Summary
Denne protokol giver en trinvis procedure til udførelse af flere intravenøse bolusdoser og invasiv hæmodynamisk overvågning hos mus. Efterforskere kan bruge denne protokol til fremtidig terapeutisk sammensat screening for pulmonal arteriehypertension.
Abstract
Pulmonal arteriel hypertension (PAH) er en progressiv livstruende sygdom, der primært påvirker små lungearterioler i lungen. I øjeblikket er der ingen kur mod PAH. Det er vigtigt at opdage nye forbindelser, der kan anvendes til behandling af PAH. Den musehypoxi-inducerede PAH-model er en meget anvendt model til PAH-forskning. Denne model rekapitulerer humane kliniske manifestationer af PAH gruppe 3 sygdom og er et vigtigt forskningsværktøj til at evaluere effektiviteten af nye eksperimentelle terapier til PAH. Forskning ved hjælp af denne model kræver ofte administration af forbindelser i mus. For en forbindelse, der skal gives direkte ind i blodbanen, er optimering af intravenøs (IV) administration en vigtig del af de eksperimentelle procedurer. Ideelt set bør IV-injektionssystemet tillade flere injektioner over et bestemt tidsforløb. Selvom den mushypoxi-inducerede PAH-model er meget populær i mange laboratorier, er det teknisk udfordrende at udføre flere IV-bolusdoseringer og invasiv hæmodynamisk vurdering i denne model. I denne protokol præsenterer vi trinvise instruktioner om, hvordan man udfører flere IV-bolusdoser via musens jugularvene og udfører arteriel og højre ventrikleketerisering til hæmodynamisk vurdering i musehypoxi-induceret PAH-model.
Introduction
Pulmonal arteriehypertension (PAH) defineres ved et gennemsnitligt lungearteriesystolisk tryk større end 20 mmHg i hvile 1,2. Det er en progressiv og dødelig sygdom karakteriseret ved en vedvarende forhøjelse af lungearterielt tryk, hvilket fører til overbelastning af højre ventrikel og i sidste ende død på grund af højre ventrikelsvigt1. I øjeblikket er der ingen kur mod PAH.
Anvendelsen af dyremodeller for pulmonal hypertension er vigtig for at teste effektiviteten af eksperimentelle PAH-terapier. Blandt disse modeller har den musehypoxi-inducerede PAH-model givet nøgleindsigt i human PAH gruppe 3 sygdomsudvikling 3,4. Forskning ved hjælp af denne model kræver ofte administration af forbindelser i mus for at evaluere den nye forbindelses effektivitet og sikkerhed. Derfor har forskere brug for en detaljeret eksperimentel procedure for sammensat dosering og hæmodynamiske målinger for at sikre injektionskonsistens og blodtryksmålingsreproducerbarhed fra begyndelsen til slutningen.
Metoder til intravenøs (IV) injektion og blodtryksmåling er rapporteret i litteratur 5,6. Metoden mangler imidlertid visuel illustration og detaljeret beskrivelse. Her illustrerer vi de vigtigste trin for en vellykket IV bolusinjektion og nøjagtig måling og registrering af systemisk og højre ventrikel blodtryk. De procedurer, der præsenteres her, er en vigtig ressource for efterforskere, der er interesseret i IV-ruten for platform til administration af forbindelser til udvikling af en behandling for PAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført under protokoller godkendt af Yale University Institutional Animal Care and Use Committees.
1. Forberedelse af dyr, værktøjer, blodtryksmåleudstyr og hypoxikammer
- Akklimatisering af dyr.
BEMÆRK: Forsøgsdyr, der blev anvendt til denne undersøgelse, var 8 uger gamle C57BL/6-hanmus, der vejede 25-27 g. Flere faktorer bør tages i betragtning ved estimering af antallet af dyr, der kræves til forsøget, herunder kirurgisk relateret dødelighed, uventede kirurgiske komplikationer og pludselig uventet død. Brug mindst 10 mus pr. Gruppe for at nå statistisk styrke og undgå underdrevne undersøgelser.- Ved modtagelse skal dyrene opbevares i ventilerede gnaverbure (grupper på fem dyr pr. Bur) forsynet med passende strøelse, gnaverchow og vand. Lad dyrene vænne sig til det nye miljø (12 timers lys-mørk cyklus ved 18-20 °C) i mindst 3 dage.
- Tildel dem tilfældigt til følgende grupper: Normoxia (gruppe 1), hypoxi (gruppe 2) og hypoxi + 7C1 / let-7 miRNA (gruppe 3).
- Kirurgiske værktøjer og forberedelse af blodtryksmåleudstyr.
- Steriliser alle kirurgiske værktøjer ved autoklavering (figur 1A).
