Summary
このプロトコルは、マウスの複数の静脈内ボーラス投与投与と侵襲的な血行動態モニタリングを実行するための段階的な手順を提供します。治験責任医師は、肺動脈高血圧症の将来の治療用化合物スクリーニングにこのプロトコルを使用できます。
Abstract
肺動脈性肺高血圧症(PAH)は、進行性の生命を脅かす疾患であり、主に肺の小さな肺細動脈に影響を及ぼします。現在、PAHの治療法はありません。PAHの治療に使用できる新しい化合物を発見することが重要です。マウス低酸素誘導PAHモデルは、PAH研究に広く使用されているモデルです。このモデルは、PAHグループ3疾患のヒトの臨床症状を再現し、PAHの新しい実験的治療法の有効性を評価するための重要な研究ツールです。このモデルを用いた研究では、多くの場合、マウスに化合物を投与する必要があります。血流に直接投与する必要がある化合物の場合、静脈内(IV)投与の最適化は実験手順の重要な部分です。理想的には、IV注射システムは、設定された時間経過にわたって複数の注射を可能にする必要があります。マウス低酸素誘発性PAHモデルは多くの検査室で非常に人気がありますが、このモデルで複数のIVボーラス投与と侵襲的血行動態評価を実行することは技術的に困難です。このプロトコルでは、マウス頸静脈 を介して 複数のIVボーラス投与を実行し、マウス低酸素症誘発PAHモデルでの血行動態評価のために動脈および右心室カテーテル法を実行する方法についてのステップバイステップの説明を示します。
Introduction
肺動脈高血圧症 (PAH) は、安静時の平均肺動脈収縮期血圧が 20 mmHg を超えることによって定義されます 1,2。これは、肺動脈圧の持続的な上昇を特徴とする進行性の致命的な疾患であり、右心室の過負荷を引き起こし、最終的には右心室不全による死に至ります1。現在、PAHの治療法はありません。
肺高血圧症の動物モデルの使用は、実験的なPAH療法の有効性をテストするために重要です。これらのモデルの中で、マウス低酸素誘発性PAHモデルは、ヒトのPAHグループ3の疾患発症に関する重要な洞察を提供しました3,4。このモデルを用いた研究では、多くの場合、新規化合物の有効性と安全性を評価するために、マウスに化合物を投与する必要があります。したがって、研究者は、注射の一貫性と血圧測定の再現性を最初から最後まで確保するために、化合物の投与と血行動態測定の詳細な実験手順を必要とします。
静脈内(IV)注射および血圧測定の方法は、文献5,6で報告されている。ただし、方法論には視覚的な説明と詳細な説明が欠けています。ここでは、IVボーラス注射を成功させ、全身血圧と右心室血圧を正確に測定・記録するための重要なステップを説明します。ここで紹介する手順は、PAHの治療法を開発するための化合物投与プラットフォームのIV経路に関心のある研究者にとって重要なリソースです。
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Protocol
すべての動物処置は、イェール大学の動物管理委員会によって承認されたプロトコルの下で行われました。
1.動物、道具、血圧測定器、低酸素室の準備
- 動物の順応。
注:この研究に使用された実験動物は、体重25〜27gの雄の8週齢のC57BL / 6マウスでした。実験に必要な動物の数を見積もる際には、手術に伴う死亡率、予期せぬ外科的合併症、予期せぬ突然死など、いくつかの要因を考慮する必要があります。グループごとに少なくとも10匹のマウスを使用して統計的検出力に到達し、検出力不足の研究を回避します。- 受付時に、適切な寝具、げっ歯類の餌、水を備えた換気されたげっ歯類のケージ(ケージごとに5匹のグループ)に動物を収容します。動物を新しい環境(18〜20°Cで12時間の明暗サイクル)に少なくとも3日間順応させます。
- それらを次のグループにランダムに割り当てます:正常性(グループ1)、低酸素症(グループ2)、および低酸素症+ 7C1/let-7 miRNA(グループ3)。
- 手術器具と血圧測定機器の準備。
- オートクレーブ滅菌により、すべての手術器具を滅菌します(図1A)。
- 自家製の麻酔ノーズコーン(図1B)、縫合パック(図1C)、およびPAH手順用の機器(図1D-F)を備えた間に合わせの注射プラットフォームを準備します。
- 肺動脈高血圧症(PAH)誘発の実験設定。
- N2 タンク、酸素センサー、および半密閉可能な低酸素チャンバーをセットします(図2A)。
- 酸素センサーに10%O2 の設定値を設定し、システムを定常状態にします(図2B、C)。
- 低酸素(グループ2)および低酸素+7C1/let-7 miRNA(グループ3)動物を低酸素(10%O2)で3週間保持します。3週間の低酸素状態の後、動物を1週間正常酸素条件下に置いた(図2D)。正常酸素グループ(グループ1)は4週間正常酸素状態にとどまります。
注:(1)3週間の低酸素状態とそれに続く1週間の正常酸素症は、PAHおよび右心室心不全を発症するための確立された方法です7。酸素センサは、半密閉可能な低酸素チャンバー内のO2 濃度を検出し、ガス注入チューブを介してN2 ガスを注入することによってそれを補正します。 - 実験の全期間(3週間)の間、動物を毎日検査します。動物が劇的な体重減少や呼吸困難などの苦痛の兆候を示している場合は、獣医師に相談してください。重度の苦痛にある動物に安楽死が必要な場合は、その動物を研究から除外します。.
