Summary
이 프로토콜은 마우스에서 다중 정맥 볼루스 용량 투여 및 침습적 혈류역학적 모니터링을 실행하기 위한 단계별 절차를 제공합니다. 조사관은 폐동맥 고혈압에 대한 향후 치료 화합물 스크리닝을 위해 이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
Abstract
폐동맥 고혈압(PAH)은 생명을 위협하는 진행성 질환으로, 주로 폐의 작은 폐동맥에 영향을 미칩니다. 현재 PAH에 대한 치료법은 없습니다. PAH 치료에 사용할 수 있는 새로운 화합물을 발견하는 것이 중요합니다. 마우스 저산소증 유도 PAH 모델은 PAH 연구에 널리 사용되는 모델입니다. 이 모델은 PAH 그룹 3 질환의 인체 임상 증상을 요약하고 PAH에 대한 새로운 실험 요법의 효과를 평가하는 중요한 연구 도구입니다. 이 모델을 사용한 연구는 종종 마우스에서 화합물의 투여를 필요로 합니다. 혈류에 직접 투여해야 하는 화합물의 경우 정맥 주사(IV) 투여를 최적화하는 것이 실험 절차의 핵심 부분입니다. 이상적으로 IV 주입 시스템은 정해진 시간 동안 여러 번 주입할 수 있어야 합니다. 마우스 저산소증 유도 PAH 모델은 많은 실험실에서 매우 인기가 있지만, 이 모델에서 다중 IV 볼루스 투여 및 침습적 혈류역학 평가를 수행하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 마우스 경정맥을 통해 다중 IV 볼루스 투여를 수행하고 마우스 저산소증 유도 PAH 모델에서 혈류역학적 평가를 위한 동맥 및 우심실 카테터 삽입을 수행하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다.
Introduction
폐동맥 고혈압(PAH)은 안정 시 평균 폐동맥 수축기 혈압이 20mmHg 이상인 것으로 정의됩니다 1,2. 폐동맥압의 지속적인 상승을 특징으로 하는 진행성 및 치명적인 질병으로, 우심실 과부하를 유발하고 결국 우심실 부전으로 사망에 이르게 한다1. 현재 PAH에 대한 치료법은 없습니다.
폐고혈압 동물 모델의 사용은 실험적 PAH 요법의 효과를 테스트하는 데 중요합니다. 이러한 모델 중에서, 마우스 저산소증 유도 PAH 모델은 인간 PAH 그룹 3 질병 발병에 대한 주요 통찰력을 제공했다 3,4. 이 모델을 사용한 연구는 종종 새로운 화합물의 효과와 안전성을 평가하기 위해 마우스에 화합물을 투여해야 합니다. 따라서 연구자는 처음부터 끝까지 주입 일관성과 혈압 측정 재현성을 보장하기 위해 화합물 투여 및 혈류역학 측정에 대한 상세한 실험 절차가 필요합니다.
정맥 주사(IV) 및 혈압 측정 방법은 문헌 5,6에 보고되었습니다. 그러나 방법론은 시각적 설명과 자세한 설명이 부족합니다. 여기에서는 성공적인 IV 볼루스 주사와 전신 및 우심실 혈압의 정확한 측정 및 기록을 위한 주요 단계를 설명합니다. 여기에 제시된 절차는 PAH 치료법을 개발하기 위해 화합물 투여 플랫폼의 IV 경로에 관심이 있는 연구자에게 중요한 리소스입니다.
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Protocol
모든 동물 시술은 Yale University Institutional Animal Care and Use Committees에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 동물, 도구, 혈압 측정 장비 및 저산소증 챔버의 준비
- 동물 적응.
참고: 이 연구에 사용된 실험 동물은 체중이 25-27g인 8주 된 C57BL/6 마우스의 수컷이었습니다. 실험에 필요한 동물의 수를 추정할 때 수술 관련 사망률, 예기치 않은 수술 합병증 및 예기치 않은 갑작스러운 사망을 포함한 몇 가지 요소를 고려해야 합니다. 그룹당 최소 10마리의 마우스를 사용하여 통계적 검정력에 도달하고 검정력 부족 연구를 피하십시오.- 접수 시 적절한 침구, 설치류 차우 및 물이 제공되는 통풍이 잘되는 설치류 케이지(케이지당 5마리 그룹)에 동물을 수용합니다. 동물들이 최소 3일 동안 새로운 환경(18-20°C에서 12시간 명암 주기)에 적응하도록 합니다.
- Normoxia(그룹 1), 저산소증(그룹 2) 및 저산소증 + 7C1/let-7 miRNA(그룹 3)에 무작위로 할당합니다.
- 수술 도구 및 혈압 측정 장비 준비.
- 고압멸균으로 모든 수술 도구를 멸균합니다(그림 1A).
- 수제 마취 노즈콘(그림 1B), 봉합사 팩(그림 1C) 및 PAH 시술 장비(그림 1D-F)가 있는 임시 주사 플랫폼을 준비합니다.
- 폐동맥 고혈압(PAH) 유도를 위한 실험 설정.
