Summary
Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour l’exécution de l’administration de plusieurs doses de bolus intraveineux et la surveillance hémodynamique invasive chez la souris. Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour le dépistage futur de composés thérapeutiques pour l’hypertension artérielle pulmonaire.
Abstract
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie progressive potentiellement mortelle, affectant principalement les petites artérioles pulmonaires du poumon. Actuellement, il n’existe aucun remède contre l’HTAP. Il est important de découvrir de nouveaux composés qui peuvent être utilisés pour traiter l’HTAP. Le modèle d’HTAP induite par l’hypoxie chez la souris est un modèle largement utilisé pour la recherche sur l’HTAP. Ce modèle récapitule les manifestations cliniques humaines de l’HTAP du groupe 3 et constitue un outil de recherche important pour évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies expérimentales contre l’HTAP. La recherche utilisant ce modèle nécessite souvent l’administration de composés chez la souris. Pour un composé qui doit être administré directement dans la circulation sanguine, l’optimisation de l’administration intraveineuse (IV) est un élément clé des procédures expérimentales. Idéalement, le système d’injection IV devrait permettre plusieurs injections sur une période déterminée. Bien que le modèle d’HTAP induite par l’hypoxie chez la souris soit très populaire dans de nombreux laboratoires, il est techniquement difficile d’effectuer plusieurs bolus IV et une évaluation hémodynamique invasive dans ce modèle. Dans ce protocole, nous présentons des instructions étape par étape sur la façon d’effectuer plusieurs bolus IV via la veine jugulaire de souris et d’effectuer un cathétérisme artériel et ventricule droit pour l’évaluation hémodynamique dans un modèle d’HTAP induite par l’hypoxie chez la souris.
Introduction
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est définie par une pression systolique moyenne de l’artère pulmonaire supérieure à 20 mmHg au repos 1,2. Il s’agit d’une maladie progressive et mortelle caractérisée par une élévation soutenue de la pression artérielle pulmonaire, entraînant une surcharge du ventricule droit et finalement la mort par insuffisance ventriculaire droite1. Actuellement, il n’existe aucun remède contre l’HTAP.
L’utilisation de modèles animaux d’hypertension pulmonaire est importante pour tester l’efficacité des thérapies expérimentales contre l’HTAP. Parmi ces modèles, le modèle d’HTAP induite par l’hypoxie chez la souris a fourni des informations clés surle développement de la maladie humaine HTAP du groupe 3,4. La recherche utilisant ce modèle nécessite souvent l’administration de composés chez la souris pour évaluer l’efficacité et l’innocuité du nouveau composé. Par conséquent, les chercheurs ont besoin d’une procédure expérimentale détaillée pour le dosage des composés et les mesures hémodynamiques afin de garantir la cohérence de l’injection et la reproductibilité de la mesure de la pression artérielle du début à la fin.
Des méthodes d’injection intraveineuse (IV) et de mesure de la pression artérielle ont été rapportées dans la littérature 5,6. Cependant, la méthodologie manque d’illustrations visuelles et de description détaillée. Nous illustrons ici les étapes clés pour une injection réussie d’un bolus IV et une mesure et un enregistrement précis de la pression artérielle systémique et du ventricule droit. Les procédures présentées ici constituent une ressource importante pour les chercheurs intéressés par la voie IV de la plateforme d’administration de composés pour développer un traitement contre l’HTAP.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été effectuées selon des protocoles approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Yale.
1. Préparation des animaux, des outils, de l’équipement de mesure de la pression artérielle et de la chambre d’hypoxie
- Acclimatation animale.
REMARQUE : Les animaux de laboratoire utilisés pour cette étude étaient des souris C57BL/6 mâles âgées de 8 semaines pesant de 25 à 27 g. Plusieurs facteurs doivent être pris en compte lors de l’estimation du nombre d’animaux requis pour l’expérience, notamment la mortalité associée à la chirurgie, les complications chirurgicales inattendues et la mort subite inattendue. Utilisez au moins 10 souris par groupe pour atteindre la puissance statistique et éviter les études sous-puissantes.- À la réception, loger les animaux dans des cages ventilées pour rongeurs (groupes de cinq animaux par cage) munies d’une litière appropriée, d’une nourriture pour rongeurs et d’eau. Laissez les animaux s’acclimater au nouvel environnement (cycle lumière-obscurité de 12 h à 18-20 °C) pendant au moins 3 jours.
