (#2) runt katetern och kärlet. (G) Trycka in katetern i hjärtats högra kammare. h) Representativ RVSP. (I) Åtdragning av stjärtknutan (#2) runt kärlet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Analys av programvara för blodtrycksanalys efter inspelning. (A) Använda vågformsmarkören för att mäta tryckamplituden från den råa programvaran för blodtrycksanalys i kanal 1. (B) Extrahera det intressanta området från den råa databilden för programvaran för blodtrycksanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Hemodynamisk vågformsövergång under högerkammarkateterisering. (A-D) Representativa spår av tryckförändringar under högerkammarkateterisering hos mus hos en C57BL/6-mus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Representativa siffror för blodtrycksanalys och dataanalys. (A) Representativa SBP- och RVSP-kurvor i normoxi, hypoxi och hypoxi + 7C1/let-7 miRNA-behandlade möss. (B) Sammanfattande diagram över SBP och RVSP i normoxi, hypoxi och hypoxi + 7C1/let-7 miRNA-behandlade möss (NS: inte signifikant; **p < 0,01; ***p < 0,001; oparat tvåsidigt studentens t-test). N = 10 per grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera djurmodeller för pulmonell hypertension har etablerats för att efterlikna de förhöjda pulmonella vaskulära resistenshändelserna hos människor. Bland dem har den hypoxi-inducerade PAH-modellen hos möss använts i stor utsträckning för att utvärdera effektiviteten av nya experimentella terapier för PAH. Forskning som använder denna modell kräver ofta administrering av föreningar till mössen. I jämförelse med andra publicerade intravenösa (IV) injektions- och invasiva hemodynamiska bedömningsprotokoll ger denna metod både visuell illustration och detaljerad beskrivning.
Det finns tre kritiska steg för ett framgångsrikt utförande av proceduren och för att få exakta och reproducerbara blodtrycksmätningar. Se först till att sprutnålen är korrekt placerad i halsvenen. Felaktig injektion av halsvenen kan leda till subkutan injektion. För det andra, se till att anestesin är tillräckligt djup. Konsekvent anestesidjup i varje mus är viktigt för generering av data som är jämförbara mellan grupper. För djup anestesi kan orsaka en betydande minskning av blodtrycksnivåerna. Förutom isofluraninhalationsanestesi är intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin en annan allmänt använd anestesimetod för muskirurgi. Båda metoderna har för- och nackdelar. Isofluraninhalationsanestesin har flera fördelar jämfört med injicerbart ketamin/xylazin, inklusive snabb insättande, inga kontrollerade läkemedel, snabb återhämtning och är mycket lättare att kontrollera anestesidjupet. Nackdelarna är kostnaden för utrustningen, obehaglig lukt och mänsklig exponering för avfallsanestesigaser. För det tredje, se till att katetern är inuti hjärtats högra kammare. Långvariga eller flera misslyckade försök till högerkammarkateterisering kan orsaka falska blodtrycksmätningar.
Intravenös injektion till möss administreras huvudsakligen via de laterala svansvenerna. Även om denna väg är lätt att nå med nålar, är denna teknik ibland svår att utföra multipel IV-bolusdosering. De två största utmaningarna med att utföra denna teknik är variationen i vendjup och svårigheten att visualisera nålar på grund av mösssvansens hudfärg och hudens hårdhet. Ännu viktigare, Det finns inget sätt att bekräfta om hela innehållet i injektionen har lyckats komma in i blodomloppet och inte de omgivande vävnaderna. Jugularven är ett föredraget ställe eftersom (1) det är kliniskt relevant, (2) det ger visuell bekräftelse på tillförseln av injektat till venen, (3) det möjliggör flera injektioner av en grupp djur under experimentets gång, och (4) denna injektionsteknik är säker och proceduren orsakar inga biverkningar.