- N2 탱크, 산소 센서 및 반밀봉 가능한 저산소증 챔버를 설정합니다(그림 2A).
- 산소 센서에서 10% O2 의 설정값을 설정하고 시스템이 정상 상태에 도달하도록 합니다(그림 2B, C).
- 저산소증(그룹 2) 및 저산소증 + 7C1/let-7 miRNA(그룹 3) 동물을 저산소증(10% O2)에 3주 동안 보관합니다. 저산소증 3주 후, 동물을 정상산소 조건 하에 1주일 동안 두십시오(그림 2D). normoxic 그룹(그룹 1)은 4주 동안 normoxia에 머뭅니다.
참고: (1) 3주간의 저산소증 후 1주간의 정상산소증은 PAH와 우심실 심부전을 발생시키는 잘 확립된 방법이다7. 산소 센서는 반밀봉 가능한 저산소증 챔버 내부의O2 농도를 감지하고 가스 주입 튜브를 통해N2 가스를 주입하여 이를 보정합니다. - 전체 실험 기간(3주) 동안 매일 동물을 검사합니다. 동물이 급격한 체중 감소 및 호흡 곤란과 같은 고통의 징후를 보이는 경우 수의사와 상담하십시오. 심각한 고통에 처한 동물에게 안락사가 필요한 경우 해당 동물을 연구에서 제외합니다.
알림: 저산소증 노출은 쥐의 체중 감소를 유발합니다. 체중의 10% 감소는 일반적으로 PAH 발병의 신뢰할 수 있는 지표로 사용됩니다. - 저산소증 챔버를 광범위하게 열지 마십시오. 케이지 청소, 사료 보충, 물병 교체 및 복합 투여를 위해 일주일에 1시간 이상 챔버를 열지 마십시오.
2. 경정맥을 통한 정맥 주사
- 마우스 준비 및 마취.
- 저산소증 챔버에서 저산소증(그룹 2) 및 저산소증 + 7C1/let-7 miRNA(그룹 3) 마우스 케이지를 꺼내 케이지에서 동물을 조심스럽게 꺼냅니다.
참고: 7C1/let-7 miRNA(1.5mg/kg IV/용량)의 투여 요법은 치료 4주 동안 주당 2회입니다. 조사관은 IV 주입 중에 저산소증 및 저산소증 + 복합 처리 케이지를 모두 저산소증 챔버에서 꺼내 모든 동물이 시간 간격당 동일한 크기의 저산소증 노출을 받도록 하는 것이 좋습니다. - 정밀 저울을 사용하여 마우스의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다(그림 3A).
- 마우스를 마취 기화기에 연결된 마취 유도 챔버에 넣고 닫습니다(그림 3B). 열 지원을 제공하고 양쪽 눈에 눈 윤활제를 발라 마취 중 건조를 방지합니다. 의식을 잃을 때까지 마우스를 3% 이소플루란에 노출시킵니다(그림 3C-D).
- 챔버에서 마우스를 제거하고 턱에서 두개골 중앙까지 털을 깎습니다. 턱 각도에서 목 옆을 지나 어깨 쪽으로 털을 옆으로 면도합니다(그림 3E).
- 이소플루란 마취된 마우스를 해부 현미경 아래의 주입 플랫폼에서 누운 자세(배가 위로 향하게 함)에 놓습니다. 1.5% 이소플루란이 함유된 노즈콘을 통해 마취를 유지하고 접착 테이프로 네 다리를 부드럽게 고정하여 신체를 고정합니다(그림 3F).
- 적절한 수준의 마취를 보장하기 위해 직선 집게로 유해한 자극(예: 발가락 꼬집음)을 가합니다. 마취된 마우스는 수술 절차 전과 수술 내내 자극에 반응하지 않아야 합니다.
- 저산소증 챔버에서 저산소증(그룹 2) 및 저산소증 + 7C1/let-7 miRNA(그룹 3) 마우스 케이지를 꺼내 케이지에서 동물을 조심스럽게 꺼냅니다.
- 주입제 준비.
- 멸균 상태에서 1.5mg/kg의 용량으로 단일 용량 주사 화합물을 준비합니다.
알림: 차가운 물질을 주입하면 불편함과 쥐 체온이 떨어질 수 있으므로 주입 화합물을 실온(RT)으로 데우십시오(화합물이 손상되지 않는 경우). 이 연구에 사용된 화합물 7C1/let-7 miRNA의 최적 용량 및 지속 시간은 이전 간행물 8,9를 기반으로 합니다. - 멸균된 일회용 주사기에 주입할 용량을 로드합니다. 주사기를 똑바로 잡고 플런저를 전진시켜 주사기에서 공기를 배출합니다. 주사기를 재사용하지 마십시오.
- 25g 마우스에서 주입량을 200μL로 제한하여 동물에 대한 혈액 및 비정상적인 심장 영향의 발생률을 줄입니다. 더 큰 부피가 필요한 경우 주입 화합물을 10분 간격으로 두 번의 주입으로 나눕니다.