- Forbered en provisorisk injektionsplatform med en hjemmelavet anæstesinæsekegle (figur 1B), suturpakker (figur 1C) og udstyr til PAH-proceduren (figur 1D-F).
- Eksperimentel indstilling for induktion af pulmonal arteriehypertension (PAH).
- IndstilN2-tanken , iltføleren og det halvforseglbare hypoxikammer (figur 2A).
- Der etableres et sætpunkt på 10 %O2 i iltføleren, og systemet når steady-state (figur 2B, C).
- Hold hypoxi (gruppe 2) og hypoxi + 7C1 / let-7 miRNA (gruppe 3) dyr i hypoxi (10%O2) i 3 uger. Efter 3 ugers hypoxi anbringes dyrene under normoxiske forhold i 1 uge (figur 2D). Den normoxiske gruppe (gruppe 1) forbliver i normoxia i 4 uger.
BEMÆRK: (1) 3 ugers hypoxi efterfulgt af 1 uges normoxia er en veletableret metode til udvikling af PAH og hjertesvigt i højre ventrikel7. Oxygensensoren registrererO2-koncentrationen inde i det halvforseglbare hypoxikammer og korrigerer den ved at infundereN2-gas gennem gasinfusionsrøret. - Undersøg dyrene dagligt i hele forsøgets varighed (3 uger). Kontakt en dyrlæge, hvis dyrene udviser tegn på nød, såsom dramatisk vægttab og vejrtrækningsbesvær. Hvis eutanasi er nødvendig for dyr i alvorlig nød, skal dyret udelukkes fra undersøgelsen.
BEMÆRK: Hypoxi eksponering forårsager mus vægttab. Et tab på 10% kropsvægt bruges typisk som en pålidelig indikation af PAH-udvikling. - Undgå omfattende åbning af hypoxikammeret. Til rengøring af bur, genopfyldning af mad, skift af vandflasker og sammensat administration skal du åbne kamrene i højst 1 time om ugen.
2. Intravenøs bolusinjektion via halsvenen
- Mus forberedelse og anæstesi.
- Tag hypoxi (gruppe 2) og hypoxi + 7C1/let-7 miRNA (gruppe 3) musebure ud af hypoxikammeret og fjern forsigtigt dyret fra buret.
BEMÆRK: Doseringsregimen for 7C1/let-7 miRNA (1,5 mg/kg IV/dosis) er to gange om ugen i 4 ugers behandling. Det anbefales, at efterforskere tager både hypoxi og hypoxi + sammensatte behandlingsbure ud af hypoxikammeret under IV-injektion for at sikre, at alle dyrene får samme størrelse af hypoxieksponering pr. Tidsinterval. - Vej musen ved hjælp af en præcisionsvægt, og registrer dens vægt (figur 3A).
- Placer musen i et anæstesiinduktionskammer, der er forbundet med bedøvelsesfordamperen, og luk den (figur 3B). Giv termisk støtte og påfør øjensmøremiddel på begge øjne for at forhindre tørring under bedøvelse. Udsæt musen for 3 % isofluran, indtil den er bevidstløs (figur 3C-D).
- Fjern musen fra kammeret og barber pelsen fra kæben kranielt til midten af brystbenet kausalt. Sideværts barberes pelsen fra kæbevinklerne, gennem siderne af nakken og mod skuldrene (figur 3E).
- Placer den isofluranbedøvede mus i liggende stilling (mavesiden opad) på en injektionsplatform under et dissektionsmikroskop. Vedligehold bedøvelsen via en næsekegle med 1,5% isofluran og fasthold forsigtigt de fire ben med tape for at immobilisere kroppen (figur 3F).
- Påfør en skadelig stimulus (dvs. tåklemme) med lige tang for at sikre et passende niveau af anæstesi. Den bedøvede mus bør ikke reagere på stimuleringen før og under hele den kirurgiske procedure.
- Tag hypoxi (gruppe 2) og hypoxi + 7C1/let-7 miRNA (gruppe 3) musebure ud af hypoxikammeret og fjern forsigtigt dyret fra buret.
- Forberedelse af injektionsmiddel.
- Forbered en enkeltdosis injektionsforbindelse i en dosis på 1,5 mg/kg under sterile forhold.
BEMÆRK: Opvarm injektionsforbindelsen til stuetemperatur (RT), da injektion af kolde stoffer kan forårsage ubehag og et fald i musens kropstemperatur (hvis dette ikke beskadiger forbindelsen). Den optimale dosis og varighed af forbindelsen 7C1/let-7 miRNA anvendt i denne undersøgelse er baseret på tidligere publikationer 8,9. - Fyld den sterile engangssprøjte med den mængde, der skal injiceres. Hold sprøjten lodret, og før stemplet frem for at presse luften ud af sprøjten. Genbrug ikke sprøjten.