注:低酸素曝露はマウスの体重減少を引き起こします。10%の体重減少は、通常、PAH発症の信頼できる指標として使用されます。 - 低酸素室の大規模な開放は避けてください。ケージの洗浄、餌の補充、水筒の交換、化合物の投与については、週に1時間以内でチャンバーを開けてください。
2.頸静脈を介した 静脈内ボーラス注射
- マウスの準備と麻酔。
- 低酸素チャンバーから低酸素(グループ2)および低酸素+7C1/let-7 miRNA(グループ3)マウスケージを取り出し、ケージからそっと取り出します。
注: 7C1/let-7 miRNA (1.5 mg/kg IV/用量) の投与計画は、週に 2 回、4 週間の治療です。研究者は、IV注射中に低酸素と低酸素+複合治療ケージの両方を低酸素チャンバーから取り出して、すべての動物が時間間隔ごとに同じ大きさの低酸素曝露を受けることを確認することをお勧めします。 - 精密はかりを使用してマウスの重量を量り、その重量を記録します(図3A)。
- 麻酔薬気化器に接続された麻酔導入室にマウスを入れ、閉じます(図3B)。熱サポートを提供し、麻酔中の乾燥を防ぐために両目に目の潤滑剤を塗布します。意識を失うまでマウスを3%イソフルランに曝露します(図3C-D)。
- マウスをチャンバーから取り出し、顎から頭側から胸骨の真ん中まで尾側で毛を剃ります。横方向に、顎の角度から首の側面を通り、肩に向かって毛を剃ります(図3E)。
- イソフルラン麻酔マウスを仰臥位(腹側を上向き)にして、解剖顕微鏡の下の注射台に置きます。1.5%イソフルランを含むノーズコーン で 麻酔を維持し、粘着テープで4本の脚を静かに拘束して体を固定します(図3F)。
- 適切なレベルの麻酔を確保するために、まっすぐな鉗子で有害な刺激(つまり、つま先をつまむ)を適用します。麻酔をかけたマウスは、外科的処置の前および全体を通して刺激に反応してはなりません。
- 低酸素チャンバーから低酸素(グループ2)および低酸素+7C1/let-7 miRNA(グループ3)マウスケージを取り出し、ケージからそっと取り出します。
- 注射剤の調製。
- 無菌条件下で1.5 mg / kgの用量で単回投与の注射剤を調製します。.
注:冷たい物質を注入すると、不快感やマウスの体温の低下を引き起こす可能性があるため、注射用コンパウンドを室温(RT)に温めてください(これがコンパウンドに損傷を与えない場合)。この研究で使用した化合物7C1/let-7 miRNAの最適な用量と持続時間は、以前の出版物に基づいています8,9。 - 滅菌シングルユースシリンジに注入する容量をロードします。.シリンジを直立させ、プランジャーを進めてシリンジから空気を排出します。シリンジを再利用しないでください。
- 25 gマウスでは、動物への血希釈や異常な心臓への影響の発生率を減らすために、注入量を200 μLに制限します。.より大きな容量が必要な場合は、注入コンパウンドを 10 分の間隔で 2 回の注入に分割します。
- 無菌条件下で1.5 mg / kgの用量で単回投与の注射剤を調製します。.