- 멸균 상태에서 1.5mg/kg의 용량으로 단일 용량 주사 화합물을 준비합니다.
- IV 주입을 위해 마우스를 준비합니다.
- 포비돈-요오드 용액과 70% 에탄올을 번갈아 가며 수술 부위를 세 번 부드럽게 문지릅니다. 수술 30분 전에 부프레노르핀(0.05mg/kg, SQ)을 투여합니다.
- 메스 칼날을 사용하여 목 정중선의 약간 오른쪽으로 0.5cm 세로로 자릅니다(그림 3G).
- 겸자를 사용하여 근육과 지방 조직을 분리하여 오른쪽 외부 경정맥을 찾습니다(그림 3H).
알림: 흉터가 생기지 않도록 매번 주사 부위를 회전시키십시오. - 고출력 대물 렌즈를 사용하여 주입 영역을 쉽게 시각화할 수 있습니다(그림 3I).
- IV 주사
- 바늘 경사가 위를 향하도록 하여 28G 멸균 바늘을 경정맥에 삽입합니다(그림 3J, K).
알림: 꼬리 정맥 주사는 경정맥 주사의 대안입니다. 그러나 이 기술은 정맥 깊이, 생쥐 꼬리 피부색 및 피부 경도의 가변성으로 인해 반복 투여를 수행하기 어렵습니다. - 주사기 플런저를 천천히 눌러 화합물을 정맥에 주입합니다. 주사제의 역류를 방지하기 위해 바늘이 추가로 10초 동안 정맥 내에 남아 있도록 합니다(그림 3L).
참고: 푸르스름한 염료를 사용하면 주입을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 시험 재료를 주입할 때 염료를 포함하지 마십시오. 부정확한 주입은 IV 주입 부위 주변에 푸르스름한 염료가 축적되는 결과를 낳습니다. - 바늘을 제거하고 면봉을 사용하여 주사 부위에 압력을 가하여 출혈을 방지합니다(그림 3M).
- 5-0 봉합사로 피부를 봉합합니다(그림 3N). 수술 후 동물을 따뜻하고 깨끗하며 건조한 장소로 옮기고 멜록시캠(1mg/kg, SQ, q24h)을 제공합니다. 침구가 없고 바닥이 종이 타월로 덮인 깨끗한 회복 케이지에 동물을 넣으십시오.
알림: 마우스는 마취에서 깨어나 회복 케이지로 돌아온 후 5분 이내에 의식을 회복해야 합니다. 마우스에 고통의 징후가 있는지 모니터링하십시오. - 동물을 홈 케이지로 되돌리고 마우스 케이지를 저산소증 챔버에 다시 넣습니다.
참고: 쥐를 마취하는 것부터 경정맥 주사를 마무리하는 것까지 전체 절차는 한 명의 실험자가 약 10-15분이 소요됩니다. 마우스에서 정상산소증 노출을 줄이려면 최소 두 명의 연구자가 협력하여 경정맥 주사 절차를 수행하는 것이 좋습니다.
- 바늘 경사가 위를 향하도록 하여 28G 멸균 바늘을 경정맥에 삽입합니다(그림 3J, K).
3. 혈압 측정
- 혈압 측정을 위한 기구를 준비합니다.
- 혈류역학적 측정 최소 30분 전에 37°C로 예열된 PBS에 1.0F 카테터 끝을 담그십시오(그림 4A).
- 카테터 삽입 부위에서 원하는 카테터 팁 위치까지의 거리를 측정합니다. 예를 들어, 쥐 상행 대동맥에서 목 중앙까지의 거리는 약 1-1.2cm입니다. 심장의 우심실에서 목 중앙까지의 거리는 약 2.3-2.8cm입니다.
- 삽입 깊이를 시각적으로 표시하기 위해 두 개의 카테터 거리 표시를 표시합니다(그림 4B).
- 카테터를 압력 변환기에 부착하고, 압력 변환기를 데이터 수집 장치의 입력 채널 1에 연결하고, 압력-볼륨 제어 장치를 켜고, 데이터 수집 혈압 분석 소프트웨어를 시작합니다. 새 혈압 분석 문서를 만들고 압력에 대한 채널 1을 설정합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 압력 보정을 수행합니다. 전체 설정이 최소 5분 동안 안정화되도록 합니다(그림 4C).
- 혈압 분석 소프트웨어의 채널 1 드롭다운 메뉴에서 단위 변환을 선택합니다(그림 4D, 빨간색 화살표).
- 기본 단위 변환 값을 설정합니다(그림 4E).
알림: 혈압은 수은 밀리미터(mmHg)로 표시됩니다. 압력 제어 장치의 표준화된 압력 출력은 1mmHg당 100V입니다. 25mmHg는 0.25V 출력에 해당하고 100mmHg는 1V 출력에 해당합니다.
- 혈압 측정 절차를 위해 마우스를 준비합니다.
- 노즈 콘을 통해 3% 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취합니다.