- Affectez-les au hasard aux groupes suivants : Normoxie (groupe 1), hypoxie (groupe 2) et hypoxie + miARN 7C1/let-7 (groupe 3).
- Préparation d’outils chirurgicaux et d’équipements de mesure de la pression artérielle.
- Stérilisez tous les outils chirurgicaux par autoclave (Figure 1A).
- Préparez une plateforme d’injection de fortune avec un cône nasal d’anesthésie maison (figure 1B), des sutures (figure 1C) et du matériel pour la procédure d’HTAP (figure 1D-F).
- Cadre expérimental pour l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP).
- Réglez le réservoir N2 , le capteur d’oxygène et la chambre d’hypoxie semi-étanche (Figure 2A).
- Établissez un point de consigne de 10 % O2 dans le capteur d’oxygène et laissez le système atteindre l’état d’équilibre (Figure 2B, C).
- Maintenir les animaux hypoxie (groupe 2) et hypoxie + miARN 7C1/let-7 (groupe 3) en hypoxie (10 %O2) pendant 3 semaines. Après 3 semaines d’hypoxie, placer les animaux dans des conditions normoxiques pendant 1 semaine (Figure 2D). Le groupe normoxique (groupe 1) reste en normoxie pendant 4 semaines.
REMARQUE : (1) 3 semaines d’hypoxie suivies de 1 semaine de normoxie est une méthode bien établie pour développer l’HTAP et l’insuffisance cardiaque du ventricule droit7. Le capteur d’oxygène détecte la concentration d’O2 à l’intérieur de la chambre d’hypoxie semi-étanche et la corrige en injectant du gaz N2 à travers le tube de perfusion de gaz. - Inspectez les animaux quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience (3 semaines). Consultez un vétérinaire si les animaux présentent des signes de détresse tels qu’une perte de poids spectaculaire et des difficultés respiratoires. Si l’euthanasie est nécessaire pour les animaux en détresse grave, exclure l’animal de l’étude.
REMARQUE : L’exposition à l’hypoxie entraîne une perte de poids corporel chez la souris. Une perte de 10 % du poids corporel est généralement utilisée comme une indication fiable du développement des HAP. - Évitez l’ouverture prolongée de la chambre d’hypoxie. Pour le nettoyage des cages, le réapprovisionnement en nourriture, le changement des bouteilles d’eau et l’administration de composés, ouvrez les chambres pas plus d’une heure par semaine.
2. Injection intraveineuse en bolus par la veine jugulaire
- Préparation et anesthésie de la souris.
- Sortez les cages de souris hypoxie (groupe 2) et hypoxie + miARN 7C1/let-7 (groupe 3) de la chambre d’hypoxie et retirez délicatement l’animal de la cage.
REMARQUE : Le schéma posologique pour le miARN 7C1/let-7 (1,5 mg/kg IV/dose) est de deux fois par semaine pendant 4 semaines de traitement. Il est recommandé aux chercheurs de sortir les cages de traitement de l’hypoxie et de l’hypoxie + de la chambre d’hypoxie pendant l’injection intraveineuse pour s’assurer que tous les animaux reçoivent la même ampleur d’exposition à l’hypoxie par intervalle de temps. - Pesez la souris à l’aide d’une balance de précision et notez son poids (Figure 3A).
- Placez la souris dans une chambre d’induction d’anesthésie reliée au vaporisateur d’anesthésie et fermez-la (Figure 3B). Fournir un soutien thermique et appliquer un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour éviter le dessèchement pendant l’anesthésie. Exposer la souris à 3 % d’isoflurane jusqu’à ce qu’elle soit inconsciente (Figure 3C-D).
- Retirez la souris de la chambre et rasez la fourrure de la mâchoire crânienne jusqu’au milieu du sternum caudalement. Latéralement, rasez la fourrure à partir des angles de la mâchoire, à travers les côtés du cou et vers les épaules (figure 3E).