Det finns tre sätt att registrera blodtryck hos möss: (1) Icke-invasiv svansmanschettpletysmografi10. Systemen möjliggör upprepade mätningar under en longitudinell studie. (2) Radiotelemetri11. Systemen gör det möjligt att övervaka blodtrycket i realtid hos vakna och fritt rörliga försöksdjur. (3) Invasiva intraarteriella katetrar12. Systemen möjliggör akuta SBP- och RVSP-mätningar. I detta protokoll valde vi en tryckkateter för högupplösta systemiska och högerkammartrycksmätningar. Denna metod har dock vissa begränsningar. För det första är tryckkatetern och blodtrycksmätningsutrustningen dyra (Figur 1E-F). För det andra kräver det att djuren sövs, vilket orsakar blodtryckssänkning. För det tredje är kateterisering av höger hjärta en terminal procedur som inte tillåter seriella mätningar. För det fjärde är proceduren inte lätt att lära sig ens av en välutbildad mikrokirurg.
När blodtrycket har registrerats kan utredaren isolera hjärtan och lungor från djuren för histologisk PAH-karakterisering. Till exempel mätningar av väggtjocklek i höger kammare för högerkammarhypertrofi och muskulär lungdistal kärlanalys för muskulär lungartärremodellering. Data visar att 7C1/let-7 miRNA är mycket effektivt för att sänka lungblodtrycket, vilket visar effektiviteten av vår multipla IV-bolusdosering. Dessutom kan utredare isolera lungendotelceller från den nyligen isolerade hela lungan för att utvärdera effektiviteten av injicerade material.
Sammanfattningsvis tillhandahåller detta protokoll en steg-för-steg-procedur för att utföra multipel IV-bolusdosering och invasiv hemodynamisk övervakning i en mushypoxi-inducerad PAH-modell. Utredare kan använda jugular veninjektion och arteriell/höger kammarekateteriseringstekniker som beskrivs här för en mängd olika gnagarmodeller som kräver IV-injektion och hemodynamisk övervakning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
K Zsebo, M Simons och P-Y Chen är vetenskapliga grundare och aktieägare i VasoRx, Inc. M Simons är medlem i det vetenskapliga rådet för VasoRx, Inc. HJ Duckers är anställd och aktieägare i VasoRx. De övriga författarna uppger att de inte har några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett mikrobidrag från Joint Biology Consortium som tillhandahölls under NIH grant P30AR070253 (PYC), Cardiovascular Medical Research Education Fund (PYC), VasoRx, Inc. Fund (MS) och NIH grants HL135582 (MS), HL152197 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 prolene suture pack | Ethicon | 8698G | for incision closure |
| 8-0 nylon suture pack | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | for ligation |
| Anesthesia induction chamber | VETEQUIP | #941444 | Holds the animal during anesthesia exposure |
| Catheter Interface Cable PEC-4D | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000 | |
| Charcoal canister filters | VETEQUIP | #931401 | to help remove waste anesthetic gases |
| Cotton swabs | McKesson | 24-106 | for applying pressure to the injection site to prevent bleeding |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Surgical tools |
| Insulin syringe 28 G | EXEL | 26027 | for jugular vein IV injection |
| Isoflurane | COVETRUS | #029405 | for mouse anesthesia |
| LabChart 8 Software | ADInstruments | for data analysis | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) | Millar | for invasive blood pressure measurement | |
| Needle-25 G | BD | 305124 | for making a samll hole in a vessel |
| Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor | BioSpherix | E702 | for oxygen concentration monitoring |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation. |
|
| Prism 8 | GraphPad | for statistics and scientific graphing | |
| Semisealable hypoxia chamber | BioSpherix | an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | Surgical tools |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | Surgical tools |
| VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | Lot# B2-L-16Apr | IV injection compound |
| VIP 3000 Veterinary Vaporizer | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | for accurate anesthesia delivery |
References
- McLaughlin, V. V., McGoon, M. D.
- Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
- Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
- Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512 (2021).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739 (2012).
- Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088 (2020).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
- Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
- Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291 (2009).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090 (2019).