- マウスをIV注射する準備をします。
- ポビドンヨード溶液と70%エタノールを交互に3回交互に浴びて、手術部位を3回優しくこすります。外科的処置の30分前にブプレノルフィン(0.05 mg / kg、SQ)を投与します。.
- メスの刃を使用して、首の正中線のわずかに右側に0.5cmの縦方向に切り込みを入れます(図3G)。
- 鉗子を使用して筋肉と脂肪組織を分離し、右外頸静脈の位置を特定します(図3H)。
注意: 瘢痕の形成を避けるために、注射部位を毎回回転させてください。 - 高倍率対物レンズを使用して、射出領域を簡単に視覚化できるようにします(図3I)。
- 静脈注射
- 28Gの滅菌針を頸静脈に挿入し、針の斜角を上に向けて挿入します(図3J、K)。
注:尾静脈注射は、頸静脈注射の代替手段です。しかし、この手法は、静脈の深さ、マウスの尾の皮膚の色、および皮膚の硬さにばらつきがあるため、反復投与を行うことは困難です。 - シリンジプランジャーをゆっくりと押して、コンパウンドを静脈に注入します。.注射剤の逆流を防ぐために、ニードルをさらに10秒間静脈内に留まらせます(図3L)。
注:青みがかった染料により、注入を簡単に視覚化できます。試験材料を注入する際には、染料を含めないでください。不正確な注射は、IV注射部位の周囲に青みがかった染料が蓄積する結果となります。 - 針を抜き、綿棒を使用して注射部位に圧力をかけ、出血を防ぎます(図3M)。
- 5-0縫合糸で皮膚を縫合します(図3N)。手術後、動物を暖かく清潔で乾燥した場所に移し、メロキシカム(1 mg / kg、SQ、q24h)を提供します。.動物を清潔な回収ケージに入れ、寝具は使用せず、底をペーパータオルで覆います。
注:マウスは麻酔から目覚め、回復ケージに戻ったら5分以内に意識を取り戻す必要があります。マウスに苦痛の兆候がないか監視します。 - 動物をホームケージに戻し、マウスケージを低酸素室に戻します。
注:マウスの麻酔から頸静脈注射の終了まで、手順全体は、1人の実験者によって約10〜15分かかります。マウスの正常酸素曝露を短縮するには、少なくとも 2 人の研究者が協力して頸静脈注射手順を実行することをお勧めします。
- 28Gの滅菌針を頸静脈に挿入し、針の斜角を上に向けて挿入します(図3J、K)。
3.血圧測定
- 血圧測定用の機器を準備します。
- 血行動態測定の少なくとも30分前に、1.0Fカテーテルの先端を37°Cで予熱したPBSに浸します(図4A)。
- カテーテル挿入部位から目的のカテーテル先端位置までの距離を測定します。例えば、マウスの上行大動脈から首の中央までの距離は約1〜1.2cmである。心臓の右心室から首の中央までの距離は約2.3〜2.8cmです。
- 2つのカテーテル距離マーキングをマークして、挿入深さを視覚的に示します(図4B)。
- カテーテルを圧力トランスデューサに取り付け、圧力トランスデューサをデータ収集デバイスの入力チャネル1に接続し、圧力容積制御ユニットをオンにして、データ収集血圧分析ソフトウェアを開始します。新しい血圧分析ドキュメントを作成し、チャネル 1 を圧力に設定します。
- メーカーのプロトコルに従って圧力校正を実行します。セットアップ全体を少なくとも5分間安定させます(図4C)。
- 血圧分析ソフトウェアで、チャンネル1のドロップダウンメニューから単位変換を選択します(図4D、赤い矢印)。
- デフォルトの単位変換値を設定します(図 4E)。
注:血圧は水銀柱ミリメートル(mmHg)で表されます。圧力制御ユニットからの標準圧力出力は、100mmHgあたり1Vです。25mmHgは0.25V出力、100mmHgは1V出力に相当します。
- 血圧測定手順のためにマウスを準備します。
- ノーズコーンから3%イソフルラン吸入でマウスを麻酔します。.