- Begræns injektionsvolumenet til 200 μl i en mus på 25 g for at reducere forekomsten af hæmodilution og abnorme kardiale virkninger på dyrene. Hvis der kræves et større volumen, deles injektionsblandingen i to injektioner med et interval på 10 min.
- Forbered en enkeltdosis injektionsforbindelse i en dosis på 1,5 mg/kg under sterile forhold.
- Forbered mus til IV-injektion.
- Skrub forsigtigt det kirurgiske område tre gange med tre vekslende runder povidon-jodopløsning og 70% ethanol. Administrer buprenorphin (0,05 mg/kg, SQ) 30 minutter før det kirurgiske indgreb.
- Lav et 0,5 cm langsgående snit lidt til højre for halsens midterlinje ved hjælp af et skalpelblad (figur 3G).
- Brug tang til at adskille muskel- og fedtvævet for at finde den rigtige ydre halsvene (figur 3H).
BEMÆRK: Skift injektionssted hver gang for at undgå ardannelse. - Brug et objektivobjektiv med høj effekt for at muliggøre nem visualisering af injektionsområdet (figur 3I).
- IV injektion
- Indsæt en 28 G steril kanyle i halsvenen med kanylen opad (figur 3J, K).
BEMÆRK: Haleveneinjektion er et alternativ til jugular veneinjektion. Denne teknik er imidlertid vanskelig at udføre gentagen dosering på grund af variationen i venedybde, musehalehudfarve og hudhårdhed. - Tryk langsomt på sprøjtestemplet for at injicere forbindelsen i venen. Lad nålen forblive i venen i yderligere 10 s for at forhindre tilbageløb af injektionsmidlet (figur 3L).
BEMÆRK: Det blålige farvestof giver mulighed for nem visualisering af injektionen. Medtag ikke farvestoffet, når du injicerer testmaterialer. En unøjagtig injektion vil resultere i akkumulering af blåligt farvestof omkring IV-injektionsstedet. - Fjern kanylen og brug en vatpind til at trykke på injektionsstedet for at forhindre blødning (figur 3M).
- Sutur huden med 5-0 sutur (figur 3N). Efter operationen flyttes dyret til et varmt, rent, tørt område og tilvejebringes Meloxicam (1 mg/kg, SQ, q24h). Anbring dyret i et rent genopretningsbur uden strøelse, men bunden dækket af et køkkenrulle.
BEMÆRK: Musen skal være vågen fra anæstesi og genvinde bevidstheden inden for 5 minutter efter tilbage til restitutionsburet. Overvåg musen for tegn på nød. - Sæt dyrene tilbage i deres hjemmebur og sæt museburet tilbage i hypoxikammeret.
BEMÆRK: Hele proceduren, fra bedøvelse af en mus til efterbehandling af jugular veneinjektion, tager ca. 10-15 minutter af en enkelt eksperimentator. For at forkorte normoxiaeksponeringen hos mus anbefales det, at mindst to efterforskere samarbejder om at udføre en jugular veneinjektionsprocedure.
- Indsæt en 28 G steril kanyle i halsvenen med kanylen opad (figur 3J, K).
3. Blodtryksmåling
- Forbered instrumenter til blodtryksmåling.
- Spidsen af 1,0 F-kateteret lægges i blød i 37 °C forvarmet PBS mindst 30 minutter før hæmodynamisk måling (figur 4A).
- Mål afstanden fra kateterindsættelsesstedet til den ønskede placering af kateteretspidsen. For eksempel er afstanden mellem musens stigende aorta til midten af nakken ca. 1-1,2 cm. Afstanden mellem hjertets højre ventrikel til midten af nakken er ca. 2,3-2,8 cm.
- Markering af to kateterafstandsmarkeringer for at give en visuel indikation af indføringsdybden (figur 4B).
- Fastgør kateteret til tryktransduceren, tilslut tryktransduceren til indgangskanal 1 på dataindsamlingsenheden, tænd trykvolumenkontrolenheden, og start dataindsamlingsblodtryksanalysesoftware. Opret et nyt blodtryksanalysedokument, og indstil kanal 1 for tryk.
- Udfør en trykkalibrering i henhold til producentens protokol. Lad hele opsætningen stabilisere sig i mindst 5 minutter (figur 4C).
- I blodtryksanalysesoftware skal du vælge Enhedskonvertering i rullemenuen Kanal 1 (Figur 4D, rød pil).
- Indstil standardværdierne for omregning af enheder (figur 4E).
BEMÆRK: Blodtrykket er repræsenteret som millimeter kviksølv (mmHg). Den standardiserede trykydelse fra trykreguleringsenheden er 1 V pr. 100 mmHg. 25 mmHg svarer til 0,25 V udgang, og 100 mm Hg svarer til 1 V udgang.