- Placez la souris anesthésiée à l’isoflurane en position couchée (côté ventre, face vers le haut) sur une plateforme d’injection sous un microscope de dissection. Maintenez l’anesthésie via un cône nasal contenant 1,5 % d’isoflurane et retenez doucement les quatre pattes avec du ruban adhésif pour immobiliser le corps (Figure 3F).
- Appliquez un stimulus nocif (c’est-à-dire un pincement des orteils) avec une pince droite pour assurer un niveau d’anesthésie adéquat. La souris anesthésiée ne doit pas répondre à la stimulation avant et pendant l’intervention chirurgicale.
- Sortez les cages de souris hypoxie (groupe 2) et hypoxie + miARN 7C1/let-7 (groupe 3) de la chambre d’hypoxie et retirez délicatement l’animal de la cage.
- Préparation de l’agent d’injection.
- Préparer un composé injectable à dose unique à une dose de 1,5 mg/kg dans des conditions stériles.
REMARQUE : Réchauffez le composé injectable à température ambiante (RT) car l’injection de substances froides peut causer de l’inconfort et une baisse de la température corporelle de la souris (si cela n’endommage pas le composé). La dose et la durée optimales du miARN composé 7C1/let-7 utilisés dans cette étude sont basées sur des publications antérieures 8,9. - Chargez la seringue stérile à usage unique avec le volume à injecter. Tenez la seringue à la verticale et avancez le piston pour expulser l’air de la seringue. Ne réutilisez pas la seringue.
- Limiter le volume d’injection à 200 μL chez une souris de 25 g pour réduire l’incidence de l’hémodilution et des effets cardiaques anormaux sur les animaux. Si un volume plus important est nécessaire, divisez le composé injectable en deux injections à un intervalle de 10 minutes.
- Préparer un composé injectable à dose unique à une dose de 1,5 mg/kg dans des conditions stériles.
- Préparez la souris pour l’injection intraveineuse.
- Frottez doucement la zone chirurgicale trois fois avec trois cycles alternés de solution de povidone iodée et d’éthanol à 70 %. Administrer de la buprénorphine (0,05 mg/kg, SQ) 30 minutes avant l’intervention chirurgicale.
- Faites une coupe longitudinale de 0,5 cm légèrement à droite de la ligne médiane du cou à l’aide d’une lame de scalpel (figure 3G).
- Utilisez une pince pour séparer le muscle et les tissus adipeux afin de localiser la veine jugulaire externe droite (Figure 3H).
REMARQUE : Alternez les sites d’injection à chaque fois pour éviter la formation de cicatrices. - Utilisez une lentille d’objectif haute puissance pour permettre une visualisation facile de la zone d’injection (Figure 3I).
- Injection intraveineuse
- Insérez une aiguille stérile de 28 G dans la veine jugulaire avec le biseau de l’aiguille vers le haut (Figure 3J, K).
REMARQUE : L’injection de la veine caudale est une alternative à l’injection de la veine jugulaire. Cependant, cette technique est difficile à réaliser en répétant des doses en raison de la variabilité de la profondeur des veines, de la couleur de la peau de la queue de souris et de la dureté de la peau. - Appuyez lentement sur le piston de la seringue pour injecter le composé dans la veine. Laissez l’aiguille rester dans la veine pendant 10 secondes supplémentaires pour éviter le reflux de l’injecteur (figure 3L).
REMARQUE : Le colorant bleuâtre permet de visualiser facilement l’injection. N’incluez pas le colorant lors de l’injection des matériaux d’essai. Une injection imprécise entraînera l’accumulation d’un colorant bleuâtre autour du site d’injection intraveineuse. - Retirez l’aiguille et utilisez un coton-tige pour appliquer une pression sur le site d’injection afin d’éviter les saignements (figure 3M).
- Suturez la peau avec une suture 5-0 (Figure 3N). Après la chirurgie, déplacer l’animal dans un endroit chaud, propre et sec et lui administrer du méloxicam (1 mg/kg, SQ, q24h). Placez l’animal dans une cage de récupération propre sans litière mais le fond recouvert d’une serviette en papier.