- 麻酔下ではマウスが目を閉じることができないため、乾燥を防ぐためにマウスの目の眼表面に動物用軟膏を直接塗布します。麻酔下でマウスの首の毛を剃ります。
- 剃った部分をポビドンヨード溶液と70%エタノール綿棒を交互に3回こすります。麻酔をかけたマウスを、解剖顕微鏡の下の注射台に仰臥位で置きます。マウスの鼻をノーズコーンに入れて、外科的処置全体を通して麻酔(1.5%イソフルラン)を維持します。
- 麻酔をかけたマウスの有害な刺激に対する運動反応をテストします。麻酔をかけたマウスは、手術前および手術中に有害な刺激に反応してはなりません。
注:吸入麻酔薬(イソフルラン)および注射麻酔薬(ケタミン/キシラジン)は血圧を下げることができます。一般に、イソフルラン吸入麻酔は、ケタミン/キシラジンよりも血圧を下げる効果がわずかです。したがって、イソフルランはケタミン/キシラジンよりも好ましい吸入麻酔薬です。適切な麻酔深度を達成することは、正確で再現性のある血行動態測定にとって重要です。治験責任医師は、各マウスの麻酔深度を一定に保つ必要があります。
- 上行大動脈カテーテル検査
- 適切なレベルの麻酔を確保するために、まっすぐな鉗子で有害な刺激(つまり、つま先をつまむ)を適用します。下顎骨から胸骨までの皮膚を正中線で切開します(図5A)。
- 唾液腺を分離し、気管を露出させます(図5B)。
- 鉗子を使用して血管に沿った軟部組織を除去し、右頸動脈と右外頸静脈を露出させます(図5C)。
- 0.5 mLのPBSを空洞に入れて、頸動脈を操作しながら血管痙攣の発症を遅らせます。
- 右頸動脈の5mmの切片を慎重に分離します。動脈が見やすくなるように、背景として血管の下に滅菌した白い紙を置きます(図5D)。
注意: 迷走神経(白)を動脈から慎重に分離し、神経や動脈を切断したり損傷したりしないようにします。 - 8-0 を使う縫合糸は、血管の頭蓋端を閉じるために永久結び(#1)を結びます(図5E)。
- 最初の緩い結び目(#2)を結び、大動脈からの血流を一時的に遮断します。次に、最初の2つの縫合糸の間に2番目の緩い結び目(#3)を結びます(図5F)。2 番目の緩い結び目(#3) 留置後、カテーテルをすばやく固定するために使用されます。
- 25Gの針を使用して、#3と#1の結紮糸の間の血管に沿って、カテーテルを通すのに十分な大きさの小さな穴を開けます(図5G)。
注:頸動脈は心臓から酸素化された血液を運び、非常に高い圧力を持っています。頸動脈が切断されると、その圧力によって血液が噴出します(図5H)。 - カテーテルの先端から1.5インチの位置を持ち、カテーテルの先端を動脈の穴(Xマーク)にそっと挿入します。カテーテルと血管の周りの中央縫合糸ノード(#3)を締めて、カテーテルの通過を許可します(図5I-J)。
注: この手順には練習が必要です。このステップの潜在的な合併症には、カテーテル挿入部位での出血と血管痙攣が含まれます。出血が発生すると、出血動脈からの失血により血液量が減少し、全身血圧が著しく低下します。重症度が高いため、動物は人道的なエンドポイントに達しており、安楽死させる必要があります。機械的に誘発された血管痙攣の場合、それは通常、血管の持続的な収縮によって引き起こされるカテーテル挿入中に発生します。これにより、血管の開口部が小さくなり、カテーテルが頸動脈に進むのを防ぎます。カテーテルを前進させるために抵抗に対して過度の力を加えないでください。中等度または重度の血管痙攣抵抗性が発生した場合は、しばらくしてから再試行するか、より小さなカテーテル(例:1.0 F)を使用してください。経験豊富なマイクロサージャリーは、上行大動脈カテーテル検査の成功率を100%にすることができます。 - カテーテルがセンサーの先端で最初の緩い結び目(#2)を通過した後、2番目の緩い結び目(#3)をよりしっかりと締めてカテーテルを固定し、最初の緩い結び目(#2)を静かに解放します(図5K、L)。
- 圧力分析で動脈血圧プロファイルが示されるまで、カテーテルのマーク(図4B)に従ってカテーテルを上行大動脈に向かって挿入し続けます(図5M)。データ収集システムとソフトウェアを使用して全身血圧(SBP)データを記録します。
- 中央の縫合糸節(#3)を緩めて、カテーテルを引き抜くことができるようにします(図5N)。
- カテーテルを頸動脈から引き抜く前に、中央の縫合糸節(#3)を血管の周りに結びます(図5O-P)。
- カテーテルをPBSに入れます。
- 右心カテーテル検査。
- 右外頸静脈を周囲の結合組織から慎重に分離し、すべての小さな枝を8-0で結紮します縫合糸(青い矢印)(図6A)。
注:右心カテーテル検査の場合、心臓は通常、右頸静脈 から アクセスします。 - 8-0 を使う縫合糸、永久結び目(#1)を結び、血管の頭蓋端を閉じます(図6B)。次に、容器の尾端に緩い結び目(#2)を結びます(図6C)。
- 25Gの針を使用して、永久結び目(#1)の近位に小さな穴を開けます(図6D)。
注:頸静脈は脱酸素化された血液を心臓に運び、低血圧になります。頸静脈を切開すると、血液は噴き出しません(図6D、E)。 - カテーテルを保持し、カテーテルを静脈の切り込み(Xマーク)に挿入し(図6E)、カテーテルと血管の周りの尾結び目(#2)を締めます(図6F)。