- Forbered musen til blodtryksmålingsprocedure.
- Bedøv musen med 3% isofluran indånding gennem en næsekegle.
- Påfør veterinærsalven direkte på den okulære overflade af musens øjne for at forhindre tørhed, da musen ikke kan lukke øjnene under anæstesi. Barber pelsen fra musens hals, mens du er under bedøvelse.
- Skrub det barberede område med tre vekslende runder povidon-jodopløsning og 70% ethanolpind. Placer den bedøvede mus i liggende stilling på en injektionsplatform under et dissektionsmikroskop. Placer musens næse i næsekeglen for at opretholde anæstesi (1,5% isofluran) under hele den kirurgiske procedure.
- Test den bedøvede mus' motoriske reaktion på den skadelige stimulus. Den bedøvede mus bør ikke reagere på en skadelig stimulus før og under operationen.
BEMÆRK: Inhalerbare (isofluran) og injicerbare (ketamin / xylazin) anæstetika kan sænke blodtrykket. Generelt har isofluran inhalationsanæstesi en lille effekt på at sænke blodtrykket end ketamin / xylazin. Derfor er isofluran det foretrukne inhalationsbedøvelsesmiddel frem for ketamin/xylazin. Opnåelse af den passende dybde af anæstesi er afgørende for nøjagtige og reproducerbare hæmodynamiske målinger. Efterforskeren skal holde dybden af anæstesi konstant for hver mus.
- Stigende aorta kateterisering
- Påfør en skadelig stimulus (dvs. tåklemme) med lige tang for at sikre et passende niveau af anæstesi. Lav et midterlinjesnit i huden fra underkæben til brystbenet (figur 5A).
- Adskil spytkirtlerne og udsæt luftrøret (figur 5B).
- Brug tang til at rydde blødt væv langs karrene for at udsætte højre halspulsåre og højre ydre jugularvene (figur 5C).
- Sæt 0,5 ml PBS i hulrummet for at bremse udviklingen af vasospasme, mens du manipulerer halspulsåren.
- Isoler forsigtigt en 5 mm sektion af højre halspulsåre. Placer et stykke sterilt hvidt papir under beholderen som baggrund for at gøre arterien mere synlig (figur 5D).
BEMÆRK: Adskil forsigtigt vagusnerven (hvid) fra arterien og sørg for ikke at skære eller beskadige nerven eller arterien. - Brug af en 8-0 sutur binder en permanent knude (# 1) for at lukke fartøjets kranieende (figur 5E).
- Bind en første løs knude (# 2) for midlertidigt at blokere blodgennemstrømningen fra aorta. Bind derefter en anden løs knude (# 3) mellem de to første suturer (figur 5F). Den anden løse knude (# 3) vil blive brugt til hurtigt at fastgøre kateteret efter placering.
- Brug en 25 G nål til at lave et lille hul, stort nok til at passere kateteret, på linje med beholderen mellem #3 og #1 ligaturer (figur 5G).
BEMÆRK: Carotidarterier bærer iltet blod fra hjertet og har meget højt tryk. Hvis halspulsåren skæres, vil dette tryk få blodet til at sprøjte ud (figur 5H). - Hold kateteret 1,5 inches fra spidsen og indsæt forsigtigt spidsen af kateteret gennem hullet i arterien (X-mærke). Stram den midterste suturknude (# 3) omkring kateteret og beholderen, der stadig tillader passage af kateteret (figur 5I-J).
BEMÆRK: Dette trin kræver øvelse. De potentielle komplikationer med dette trin omfatter blødning på kateterindsættelsesstedet og vasospasme. Når blødning opstår, reducerer blodtab fra bløderarterien blodvolumen, hvilket fører til et alvorligt fald i systemisk blodtryk. På grund af sværhedsgraden har dyret nået et humant endepunkt og skal aflives. For mekanisk induceret vasospasme forekommer det normalt under kateterindsættelse forårsaget af en vedvarende sammentrækning af blodkarrene. Dette gør blodkarets åbning mindre og forhindrer kateter fremskridt til halspulsåren. Brug ikke overdreven kraft mod modstand for at fremme kateteret. Når der opstår moderat eller svær vasospasmeresistens, skal du prøve igen om lidt eller bruge et mindre kateter (f.eks. 1,0 F). Erfarne mikrokirurger kan opnå 100% succesrater for stigende aorta kateterisering. - Når kateteret har passeret den første løse knude (# 2) med sensorspidsen, fastgøres den anden løse knude (# 3) tættere for at fastgøre kateteret og forsigtigt frigøre den første løse knude (# 2) (figur 5K, L).