REMARQUE : La souris doit être réveillée de l’anesthésie et reprendre conscience dans les 5 minutes une fois de retour dans la cage de récupération. Surveillez la souris pour détecter les signes de détresse. - Remettez les animaux dans leur cage d’origine et remettez la cage à souris dans la chambre d’hypoxie.
REMARQUE : L’ensemble de la procédure, de l’anesthésie d’une souris à la fin de l’injection de la veine jugulaire, prend environ 10 à 15 minutes par un seul expérimentateur. Pour raccourcir l’exposition à la normoxie chez la souris, il est recommandé qu’au moins deux chercheurs collaborent pour réaliser une procédure d’injection de la veine jugulaire.
- Insérez une aiguille stérile de 28 G dans la veine jugulaire avec le biseau de l’aiguille vers le haut (Figure 3J, K).
3. Mesure de la pression artérielle
- Préparez des instruments pour mesurer la pression artérielle.
- Faire tremper l’extrémité du cathéter 1,0 F dans du PBS préchauffé à 37 °C au moins 30 minutes avant la mesure hémodynamique (Figure 4A).
- Mesurez la distance entre le site d’insertion du cathéter et l’emplacement souhaité de l’extrémité du cathéter. Par exemple, la distance entre l’aorte ascendante de la souris et le milieu du cou est d’environ 1 à 1,2 cm. La distance entre le ventricule droit du cœur et le milieu du cou est d’environ 2,3 à 2,8 cm.
- Marquez deux marques de distance de cathéter pour fournir une indication visuelle de la profondeur d’insertion (Figure 4B).
- Fixez le cathéter au transducteur de pression, connectez le transducteur de pression au canal d’entrée 1 du dispositif d’acquisition de données, allumez l’unité de contrôle pression-volume et lancez le logiciel d’analyse de la pression artérielle d’acquisition de données. Créez un nouveau document d’analyse de la pression artérielle et définissez le canal 1 pour la pression.
- Effectuez un étalonnage de pression selon le protocole du fabricant. Laissez l’ensemble de l’installation se stabiliser pendant au moins 5 minutes (Figure 4C).
- Dans un logiciel d’analyse de la pression artérielle, sélectionnez Conversion d’unités dans le menu déroulant Canal 1 (Figure 4D, flèche rouge).
- Définissez les valeurs de conversion d’unités par défaut (Figure 4E).
REMARQUE : La pression artérielle est représentée en millimètres de mercure (mmHg). La pression de sortie normalisée de l’unité de contrôle de pression est de 1 V par 100 mmHg. 25 mmHg correspond à une sortie de 0,25 V et 100 mm Hg correspond à une sortie de 1 V.
- Préparez la souris pour la procédure de mesure de la pression artérielle.
- Anesthésier la souris avec une inhalation d’isoflurane à 3 % à travers un cône nasal.
- Appliquez la pommade vétérinaire directement sur la surface oculaire des yeux de la souris pour éviter la sécheresse, car la souris ne peut pas fermer les yeux sous anesthésie. Rasez la fourrure du cou de la souris sous anesthésie.
- Frottez la région rasée avec trois cycles alternés de solution de povidone iodée et d’écouvillon d’éthanol à 70 %. Placez la souris anesthésiée en position couchée sur une plate-forme d’injection sous un microscope de dissection. Placez le nez de la souris dans le cône nasal pour maintenir l’anesthésie (1,5 % d’isoflurane) tout au long de l’intervention chirurgicale.
- Testez la réponse motrice de la souris anesthésiée au stimulus nocif. La souris anesthésiée ne doit pas répondre à un stimulus nocif avant et pendant la chirurgie.
REMARQUE : Les anesthésiques inhalables (isoflurane) et injectables (kétamine/xylazine) peuvent diminuer la pression artérielle. En général, l’anesthésie par inhalation d’isoflurane a un léger effet sur l’abaissement de la pression artérielle que la kétamine/xylazine. Par conséquent, l’isoflurane est l’anesthésique inhalé préféré à la kétamine/xylazine. Il est essentiel d’obtenir la profondeur d’anesthésie appropriée pour obtenir des mesures hémodynamiques précises et reproductibles. L’investigateur doit maintenir la profondeur de l’anesthésie constante pour chaque souris.