- カテーテルをゆっくりと優しく右心臓に押し込みます。カテーテルマークに基づいてカテーテル先端の深さを監視します(図4B)。
注:閉鎖胸部マウスの右心室収縮期血圧(RVSP)の評価は、RVの解剖学的構造と構造が複雑なため、課題です。このステップには、高度な専門知識と多くの練習が必要です。経験豊富なマイクロサージェリーの手にかかれば、右心室カテーテル術の成功率は90%に近づくことができます。 - ソフトウェアの圧力波トレースに従って、カテーテル先端の位置を評価します。カテーテルの先端が右心室にある場合、モニターには典型的なRVSPトレースが表示されます(図6G、H)。
注:肺圧曲線の形状が非定型に見える場合(例:尖った曲線)、これはカテーテルの位置が正しくないことを意味します。カテーテルを少し静かに引き戻し、カテーテルを右心室内のより中央の位置までゆっくりと進めて、カテーテルの位置を調整します。研究データでのアーティファクトの生成を回避するために、研究者は右心室カテーテル挿入術の長時間(1分以内)または繰り返し(2回以内)の試行を避ける必要があります。 - カテーテルを動かさず、5分間データを収集します。
- 記録が完了したら、カテーテルを慎重に引き出し、尾結び目(#2)を血管の周りに結びます(図6I)。カテーテルをPBS溶液に戻します。
注:実験終了後、製造元の指示に従って1%消化酵素溶液でカテーテルを洗浄します。血行動態の状態を評価することに加えて、研究者はPAH組織病理学的検査のために心臓と肺を採取する場合があります。複数回のIVボーラス投与の有効性を確保するために、研究者は肺内皮細胞を分離し、let-7 miRNAレベルを測定できます。
- 右外頸静脈を周囲の結合組織から慎重に分離し、すべての小さな枝を8-0で結紮します縫合糸(青い矢印)(図6A)。
4.血圧データ分析
- 血圧記録を調べます。
- 血圧分析ソフトウェアのデータファイル(PAH JOVE.adicht)を開きます。
- チャンネル1で、圧力信号を表す領域を選択し、波形カーソルをピーク(Xマーク)に置いて圧力振幅を測定します(図7A)。
- 圧力波の最大振幅を決定します。これは収縮期血圧を表します(図7A、赤い矢印)。
- Shift + Command + 3(Macの場合)またはWindows + Shift + S(Windows PCの場合)を押して、画像から関心領域(図7B の灰色の領域)を抽出し、グラフィックファイルに貼り付けます。
- 血圧データの統計分析。
- 統計解析ソフトウェアに個々のマウスの血圧データを入力します。
- 2つの研究グループ(正常酸素症と低酸素症、低酸素症と低酸素症+ 7C1 / let-7 miRNA)の統計分析のために、対応のないスチューデントの t検定を実行します。平均値の差が p < 0.05 と有意であると考えます。
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Representative Results
麻酔はしばしば血圧を下げます。したがって、最小限の麻酔を使用して、有害な刺激に反応して動きを廃止しました。右心室へのアクセスの成功は、静脈系のさまざまな領域で血行動態の波形が変化すると視覚化できます(図8)。
この研究では、マウスを正常酸素(21%O2)群(n=10)、低酸素(10%O2)群(n=10)、または低酸素+7C1/let-7治療群(n=10)にランダムに割り付けた。低酸素誘発性PAH発症抑制におけるlet-7 miRNAの効果を調べるために、処方された7C1/let-7 miRNAをC57BL/6マウスに1.5 mg/kgの用量で週2回、4週間静脈内投与しました(図2D)。
低酸素症または正常酸素症への曝露から4週間後、SBPおよびRVSPを胸部閉鎖マウスで測定した。 図9A は、正常酸素、低酸素、または低酸素+ 7C1/let-7 miRNA治療群の代表的な血圧曲線を示しています。正常酸素対照群と比較して、RVSPは低酸素群で有意に増加しました。.さらに、低酸素群と比較して、マウスに7C1/let-7 miRNA化合物を投与したところ、RVSPが有意に減少しました(図9B)。SBPはどのグループでも変化はなく、これは以前のレポートと一致しています7。7C1/let-7 miRNAは内皮細胞を標的とし、TGFβシグナル伝達カスケードを減少させる8。データは、7C1/let-7 miRNA 1.5 mg/kgが右心室の血圧を下げるのに非常に効果的であることを示しており、複数回のIVボーラス投与の有効性を実証しています。