- Fortsæt med at indsætte kateteret mod den stigende aorta i henhold til mærket på kateteret (figur 4B), indtil trykanalysen viser en arteriel blodtryksprofil (figur 5M). Optag systemiske blodtryksdata (SBP) ved hjælp af dataindsamlingssystemet og softwaren.
- Løsn den midterste suturknude (# 3), så kateteret kan trækkes ud (figur 5N).
- Bind den midterste suturknude (# 3) rundt om karret, inden kateteret trækkes ud af halspulsåren (figur 5O-P).
- Kateteret anbringes i PBS.
- Højre hjerte kateterisering.
- Isoler forsigtigt den højre ydre jugularvene fra det omgivende bindevæv og ligeret alle de små grene med 8-0 sutur (blå pilespidser) (figur 6A).
BEMÆRK: For højre hjerte kateterisering, hjertet er almindeligt tilgængelige via højre jugular vene. - Brug af en 8-0 sutur, binde en permanent knude (# 1) for at lukke fartøjets kranieende (figur 6B). Bind derefter en løs knude (# 2) på beholderens kaudale ende (figur 6C).
- Brug en 25 G nål til at gøre et lille hul proksimalt til den permanente knude (# 1) (figur 6D).
BEMÆRK: Jugular vener bærer deoxygeneret blod til hjertet og har lavt tryk. Hvis halsvenen skæres, sprøjter blodet ikke ud (figur 6D, E). - Hold kateteret og sæt kateteret ind i venens snit (X-mærke) (figur 6E), og stram den kaudale knude (# 2) omkring kateteret og beholderen (figur 6F).
- Skub langsomt og forsigtigt kateteret ind i det rigtige hjerte. Overvåg kateterspidsdybden baseret på katetermærket (figur 4B).
BEMÆRK: Vurdering af det højre ventrikulære systoliske tryk (RVSP) hos mus med lukket bryst er en udfordring på grund af den komplekse RV-anatomi og struktur. Dette trin kræver et højt niveau af ekspertise og masser af øvelse. I hænderne på en erfaren mikrokirurg kan den vellykkede sats for højre ventrikleketerisering nærme sig 90%. - Vurder kateterspidsens position i henhold til trykbølgesporing i softwaren. Når spidsen af kateteret er i højre ventrikel, viser monitoren en typisk RVSP-sporing (figur 6G, H).
BEMÆRK: Når formen på pulmonale trykkurver ser atypisk ud (f.eks. Spidse kurver), indebærer dette forkert placering af kateteret. Juster kateterets position ved forsigtigt at trække kateteret lidt tilbage og derefter langsomt føre kateteret til en mere central position i højre ventrikel. For at undgå generering af artefakter i forskningsdata bør efterforskeren undgå langvarige (højst 1 min) eller gentagne forsøg (ikke mere end to forsøg) ved kateterisering af højre ventrikel. - Hold kateteret immobilt og opsaml dataene i 5 min.
- Når optagelsen er færdig, trækkes kateteret forsigtigt ud og bindes haleknuden (# 2) rundt om beholderen (figur 6I). Kateteret anbringes tilbage i PBS-opløsningen.
BEMÆRK: Efter afslutningen af eksperimentet rengøres kateteret med 1% fordøjelsesenzymopløsning i henhold til producentens anvisninger. Ud over at vurdere hæmodynamisk status kan efterforskere høste hjerter og lunger til PAH histopatologisk undersøgelse. For at sikre effektiviteten af flere IV bolusdosering kan efterforskere isolere lungeendotelceller og måle let-7 miRNA-niveauer.
- Isoler forsigtigt den højre ydre jugularvene fra det omgivende bindevæv og ligeret alle de små grene med 8-0 sutur (blå pilespidser) (figur 6A).
4. Analyse af blodtryksdata
- Undersøg blodtryksregistreringen.
- Åbn datafilen til blodtryksanalysesoftware (PAH JOVE.adicht).
- I kanal 1 skal du vælge et område, der repræsenterer tryksignalet, og placere bølgeformmarkøren på toppen (X-mærket) for at måle trykamplitude (figur 7A).
- Bestem trykbølgens maksimale amplitude. Dette repræsenterer det systoliske tryk (figur 7A, rød pil).
- Uddrag interesseområdet (figur 7B gråzone) fra billedet ved at trykke på Skift + Kommando + 3 (til Mac) eller Windows + Shift + S (til Windows PC) og indsæt det i en grafikfil.
- Statistisk analyse af blodtryksdata.
- Indtast de enkelte museblodtryksdata i statistisk analysesoftware.