- 수의학 연고를 쥐 눈의 안구 표면에 직접 바르면 마취 상태에서 눈을 감을 수 없으므로 건조함을 방지합니다. 마취 상태에서 쥐의 목에서 털을 면도하십시오.
- 면도 부위를 포비돈-요오드 용액과 70% 에탄올 면봉으로 번갈아 3회 문지릅니다. 마취된 마우스를 해부 현미경 아래의 주입 플랫폼에 누운 자세로 놓습니다. 쥐의 코를 노즈콘에 넣어 수술 과정 내내 마취(1.5% 이소플루란)를 유지합니다.
- 유해한 자극에 대한 마취된 쥐의 운동 반응을 테스트합니다. 마취된 마우스는 수술 전과 수술 중에 유해한 자극에 반응해서는 안 됩니다.
알림: 흡입식(이소플루란) 및 주사용(케타민/자일라진) 마취제는 혈압을 낮출 수 있습니다. 일반적으로 이소플루란 흡입 마취는 케타민/자일라진보다 혈압을 낮추는 효과가 미미합니다. 따라서 이소플루란은 케타민/자일라진보다 선호되는 흡입제 마취제입니다. 적절한 마취 깊이를 달성하는 것은 정확하고 재현 가능한 혈류역학적 측정에 매우 중요합니다. 조사관은 각 마우스에 대해 마취 깊이를 일정하게 유지해야 합니다.
- 상행 대동맥 카테터 삽입
- 적절한 수준의 마취를 보장하기 위해 직선 집게로 유해한 자극(예: 발가락 꼬집음)을 가합니다. 하악골에서 흉골까지 피부의 정중선을 절개합니다(그림 5A).
- 타액선을 분리하고 기관을 노출시킵니다(그림 5B).
- 겸자를 사용하여 혈관을 따라 연조직을 제거하여 오른쪽 경동맥과 오른쪽 외부 경정맥을 노출시킵니다(그림 5C).
- 0.5mL의 PBS를 캐비티에 넣어 경동맥을 조작하면서 혈관 경련의 진행을 늦춥니다.
- 오른쪽 경동맥의 5mm 부분을 조심스럽게 분리합니다. 동맥이 더 잘 보이도록 혈관 아래에 멸균 백지를 배경으로 놓습니다(그림 5D).
알림: 미주 신경(흰색)을 동맥에서 조심스럽게 분리하고 신경이나 동맥을 자르거나 손상시키지 않도록 하십시오. - 8-0 사용 봉합사는 영구적인 매듭(#1)을 묶어 혈관의 두개골 끝을 닫습니다(그림 5E).
- 첫 번째 느슨한 매듭(#2)을 묶어 대동맥의 혈류를 일시적으로 차단합니다. 그런 다음 처음 두 개의 봉합사 사이에 두 번째 느슨한 매듭(#3)을 묶습니다(그림 5F). 두 번째 느슨한 매듭(#3)은 삽입 후 카테터를 빠르게 고정하는 데 사용됩니다.
- 25G 바늘을 사용하여 #3과 #1 합자 사이의 혈관과 일직선으로 카테터를 통과할 수 있을 만큼 큰 작은 구멍을 만듭니다(그림 5G).
알림: 경동맥은 심장에서 산소가 공급된 혈액을 운반하며 압력이 매우 높습니다. 경동맥이 절단되면 그 압력으로 인해 혈액이 분출됩니다(그림 5H). - 카테터 끝에서 1.5인치 떨어진 곳에 카테터 끝을 두고 동맥 구멍(X-표시)을 통해 카테터 끝을 부드럽게 삽입합니다. 카테터가 통과할 수 있는 카테터와 혈관 주위의 중간 봉합사(#3)를 조입니다(그림 5I-J).
참고: 이 단계는 연습이 필요합니다. 이 단계의 잠재적인 합병증에는 카테터 삽입 부위의 출혈과 혈관 경련이 포함됩니다. 출혈이 발생하면 출혈 동맥에서 출혈이 발생하여 혈액량이 감소하여 전신 혈압이 급격히 떨어집니다. 심각성으로 인해 동물은 인도적인 종점에 도달했으며 안락사시켜야 합니다. 기계적으로 유발된 혈관 경련의 경우 일반적으로 혈관의 지속적인 수축으로 인해 카테터 삽입 중에 발생합니다. 이로 인해 혈관 입구가 작아지고 카테터가 경동맥으로 전진하는 것을 방지할 수 있습니다. 카테터를 전진시키기 위해 저항에 무리한 힘을 가하지 마십시오. 중등도 또는 중증의 혈관 경련 저항이 발생하면 잠시 후 다시 시도하거나 더 작은 카테터(예: 1.0F)를 사용하십시오. 숙련된 미세외과 의사는 상행 대동맥 카테터 삽입에 대해 100% 성공률을 달성할 수 있습니다. - 카테터가 센서 팁으로 첫 번째 느슨한 매듭(#2)을 통과시킨 후 두 번째 느슨한 매듭(#3)을 더 단단히 조여 카테터를 고정하고 첫 번째 느슨한 매듭(#2)을 부드럽게 풉니다(그림 5K, L).