- Cathétérisme de l’aorte ascendante
- Appliquez un stimulus nocif (c’est-à-dire un pincement des orteils) avec une pince droite pour assurer un niveau d’anesthésie adéquat. Faites une incision médiane de la peau de la mandibule au sternum (figure 5A).
- Séparez les glandes salivaires et exposez la trachée (Figure 5B).
- Utilisez une pince pour dégager les tissus mous le long des vaisseaux afin d’exposer l’artère carotide droite et la veine jugulaire externe droite (Figure 5C).
- Mettez 0,5 mL de PBS dans la cavité pour ralentir le développement du vasospasme tout en manipulant l’artère carotide.
- Isolez soigneusement une section de 5 mm de l’artère carotide droite. Placez un morceau de papier blanc stérile sous le vaisseau comme arrière-plan pour rendre l’artère plus visible (Figure 5D).
REMARQUE : Séparez soigneusement le nerf vague (blanc) de l’artère et assurez-vous de ne pas couper ou endommager le nerf ou l’artère. - L’utilisation d’un 8-0 suturez un nœud permanent (#1) pour fermer l’extrémité crânienne du vaisseau (figure 5E).
- Faites un premier nœud lâche (#2) pour obstruer temporairement le flux sanguin de l’aorte. Ensuite, faites un deuxième nœud lâche (#3) entre les deux premières sutures (Figure 5F). Le deuxième nœud lâche (#3) sera utilisé pour fixer rapidement le cathéter après la mise en place.
- À l’aide d’une aiguille de 25 G, faites un petit trou, assez grand pour faire passer le cathéter, dans l’alignement du vaisseau entre les ligatures #3 et #1 (Figure 5G).
REMARQUE : Les artères carotides transportent le sang oxygéné du cœur et ont une pression très élevée. Si l’artère carotide est coupée, cette pression fera jaillir le sang (Figure 5H). - Tenez le cathéter à 1,5 pouce de l’extrémité et insérez doucement l’extrémité du cathéter dans le trou de l’artère (marque X). Serrez le nœud de suture moyen (#3) autour du cathéter et du vaisseau qui permet toujours le passage du cathéter (Figure 5I-J).
REMARQUE : Cette étape nécessite de la pratique. Les complications potentielles de cette étape comprennent des saignements au site d’insertion du cathéter et un vasospasme. En cas de saignement, la perte de sang de l’artère saignante réduit le volume sanguin, entraînant une chute sévère de la pression artérielle systémique. En raison de la gravité, l’animal a atteint un point final sans cruauté et doit être euthanasié. Pour le vasospasme d’origine mécanique, il survient généralement lors de l’insertion d’un cathéter causé par une contraction persistante des vaisseaux sanguins. Cela réduit la taille de l’ouverture des vaisseaux sanguins et empêche l’avancée du cathéter vers l’artère carotide. N’utilisez pas de force excessive contre la résistance pour faire avancer le cathéter. En cas de résistance modérée ou sévère au vasospasme, réessayez dans un peu de temps ou utilisez un cathéter plus petit (par exemple, 1,0 F). Les microchirurgiens expérimentés peuvent atteindre des taux de réussite de 100 % pour le cathétérisme de l’aorte ascendante. - Une fois que le cathéter a franchi le premier nœud lâche (#2) avec l’embout du capteur, serrez le deuxième nœud lâche (#3) plus fermement pour fixer le cathéter et relâchez doucement le premier nœud lâche (#2) (Figure 5K, L).
- Continuez à insérer le cathéter vers l’aorte ascendante en suivant le repère sur le cathéter (figure 4B) jusqu’à ce que l’analyse de la pression montre un profil de pression artérielle (figure 5M). Enregistrer les données de pression artérielle systémique (TAS) à l’aide du système et du logiciel d’acquisition de données.