- Udfør en uparret elevs t-test til statistisk analyse af to studiegrupper (normoxia vs. hypoxi; hypoxi vs. hypoxi + 7C1/let-7 miRNA). Overvej forskellene i middelværdier så signifikante som p < 0, 05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anæstesi reducerer ofte blodtrykket. Derfor blev en minimumsdosis anæstesi brugt til at afskaffe bevægelserne som reaktion på en skadelig stimulus. Vellykket adgang til højre ventrikelkammer kan visualiseres, da den hæmodynamiske bølgeform ændres i forskellige regioner af venøse systemer (figur 8).
I denne undersøgelse blev mus tilfældigt tildelt den normoxiske (21%O2) gruppe (n = 10), hypoxi (10%O2) gruppe (n = 10) eller hypoxi + 7C1 / let-7 behandlingsgruppe (n = 10). For at undersøge effekten af let-7 miRNA i undertrykkelsen af hypoxi-induceret PAH-udvikling blev formuleret 7C1/let-7 miRNA administreret til C57BL/6-musene intravenøst i en dosis på 1,5 mg/kg to gange om ugen i 4 uger (figur 2D).
4 uger efter eksponering for hypoxi eller normoxia blev SBP og RVSP målt i en mus med lukket bryst. Figur 9A viser den repræsentative blodtrykskurve fra normoxic-, hypoxi- eller hypoxi- + 7C1/let-7 miRNA-behandlingsgrupperne. Sammenlignet med dem i normoxia-kontrolgruppen var RVSP signifikant øget i hypoxigruppen. Sammenlignet med hypoxigruppen resulterede behandling med 7C1/let-7 miRNA-forbindelse hos mus desuden i signifikant nedsat RVSP (figur 9B). SBP ændrede sig ikke i nogen grupper, hvilket er i overensstemmelse med de tidligere rapporter7. 7C1/let-7 miRNA er målrettet mod endotelceller og reducerer TGFβ signalkaskade8. Dataene viser, at 7C1/let-7 miRNA 1,5 mg/kg er yderst effektivt til at sænke blodtrykket i højre ventrikel, hvilket viser effektiviteten af multipel IV bolusdosering.
Figur 1: Kirurgiske instrumenter og blodtryksmåleudstyr, der kræves til pulmonal arteriehypertensionsprocedurer. (A) Kirurgiske værktøjer, der anvendes til PAH-proceduren. (B) En provisorisk injektionsplatform fremstillet af en absorberende pude viklet rundt om et isoporstativ fra en 50 ml konisk emballage. Fastgørelse af et 10 cm langt anæstesirør til injektionsplatformen som næsekegle med type. C) Suturpakninger. 5-0 sutur til snitlukning og 8-0 sutur til ligering. (D-F) Blodtryksmåleudstyr, der anvendes til PAH-proceduren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksperimentel indstilling for PAH-induktion. (A) Fotografi af opsætning af BioSpherix hypoxisk system. Forskellige dele af induktionssystemet er angivet. (B-C) Oxygensensor overvåger hypoxikammeretO2-koncentrationen. (D) Eksperimentel tidslinje for 7C1/let-7 miRNA-forbindelsesbehandling og eksponering for iltniveau for alle dyregrupper under PAH-induktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fotografier af vigtige kirurgiske trin til jugular veneinjektion. (A) Mus på en vægtskala. (B) Opsætning af induktionssystem til gnaverbedøvelse. Forskellige dele af induktionssystemet er angivet. (C-D) Billeder af en isofluranbedøvet mus i et induktionskammer. (E) Pelsfjernet kirurgisk zone. (F) En mus placeret på en injektionsplatform og åndede 1,5% isofluran gennem en næsekegle fra en fordamper. (G) Hudindsnit til jugular vene tilgang. (H) Kirurgisk dissektion af højre ydre jugular vene. (I) Højere forstørrelsesbilleddannelse, der viser den isolerede højre halsvene. Bemærk et hvidt papir under karret, hvilket gør venen mere synlig. (J-K) Højre jugular venenål indsættelse med skrå op. (L) Injektion af en forbindelse med blåligt farvestof i halsvenen. (M) Tryk på injektionsstedet med en vatpind efter udtagning af kanylen. (N) Suturering af såret med en 5-0 sutur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kateterkalibrering. A) Iblødsætning af 1,0 F-kateterspidsen i forvarmet PBS ved 37 °C. (B) Afstandsmarkeringer på kateteret for at hjælpe med at estimere dybden af indsættelsen af kateteret i den stigende aorta og højre ventrikel. C) Blodtryksmåleudstyr, der gennemgår en basislinjekalibrering på nul. (Ca') Skærmbillede af blodtryksanalyse softwarebaseret kateter baseline analyse. (D) Under rullemenuen Kanal 1 skal du vælge dialogboksen Enhedskonvertering i blodtryksanalysesoftwaren. (E) Indstilling af standardenhedskonverteringsværdier for at konvertere indgangsspændingssignalet til