- 압력 분석 결과 동맥 혈압 프로파일이 나타날 때까지(그림 4B) 카테터의 표시에 따라 상행 대동맥 쪽으로 카테터를 계속 삽입합니다(그림 5M). 데이터 수집 시스템 및 소프트웨어를 사용하여 전신 혈압(SBP) 데이터를 기록합니다.
- 카테터를 빼낼 수 있도록 중간 봉합사(#3)를 풉니다(그림 5N).
- 카테터를 경동맥 밖으로 빼내기 전에 중간 봉합사(#3)를 혈관 주위에 묶습니다(그림 5O-P).
- PBS에 카테터를 삽입합니다.
- 우심 카테터 삽입.
- 오른쪽 외부 경정맥을 주변 결합 조직에서 조심스럽게 분리하고 모든 작은 가지를 8-0으로 결찰합니다. 봉합사(파란색 화살촉)(그림 6A).
참고: 오른쪽 심장 카테터 삽입의 경우 일반적으로 오른쪽 경정맥을 통해 심장에 접근합니다. - 8-0 사용 봉합, 영구적인 매듭(#1)을 묶어 혈관의 두개골 끝을 닫습니다(그림 6B). 그런 다음 혈관의 꼬리 끝에 느슨한 매듭(#2)을 묶습니다(그림 6C).
- 25G 바늘을 사용하여 영구 매듭(#1) 근위부에 작은 구멍을 만듭니다(그림 6D).
알림: 경정맥은 산소가 제거된 혈액을 심장으로 운반하고 압력이 낮습니다. 경정맥이 절단되면 혈액이 분출되지 않습니다(그림 6D, E). - 카테터를 잡고 카테터를 정맥 절단면(X-mark)에 삽입하고(그림 6E) 카테터와 혈관 주위의 꼬리 매듭(#2)을 조입니다(그림 6F).
- 카테터를 오른쪽 심장에 천천히 부드럽게 밀어 넣습니다. 카테터 마크를 기준으로 카테터 팁 깊이를 모니터링합니다(그림 4B).
참고: 폐쇄 흉부 마우스의 우심실 수축기 혈압(RVSP)을 평가하는 것은 복잡한 RV 해부학적 구조와 구조로 인해 어려운 일입니다. 이 단계에는 높은 수준의 전문 지식과 많은 연습이 필요합니다. 숙련된 미세외과 의사의 손에서 우심실 카테터 삽입 성공률은 90%에 육박할 수 있습니다. - 소프트웨어의 압력파 추적에 따라 카테터 팁 위치를 평가합니다. 카테터의 끝이 우심실에 있을 때 모니터에 일반적인 RVSP 추적이 표시됩니다(그림 6G, H).
알림: 폐압 곡선의 모양이 비정형적으로 보이면(예: 뾰족한 곡선) 이는 카테터의 위치가 잘못되었음을 의미합니다. 카테터를 약간 뒤로 부드럽게 당긴 다음 카테터를 우심실 내의 더 중앙 위치로 천천히 전진시켜 카테터 위치를 조정합니다. 연구 데이터에서 아티팩트가 생성되는 것을 방지하기 위해 연구자는 우심실 카테터 삽입 시 장기간(1분 이하) 또는 반복적인 시도(2회 이하)를 피해야 합니다. - 카테터를 움직이지 않고 5분 동안 데이터를 수집합니다.
- 녹음이 완료되면 카테터를 조심스럽게 당겨 빼내고 꼬리 매듭(#2)을 혈관 주위에 묶습니다(그림 6I). 카테터를 PBS 용액에 다시 넣습니다.
알림: 실험 완료 후 제조업체의 지침에 따라 1% 소화 효소 용액으로 카테터를 청소합니다. 혈류역학적 상태를 평가하는 것 외에도 조사관은 PAH 조직병리학적 검사를 위해 심장과 폐를 적출할 수 있습니다. 다중 IV bolus 투여의 효과를 보장하기 위해 연구자는 폐 내피 세포를 분리하고 let-7 miRNA 수준을 측정할 수 있습니다.
- 오른쪽 외부 경정맥을 주변 결합 조직에서 조심스럽게 분리하고 모든 작은 가지를 8-0으로 결찰합니다. 봉합사(파란색 화살촉)(그림 6A).
4. 혈압 데이터 분석
- 혈압 기록을 검사하십시오.
- 혈압 분석 소프트웨어 데이터 파일(PAH JOVE.adicht)을 엽니다.
- 채널 1에서 압력 신호를 나타내는 영역을 선택하고 파형 커서를 피크(X 표시)에 놓아 압력 진폭을 측정합니다(그림 7A).
- 압력파의 최대 진폭을 결정합니다. 이것은 수축기 혈압을 나타냅니다(그림 7A, 빨간색 화살표).
- Shift + Command + 3(Mac의 경우) 또는 Windows + Shift + S(Windows PC의 경우)를 눌러 이미지에서 관심 영역(그림 7B 회색 영역)을 추출하고 그래픽 파일에 붙여넣습니다.