図1:肺動脈性肺高血圧症の処置に必要な手術器具と血圧測定機器。 (A)PAH手術に使用される手術器具。(B)50 mLの円錐形パッケージから発泡スチロールのラックに吸収パッドを巻き付けて作られた間に合わせの注射プラットフォーム。長さ10cmの麻酔チューブをノーズコーンタイプとして注射台に取り付けます。(C)縫合糸パック。5-0 切開閉鎖用縫合糸と 8-0結紮用縫合糸。(D-F)PAH処置に使用される血圧測定装置。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:PAH誘導の実験設定。 (A)BioSpherix低酸素システムを設置した写真。誘導システムのさまざまな部分が示されています。(B-C)低酸素室O2濃度を監視する酸素センサ。(D)PAH誘導中のすべての動物群の7C1 / let-7 miRNA化合物処理と酸素レベル曝露の実験タイムライン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:頸静脈注射の主な手術手順の写真。 (A)体重計のマウス。(B)げっ歯類の麻酔導入システムのセットアップ。誘導システムのさまざまな部分が示されています。(C-D)誘導チャンバー内のイソフルラン麻酔マウスの写真。(E)毛皮除去手術部位。(F)マウスを注射台に置き、気化器からノーズコーンを通して1.5%イソフルランを呼吸した。(G)頸静脈アプローチのための皮膚切開。(h)右外頸静脈の外科的解剖。(i)孤立した右頸静脈を示す高倍率画像。血管の下に白い紙を貼って、静脈をもっと目立たせてください。(J-Kさん)ベベルを上にした右頸静脈針の挿入。(L)青みがかった色素を含む化合物を頸静脈に注入する。(M)針を抜いた後、綿棒で注射部位に圧力をかける。(N)5-0縫合糸で創傷を縫合する。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:カテーテルのキャリブレーション。 (A)1.0Fのカテーテル先端を37°Cに予熱したPBSに浸漬する。(B)上行大動脈および右心室へのカテーテルの挿入深さを推定するのに役立つカテーテル上の距離マーキング。(C)ゼロベースライン校正を受けている血圧測定機器。(Ca')血圧分析ソフトウェアベースのカテーテルベースライン分析のスクリーンショット。(D) チャンネル1 ドロップダウンメニューで、血圧分析ソフトウェアの 単位変換 ダイアログを選択します。(E)入力電圧信号をmmHg単位に変換するためのデフォルトの 単位変換 値を設定します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:全身血圧(SBP)測定のための外科的処置。 (A)頸部皮膚の下顎骨から胸骨までの正中線切開。(B)唾液腺を分離して気管を露出させます。(C)組織解剖後の右頸動脈と右外頸静脈の露出。(D)頸動脈の孤立した5mmの切片。(E、F)頭蓋端に縫合パーマネントノット、尾端に2つの緩い結び目があります。(G,H)頸動脈に小さな穴(Xマーク)を永久結び目(#1)の尾側に開けます。(I)カテーテルを頸動脈に挿入する。(J)真ん中の縫合糸の結び目(#3)でカテーテルを固定する。(K、L)最初の緩んだ結び目(#2)をそっと解きます。(M)代表的な動脈圧波。(n)中央縫合糸節(#3)を緩める。(O、P)血管の周りの中央縫合糸節(#3)を締めます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:右心室収縮期血圧(RVSP)測定のための外科的処置。 (A)右頸静脈の小枝(青い矢印)の結紮。(B)頸静脈の頭蓋端にある永久結び目(#1)。(C)頸静脈の尾端の緩い結び目(#2)。(D)右頸静脈尾側に永久結び目(#1)に小さな穴を開ける。(E)小さな穴(Xマーク)から頸静脈にカテーテルを挿入します。(F)カテーテルと血管の周りの尾結び目(#2)を締めます。(G)カテーテルを心臓の右心室に押し込む。(H) 代表RVSP。(I)血管の周りの尾側結節(#2)を締める。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:記録後の血圧分析ソフトウェアのデータ分析。 (A)波形カーソルを使用して、チャンネル1の生の血圧分析ソフトウェアデータから圧力振幅を測定します。(b)血圧分析ソフトの生データ画像から関心領域を抽出する工程。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:右心室カテーテル挿入中の血行動態波形遷移。 (A-D) C57BL/6マウスのマウス右心室カテーテル挿入術中の圧力変化の代表的な痕跡。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図9:血圧分析の表現数値とデータ分析。 (A)正常酸素、低酸素、および低酸素症 + 7C1/let-7 miRNA処理マウスにおける代表的なSBPおよびRVSP曲線。(B)正常酸素、低酸素、および低酸素症 + 7C1/let-7 miRNA 処理マウスにおける SBP と RVSP の要約プロット (NS: 有意ではない; **p < 0.01; ***p < 0.001; 対応のない両側スチューデントの t 検定)。グループあたり N = 10。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの肺高血圧症動物モデルが、ヒト被験者における肺血管抵抗イベントの上昇を模倣するために確立されています。その中で、マウス低酸素誘発PAHモデルは、PAHの新しい実験的治療法の有効性を評価するために広く利用されています。このモデルを用いた研究では、マウスに化合物を投与する必要があることがよくあります。他の公開されている静脈内(IV)注射および侵襲的血行動態評価プロトコルと比較して、この方法は視覚的な説明と詳細な説明の両方を提供します。