mmHg-enhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kirurgiske procedurer for systemiske blodtryksmålinger (SBP). (A) Et midterlinjesnit fra underkæben til brystbenet på halsens hud. (B) Adskillelse af spytkirtlen for at afsløre luftrøret. (C) Eksponeret højre halspulsåre og højre ydre halsvene efter vævsdissektion. D) En isoleret 5 mm sektion af halspulsåren. (E,F) Sutur permanent knude ved kranieekstremiteten og to løse knuder ved kaudale ekstremiteten. (G,H) At lave et lille hul (X-mærke) på halspulsåren bare kaudale til den permanente knude # 1. (I) Indsættelse af kateteret i halspulsåren. (J) Fastgørelse af kateteret med en midterste suturknude (# 3). (K,L) Slip forsigtigt den første løse knude # 2. (M) Repræsentative arterielle trykbølger. (N) Løsning af den midterste suturknude (# 3). (O,P) Stram den midterste suturknude # 3 rundt om fartøjet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kirurgiske procedurer for målinger af systolisk tryk i højre ventrikel (RVSP). (A) Ligering af de små grene af højre jugularvene (blå pilespidser). (B) En permanent knude # 1 på kranienden af halsvenen. (C) En løs knude (# 2) på den kaudale ende af halsvenen. (D) Lav et lille hul på højre jugular vene kaudal til den permanente knude # 1. (E) Indsættelse af et kateter i halsvenen gennem et lille hul (X-mærke). (F) Spænd den kaudale knude # 2 omkring kateteret og beholderen. (G) Skubbe kateteret ind i hjertets højre ventrikel. h) Repræsentant RVSP. (I) Stramning af den kaudale knude # 2 omkring fartøjet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Dataanalyse af blodtryksanalyse efter optagelse. (A) Brug af bølgeformmarkør til at måle trykamplitude fra de rå blodtryksanalysesoftwaredata i kanal 1. (B) Udtrækning af interesseområdet fra databilledet for rå blodtryksanalysesoftware. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Hemodynamisk bølgeformovergang under kateterisering af højre ventrikel. (A-D) Repræsentative spor af trykændringer under kateterisering af en C57BL/6-mus i højre ventrikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Repræsentationstal for blodtryksanalyse og dataanalyse. (A) Repræsentative SBP- og RVSP-kurver i normoxia, hypoxi og hypoxi + 7C1/let-7 miRNA-behandlede mus. (B) Sammenfattende plots af SBP og RVSP i normoxia, hypoxi og hypoxi + 7C1/let-7 miRNA-behandlede mus (NS: ikke signifikant; **p < 0,01; ***p < 0,001; uparret tosidet elevs t-test). N = 10 pr. Gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere pulmonal hypertension dyremodeller er blevet etableret for at efterligne de forhøjede pulmonale vaskulære resistenshændelser hos mennesker. Blandt dem er den musehypoxi-inducerede PAH-model blevet brugt i vid udstrækning til evaluering af effektiviteten af nye eksperimentelle terapier til PAH. Forskning ved hjælp af denne model kræver ofte administration af forbindelser til musene. I sammenligning med andre offentliggjorte intravenøse (IV) injektions- og invasive hæmodynamiske vurderingsprotokoller giver denne metode både visuel illustration og detaljeret beskrivelse.
Der er tre kritiske trin for en vellykket gennemførelse af proceduren og for at opnå nøjagtige og reproducerbare blodtryksmålinger. Først skal du sikre dig, at kanylen er korrekt placeret i halsvenen. Forkert jugular veneinjektion kan resultere i subkutan injektion. For det andet skal du sikre den tilstrækkelige dybde af anæstesi. Konsekvent bedøvelsesdybde i hver mus er vigtig for generering af data, der er sammenlignelige mellem grupper. For dyb anæstesi kan forårsage et signifikant fald i blodtryksniveauet. Ud over isofluraninhalationsanæstesi er intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin en anden meget anvendt anæstetisk metode til musekirurgi. Begge metoder har fordele og ulemper. Isofluran inhalationsanæstesi har flere fordele i forhold til injicerbar ketamin / xylazin, herunder hurtig debut, ingen kontrollerede lægemidler, hurtig genopretning og er meget lettere at kontrollere dybden af anæstesi. Ulemperne er omkostningerne ved udstyret, ubehagelig lugt og menneskelig eksponering for affaldsbedøvelsesgasser. For det tredje skal du sikre dig, at kateteret er inde i hjertets højre ventrikel. Langvarige eller flere mislykkede forsøg på højre ventrikel kateterisering kan forårsage falske blodtryksaflæsninger.