- 혈압 데이터의 통계 분석.
- 통계 분석 소프트웨어에 개별 쥐 혈압 데이터를 입력합니다.
- 두 연구 그룹(정상산소증 대 저산소증, 저산소증 대 저산소증 + 7C1/let-7 miRNA)의 통계 분석을 위해 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 수행합니다. 평균값의 차이가 p < 0.05만큼 유의하다고 가정합니다.
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Representative Results
마취는 종종 혈압을 낮춥니다. 따라서 유해한 자극에 대한 반응으로 움직임을 폐지하기 위해 최소한의 마취제를 사용했습니다. 성공적인 우심실 접근은 정맥계의 여러 영역에서 혈류역학적 파형이 변화함에 따라 시각화할 수 있습니다(그림 8).
본 연구에서, 마우스는 노르목식(21%O2) 그룹(n=10), 저산소증(10%O2) 그룹(n=10) 또는 저산소증+7C1/let-7 치료군(n=10)에 무작위로 할당되었다. 저산소증 유발 PAH 발달 억제에서 let-7 miRNA의 효과를 조사하기 위해 제형화된 7C1/let-7 miRNA를 4주 동안 주 2회 1.5mg/kg의 용량으로 C57BL/6 마우스에 정맥 투여했습니다(그림 2D).
저산소증 또는 정상산소증에 노출된 지 4주 후, SBP 및 RVSP는 폐쇄형 흉부 마우스에서 측정되었습니다. 그림 9A 는 정상산소, 저산소증 또는 저산소증 + 7C1/let-7 miRNA 치료군의 대표적인 혈압 곡선을 보여줍니다. 노르목시아 대조군과 비교했을 때, RVSP는 저산소증 그룹에서 유의하게 증가했다. 또한, 저산소증 그룹과 비교했을 때, 마우스에서 7C1/let-7 miRNA 화합물을 사용한 치료는 RVSP를 현저히 감소시켰습니다(그림 9B). SBP는 어떤 그룹에서도 변화가 없었으며, 이는 이전 보고서7과 일치한다. 7C1/let-7 miRNA는 내피 세포를 표적으로 하여 TGFβ 신호전달 캐스케이드8을 감소시킵니다. 데이터는 7C1/let-7 miRNA 1.5mg/kg이 우심실의 혈압을 낮추는 데 매우 효과적임을 보여주며, 다중 IV bolus 투여의 효과를 보여줍니다.
그림 1: 폐동맥 고혈압 시술에 필요한 수술 기구 및 혈압 측정 장비. (A) PAH 시술에 사용되는 수술 도구. (B) 50mL 원뿔형 패키지의 스티로폼 랙을 감싼 흡수 패드로 만든 임시 주입 플랫폼. 10cm 길이의 마취관을 주사 플랫폼에 노즈콘으로 부착하는 타입. (C) 봉합 팩. 절개 봉합을 위한 5-0 봉합사 및 8-0 결찰을 위한 봉합사. (D-F) PAH 시술에 사용되는 혈압 측정 장비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PAH 유도를 위한 실험 설정. (A) BioSpherix 저산소 시스템 설치 사진. 유도 시스템의 다른 부분이 표시됩니다. (비씨) 저산소증 챔버O2 농도를 모니터링하는 산소 센서. (D) PAH 유도 중 모든 동물 그룹에 대한 7C1/let-7 miRNA 화합물 처리 및 산소 수준 노출에 대한 실험 일정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 경정맥 주사를 위한 주요 수술 단계 사진. (A) 체중계에 있는 마우스. (B) 설치류 마취 유도 시스템 설정. 유도 시스템의 다른 부분이 표시됩니다. (씨디) 유도 챔버에 있는 이소플루란 마취 쥐의 사진. (E) 모피가 제거된 수술 부위. (F) 쥐를 주입 플랫폼에 놓고 기화기의 노즈 콘을 통해 1.5% 이소플루란을 흡입했습니다. (G) 경정맥 접근을 위한 피부 절개. (H) 우측 외부 경정맥의 외과적 박리. (I) 고립된 우측 경정맥을 보여주는 고배율 영상. 혈관 아래에 흰 종이를 두어 정맥을 더 잘 볼 수 있도록 합니다. (제이케이) 경사를 위로 올린 상태에서 오른쪽 경정맥 바늘 삽입. (L) 청색을 띤 염료가 함유된 화합물을 경정맥에 주입합니다. (M) 바늘을 빼낸 후 면봉을 사용하여 주사 부위에 압력을 가합니다. (N) 5-0 봉합사로 상처 봉합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 카테터 보정. (A) 37°C로 예열된 PBS에 1.0F 카테터 팁을 담그기. (B) 상행 대동맥과 우심실에 카테터가 삽입된 깊이를 추정하는 데 도움이 되는 카테터의 거리 표시. (C) 제로 베이스라인 교정을 받는 혈압 측정 장비. (캘리포니아') 혈압 분석 소프트웨어 기반 카테터 기준선 분석의 스크린샷. (D) 채널 1 드롭다운 메뉴에서 혈압 분석 소프트웨어의 단위 변환 대화 상자를 선택합니다. (E) 기본 단위 변환 값을 설정하여 