手順を正常に実行し、正確で再現性のある血圧測定値を取得するには、3つの重要なステップがあります。まず、シリンジの針が頸静脈に正しく配置されていることを確認します。頸静脈注射を誤ると、皮下注射が行われることがあります。第二に、麻酔の深さを十分に確保します。各マウスの麻酔深度を一定にすることは、グループ間で比較可能なデータを生成するために重要です。麻酔が深すぎると、血圧レベルが大幅に低下する可能性があります。イソフルラン吸入麻酔に加えて、ケタミン/キシラジンの腹腔内注射もマウス手術に広く使用されている麻酔方法です。どちらの方法にも長所と短所があります。イソフルラン吸入麻酔は、注射可能なケタミン/キシラジンに比べて、発症が早い、規制薬物が不要、回復が早いなど、いくつかの利点があり、麻酔の深さを制御するのがはるかに簡単です。不利な点は、機器のコスト、不快な臭い、および廃麻酔ガスへの人間の曝露です。第三に、カテーテルが心臓の右心室の内側にあることを確認します。右心室カテーテル検査の試行が長引くか複数回失敗すると、誤った血圧測定値が発生する可能性があります。
マウスの静脈注射は、主に側尾静脈 を介して 投与されます。このルートは針で簡単に到達できますが、この手法は複数のIVボーラス投与を実行するのが難しい場合があります。この技術を実行する際の2つの大きな課題は、静脈の深さのばらつきと、マウスの尾の皮膚の色と皮膚の硬さによる針の視覚化の難しさです。さらに重要なことに、注射の内容物全体が血流に入り、周囲の組織には入らなかったかどうかを確認する方法がありません。頸静脈は、(1)臨床的に関連性があり、(2)静脈への注射液の送達を視覚的に確認でき、(3)実験の過程で動物のグループを複数回注射することができ、(4)この注射技術は安全であり、手順は副作用を引き起こさないため、好ましいアクセス部位です。
マウスの血圧を記録するには、(1)非侵襲的テールカフプレチスモグラフィー10の3つの方法があります。このシステムにより、縦断的研究の過程で繰り返し測定することができます。(2) 無線テレメトリー11.このシステムにより、覚醒している実験動物や自由に動いている実験動物の血圧をリアルタイムでモニタリングすることができます。(3) 侵襲的動脈内カテーテル12.このシステムは、急性SBPおよびRVSP測定を可能にします。このプロトコルでは、忠実度の高い全身圧と右心室圧測定用の圧力カテーテルを選択しました。ただし、この方法にはいくつかの制限があります。まず、圧力カテーテルと血圧測定装置は高価です(図1E-F)。第二に、それは動物に麻酔をかける必要があり、これは血圧の低下を引き起こします。第三に、右心カテーテル検査は、連続測定ができない終末期の処置です。第四に、この手技は、よく訓練されたマイクロサージェリーでも簡単に習得できるものではありません。
血圧が記録されると、研究者は組織学的PAH特性評価のために動物から心臓と肺を分離できます。例えば、右心室肥大のための右心室壁厚測定や、筋肉肺動脈リモデリングのための筋肉化肺遠位血管分析などです。このデータは、7C1/let-7 miRNAが肺血圧を下げるのに非常に効果的であることを示しており、複数回のIVボーラス投与の有効性を実証しています。さらに、研究者は、新たに分離された肺全体から肺内皮細胞を分離して、注入された材料の有効性を評価できます。
要約すると、このプロトコルは、マウス低酸素症誘発PAHモデルで複数のIVボーラス投与と侵襲的な血行動態モニタリングを実行するためのステップバイステップの手順を提供します。研究者は、IV注射と血行動態モニタリングを必要とするさまざまなげっ歯類モデルに対して、ここで説明する頸静脈注射および動脈/右心室カテーテル法技術を使用できます。
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Disclosures
K Zsebo、M Simons、P-Y Chenは、VasoRx, Inc.の科学的創設者兼株主であり、M SimonsはVasoRx, Inc.の科学諮問委員会のメンバーであり、HJ DuckersはVasoRxの従業員および株主です。他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究の一部は、NIH助成金P30AR070253(PYC)、心臓血管医学研究教育基金(PYC)、VasoRx, Inc. Fund(MS)、およびNIH助成金HL135582(MS)、HL152197(MS)の下で提供されたJoint Biology Consortium Micrograntによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 prolene suture pack | Ethicon | 8698G | for incision closure |