IV-injektion hos mus administreres overvejende via laterale halevener. Selvom denne rute er let at nå med nåle, er denne teknik undertiden vanskelig at udføre flere IV bolusdoseringer. De to største udfordringer ved at udføre denne teknik er variationen i venedybden og vanskeligheden ved nålevisualisering på grund af mus, halehudfarve og hudhårdhed. Endnu vigtigere er der ingen måde at bekræfte, om hele indholdet af injektionen med succes er kommet ind i blodbanen og ikke det omgivende væv. Halsvenen er et foretrukket adgangssted, fordi (1) det er klinisk relevant, (2) det giver visuel bekræftelse af indgivelsen af injektionsstof til venen, (3) det giver mulighed for flere injektioner af en gruppe dyr i løbet af eksperimentet, og (4) denne injektionsteknik er sikker, og proceduren forårsager ingen bivirkninger.
Der er tre måder at registrere blodtrykket hos mus på: (1) Ikke-invasiv halemanchet plethysmografi10. Systemerne muliggør gentagne målinger i løbet af en longitudinel undersøgelse. (2) Radiotelemetri11. Systemerne gør det muligt at overvåge blodtrykket i realtid hos forsøgsdyr, der er vågne og bevæger sig frit. (3) Invasive intraarterielle katetre12. Systemerne muliggør akutte SBP- og RVSP-målinger. I denne protokol valgte vi et trykkateter til high-fidelity systemiske og højre ventrikel trykmålinger. Denne metode har dog nogle begrænsninger. For det første er trykkateteret og blodtryksmåleudstyret dyrt (figur 1E-F). For det andet kræver det bedøvelse af dyrene, dette medfører fald i blodtrykket. For det tredje er højre hjertekateterisering en terminal procedure, der ikke tillader serielle målinger. For det fjerde er proceduren ikke let at lære selv af en veluddannet mikrokirurg.
Når blodtrykket er registreret, kan efterforskeren isolere hjerterne og lungerne fra dyrene til histologisk PAH-karakterisering. For eksempel målinger af højre ventrikulær vægtykkelse til højre ventrikulær hypertrofi og muskulær pulmonal distal karanalyse til muskulær lungearterieombygning. Dataene viser, at 7C1/let-7 miRNA er yderst effektivt til at sænke det pulmonale blodtryk, hvilket viser effektiviteten af vores multipel IV bolusdosering. Derudover kan efterforskere isolere lungeendotelceller fra den nyligt isolerede hele lunge for at evaluere effektiviteten af injicerede materialer.
Sammenfattende giver denne protokol en trinvis procedure til udførelse af flere IV bolusdosering og invasiv hæmodynamisk overvågning i en musehypoxi-induceret PAH-model. Efterforskere kan bruge jugular veneinjektion og arteriel / højre ventrikel kateteriseringsteknikker beskrevet her til en lang række gnavermodeller, der kræver IV injektion og hæmodynamisk overvågning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
K Zsebo, M Simons og P-Y Chen er videnskabelige grundlæggere og aktionærer i VasoRx, Inc. M Simons er medlem af det videnskabelige rådgivende udvalg for VasoRx, Inc. HJ Duckers er medarbejder og aktionær i VasoRx. De øvrige forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af et Joint Biology Consortium Microgrant ydet under NIH-tilskud P30AR070253 (PYC), Cardiovascular Medical Research Education Fund (PYC), VasoRx, Inc. Fund (MS) og NIH-tilskud HL135582 (MS), HL152197 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 prolene suture pack | Ethicon | 8698G | for incision closure |
| 8-0 nylon suture pack | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | for ligation |
| Anesthesia induction chamber | VETEQUIP | #941444 | Holds the animal during anesthesia exposure |
| Catheter Interface Cable PEC-4D | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000 | |
| Charcoal canister filters | VETEQUIP | #931401 | to help remove waste anesthetic gases |
| Cotton swabs | McKesson | 24-106 | for applying pressure to the injection site to prevent bleeding |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Surgical tools |
| Insulin syringe 28 G | EXEL | 26027 | for jugular vein IV injection |
| Isoflurane | COVETRUS | #029405 | for mouse anesthesia |
| LabChart 8 Software | ADInstruments | for data analysis | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) | Millar | for invasive blood pressure measurement | |
| Needle-25 G | BD | 305124 | for making a samll hole in a vessel |
| Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor | BioSpherix | E702 | for oxygen concentration monitoring |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation. |
|
| Prism 8 | GraphPad | for statistics and scientific graphing | |
| Semisealable hypoxia chamber | BioSpherix | an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | Surgical tools |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | Surgical tools |
| VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | Lot# B2-L-16Apr | IV injection compound |
| VIP 3000 Veterinary Vaporizer | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | for accurate anesthesia delivery |
References
- McLaughlin, V. V., McGoon, M. D.
- Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
- Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
- Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512 (2021).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739 (2012).
- Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088 (2020).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
- Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
- Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291 (2009).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090 (2019).