입력 전압 신호를 mmHg 단위로 변환합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 전신 혈압(SBP) 측정을 위한 수술 절차. (A) 목 피부의 하악에서 흉골까지의 정중선 절개. (B) 기관을 노출시키기 위한 타액선의 분리. (C) 조직 절제 후 노출된 우측 경동맥 및 우측 외부 경정맥. (D) 경동맥의 고립된 5mm 절편. (이,에프) 두개골 말단에 영구적인 매듭을 봉합하고 꼬리 말단에 두 개의 느슨한 매듭을 봉합합니다. (지,H) 영구 매듭(#1)에 꼬리 부분에 있는 경동맥에 작은 구멍(X-mark)을 만듭니다. (I) 경동맥에 카테터 삽입. (J) 중간 봉합사 매듭(#3)으로 카테터를 고정합니다. (케이, 엘) 첫 번째 느슨한 매듭(#2)을 부드럽게 풉니다. (M) 대표적인 동맥 압력파. (N) 중간 봉합사 마디(#3)를 풉니다. (O,P) 혈관 주위의 중간 봉합사(#3)를 조입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 우심실 수축기 혈압(RVSP) 측정을 위한 수술 절차. (A) 오른쪽 경정맥의 작은 가지(파란색 화살촉)의 결찰. (B) 경정맥의 두개골 끝에 있는 영구적인 매듭(#1). (C) 경정맥의 꼬리 끝에 있는 느슨한 매듭(#2). (D) 오른쪽 경정맥 꼬리에 영구매듭(#1)에 작은 구멍을 뚫습니다. (E) 작은 구멍(X-mark)을 통해 경정맥에 카테터를 삽입합니다. (F) 카테터와 혈관 주위의 꼬리 매듭(#2)을 조입니다. (G) 카테터를 심장의 우심실로 밀어 넣습니다. (H) 대표 RVSP. (I) 혈관 주위의 꼬리 마디(#2)를 조입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 기록 후 혈압 분석 소프트웨어 데이터 분석. (A) 파형 커서를 사용하여 채널 1의 원시 혈압 분석 소프트웨어 데이터에서 압력 진폭을 측정합니다. (B) 상기 원시 혈압 분석 소프트웨어 데이터 이미지로부터 관심 영역을 추출하는 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 우심실 카테터 삽입 중 혈역학적 파형 전환. (A-D) C57BL/6 마우스의 마우스 우심실 카테터 삽입 중 압력 변화의 대표적인 흔적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 혈압 분석 표현 수치 및 데이터 분석. (A) 정상산소증, 저산소증 및 저산소증 + 7C1/let-7 miRNA 처리 마우스의 대표적인 SBP 및 RVSP 곡선. (B) 정상산소증, 저산소증 및 저산소증 + 7C1/let-7 miRNA 처리 마우스에서 SBP 및 RVSP의 요약 플롯(NS: 유의하지 않음; **p < 0.01; ***p < 0.001; 짝을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정). N = 그룹당 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 피험자의 폐 혈관 저항 증가 사건을 모방하기 위해 여러 폐 고혈압 동물 모델이 확립되었습니다. 그 중 마우스 저산소증 유도 PAH 모델은 PAH에 대한 새로운 실험 요법의 효과를 평가하는 데 널리 사용되었습니다. 이 모델을 사용한 연구는 종종 마우스에 화합물을 투여해야 합니다. 발표된 다른 정맥(IV) 주사 및 침습적 혈류역학 평가 프로토콜과 비교할 때 이 방법은 시각적 설명과 자세한 설명을 모두 제공합니다.
절차의 성공적인 실행과 정확하고 재현 가능한 혈압 측정을 얻기 위한 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저 주사기 바늘이 경정맥에 올바르게 위치했는지 확인합니다. 잘못된 경정맥 주사는 피하 주사를 초래할 수 있습니다. 둘째, 충분한 마취 깊이를 확보하십시오. 각 마우스의 일관된 마취 깊이는 그룹 간에 비교할 수 있는 데이터를 생성하는 데 중요합니다. 너무 깊은 마취는 혈압 수치를 크게 감소시킬 수 있습니다. 이소플루란 흡입 마취 외에도 케타민/자일라진의 복강 내 주사는 마우스 수술에 널리 사용되는 또 다른 마취 방법입니다. 두 방법 모두 장점과 단점이 있습니다. 이소플루란 흡입 마취는 케타민/자일라진 주사제에 비해 빠른 발병, 조절 약물 없음, 빠른 회복 등 여러 가지 장점이 있으며 마취 깊이를 조절하기가 훨씬 쉽습니다. 단점은 장비 비용, 불쾌한 냄새 및 폐 마취 가스에 대한 인체 노출입니다. 셋째, 카테터가 심장의 우심실 내부에 있는지 확인하십시오. 우심실 카테터 삽입 시도가 장기간 또는 여러 번 실패하면 잘못된 혈압 수치가 발생할 수 있습니다.