| 8-0 nylon suture pack | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | for ligation |
| Anesthesia induction chamber | VETEQUIP | #941444 | Holds the animal during anesthesia exposure |
| Catheter Interface Cable PEC-4D | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000 | |
| Charcoal canister filters | VETEQUIP | #931401 | to help remove waste anesthetic gases |
| Cotton swabs | McKesson | 24-106 | for applying pressure to the injection site to prevent bleeding |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Surgical tools |
| Insulin syringe 28 G | EXEL | 26027 | for jugular vein IV injection |
| Isoflurane | COVETRUS | #029405 | for mouse anesthesia |
| LabChart 8 Software | ADInstruments | for data analysis | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) | Millar | for invasive blood pressure measurement | |
| Needle-25 G | BD | 305124 | for making a samll hole in a vessel |
| Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor | BioSpherix | E702 | for oxygen concentration monitoring |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation. |
|
| Prism 8 | GraphPad | for statistics and scientific graphing | |
| Semisealable hypoxia chamber | BioSpherix | an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | Surgical tools |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | Surgical tools |
| VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | Lot# B2-L-16Apr | IV injection compound |
| VIP 3000 Veterinary Vaporizer | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | for accurate anesthesia delivery |
References
- McLaughlin, V. V., McGoon, M. D.
- Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
- Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
- Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512 (2021).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739 (2012).
- Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088 (2020).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
- Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
- Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291 (2009).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090 (2019).