마우스의 IV 주사는 주로 측면 꼬리 정맥을 통해 투여됩니다. 이 경로는 바늘로 쉽게 도달할 수 있지만 이 기술은 여러 IV bolus 투여를 수행하기 어려운 경우가 있습니다. 이 기술을 수행하는 데 있어 두 가지 주요 과제는 정맥 깊이의 가변성과 생쥐 꼬리 피부색 및 피부 경도로 인한 바늘 시각화의 어려움입니다. 더 중요한 것은 주사의 전체 내용물이 주변 조직이 아닌 혈류에 성공적으로 들어갔는지 확인할 방법이 없다는 것입니다. 경정맥은 (1) 임상적으로 관련성이 있고, (2) 정맥으로의 주사제 전달을 육안으로 확인할 수 있고, (3) 실험 과정에서 동물 그룹을 여러 번 주입할 수 있고, (4) 이 주사 기술은 안전하고, 시술이 부작용을 일으키지 않기 때문에 선호되는 접근 부위입니다.
생쥐의 혈압을 기록하는 방법에는 세 가지가 있다: (1) 비침습적 꼬리 커프 혈량측정법10. 이 시스템은 종단 연구 과정에서 반복적인 측정을 가능하게 합니다. (2) 무선 원격 측정11. 이 시스템을 사용하면 깨어 있고 자유롭게 움직이는 실험실 동물의 실시간 혈압을 모니터링할 수 있습니다. (3) 침습적 동맥내 카테터12. 이 시스템은 급성 SBP 및 RVSP 측정을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 충실도가 높은 전신 및 우심실 압력 측정을 위해 압력 카테터를 선택했습니다. 그러나 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 압력 카테터와 혈압 측정 장비가 고가입니다(그림 1E-F). 둘째, 동물을 마취해야 하므로 혈압이 저하됩니다. 셋째, 우심 카테터 삽입은 연속 측정이 불가능한 말단 시술입니다. 넷째, 잘 훈련된 미세외과 의사도 시술을 배우기 쉽지 않다.
혈압이 기록되면 조사관은 조직학적 PAH 특성 분석을 위해 동물에서 심장과 폐를 분리할 수 있습니다. 예를 들어, 우심실 비대에 대한 우심실 벽 두께 측정 및 근심실 폐동맥 리모델링을 위한 근육화된 폐 원위 혈관 분석. 데이터는 7C1/let-7 miRNA가 폐혈압을 낮추는 데 매우 효과적임을 보여주며, 이는 다중 IV bolus 투여의 효과를 보여줍니다. 또한 조사관은 새로 분리된 폐 전체에서 폐 내피 세포를 분리하여 주입된 물질의 효과를 평가할 수 있습니다.
요약하면, 이 프로토콜은 마우스 저산소증 유도 PAH 모델에서 다중 IV 볼루스 투여 및 침습적 혈류역학적 모니터링을 실행하기 위한 단계별 절차를 제공합니다. 조사관은 IV 주입 및 혈류역학적 모니터링이 필요한 다양한 설치류 모델에 대해 여기에 설명된 경정맥 주입 및 동맥/우심실 카테터 삽입 기술을 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
K Zsebo, M Simons, P-Y Chen은 VasoRx, Inc.의 설립자이자 주주이며, M Simons는 VasoRx, Inc.의 과학 자문 위원회 위원이며, HJ Duckers는 VasoRx의 직원이자 주주입니다. 다른 저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 P30AR070253(PYC), 심혈관 의학 연구 교육 기금(PYC), VasoRx, Inc. 기금(MS) 및 NIH 보조금 HL135582(MS), HL152197(MS)에 따라 제공되는 공동 생물학 컨소시엄 마이크로그랜트의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 prolene suture pack | Ethicon | 8698G | for incision closure |
| 8-0 nylon suture pack | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | for ligation |
| Anesthesia induction chamber | VETEQUIP | #941444 | Holds the animal during anesthesia exposure |
| Catheter Interface Cable PEC-4D | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000 | |
| Charcoal canister filters | VETEQUIP | #931401 | to help remove waste anesthetic gases |
| Cotton swabs | McKesson | 24-106 | for applying pressure to the injection site to prevent bleeding |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Surgical tools |
| Insulin syringe 28 G | EXEL | 26027 | for jugular vein IV injection |
| Isoflurane | COVETRUS | #029405 | for mouse anesthesia |
| LabChart 8 Software | ADInstruments | for data analysis | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) | Millar | for invasive blood pressure measurement | |
| Needle-25 G | BD | 305124 | for making a samll hole in a vessel |
| Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor | BioSpherix | E702 | for oxygen concentration monitoring |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation. |
|
| Prism 8 | GraphPad | for statistics and scientific graphing | |
| Semisealable hypoxia chamber | BioSpherix | an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | Surgical tools |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | Surgical tools |
| VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | Lot# B2-L-16Apr | IV injection compound |
| VIP 3000 Veterinary Vaporizer | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | for accurate anesthesia delivery |
References
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