- Desserrez le nœud de suture moyen (#3) pour permettre au cathéter d’être retiré (Figure 5N).
- Attachez le nœud de suture moyen (#3) autour du vaisseau avant de retirer le cathéter de l’artère carotide (figure 5O-P).
- Placez le cathéter dans PBS.
- Cathétérisme cardiaque droit.
- Isolez soigneusement la veine jugulaire externe droite du tissu conjonctif environnant et ligaturez toutes les petites branches avec 8-0 suture (pointes de flèches bleues) (Figure 6A).
REMARQUE : Pour le cathétérisme cardiaque droit, le cœur est généralement accessible par la veine jugulaire droite. - L’utilisation d’un 8-0 suturez, faites un nœud permanent (#1) pour fermer l’extrémité crânienne du vaisseau (figure 6B). Ensuite, faites un nœud lâche (#2) à l’extrémité caudale du vaisseau (figure 6C).
- Utilisez une aiguille de 25 g pour faire un petit trou à proximité du nœud permanent (#1) (figure 6D).
REMARQUE : Les veines jugulaires transportent le sang désoxygéné vers le cœur et ont une faible pression. Si la veine jugulaire est coupée, le sang ne jaillira pas (Figure 6D, E). - Tenez le cathéter et insérez-le dans la coupe de la veine (marque X) (figure 6E) et serrez le nœud caudal (#2) autour du cathéter et du vaisseau (figure 6F).
- Poussez lentement et doucement le cathéter dans le cœur droit. Surveillez la profondeur de l’extrémité du cathéter en fonction de la marque du cathéter (Figure 4B).
REMARQUE : L’évaluation de la pression systolique ventriculaire droite (RVSP) chez les souris à thorax fermé est un défi en raison de l’anatomie et de la structure complexes du VD. Cette étape nécessite un haut niveau d’expertise et beaucoup de pratique. Entre les mains d’un microchirurgien expérimenté, le taux de réussite du cathétérisme du ventricule droit peut approcher 90 %. - Évaluez la position de l’extrémité du cathéter en fonction du tracé des ondes de pression dans le logiciel. Lorsque l’extrémité du cathéter se trouve dans le ventricule droit, le moniteur affiche un tracé RVSP typique (Figure 6G, H).
REMARQUE : Lorsque la forme des courbes de pression pulmonaire semble atypique (par exemple, des courbes hérissées), cela implique un mauvais positionnement du cathéter. Ajustez la position du cathéter en tirant doucement le cathéter un peu vers l’arrière, puis en avançant lentement le cathéter vers une position plus centrale dans le ventricule droit. Pour éviter la génération d’artefacts dans les données de recherche, l’investigateur doit éviter les tentatives prolongées (pas plus de 1 min) ou répétées (pas plus de deux tentatives) de cathétérisme du ventricule droit. - Gardez le cathéter immobile et collectez les données pendant 5 min.
- Une fois l’enregistrement terminé, retirez délicatement le cathéter et nouez le nœud caudal (#2) autour du vaisseau (Figure 6I). Remettez le cathéter dans la solution PBS.
REMARQUE : Une fois l’expérience terminée, nettoyez le cathéter avec une solution d’enzymes digestives à 1 % conformément aux instructions du fabricant. En plus d’évaluer l’état hémodynamique, les chercheurs peuvent prélever les cœurs et les poumons pour un examen histopathologique de l’HTAP. Pour garantir l’efficacité de plusieurs bolus IV, les chercheurs peuvent isoler les cellules endothéliales pulmonaires et mesurer les niveaux de miARN let-7.
- Isolez soigneusement la veine jugulaire externe droite du tissu conjonctif environnant et ligaturez toutes les petites branches avec 8-0 suture (pointes de flèches bleues) (Figure 6A).
4. Analyse des données de pression artérielle
- Examinez l’enregistrement de la tension artérielle.
- Ouvrez le fichier de données du logiciel d’analyse de la pression artérielle (PAH JOVE.adicht).
- Dans le canal 1, sélectionnez une zone représentant le signal de pression et placez le curseur de forme d’onde sur le pic (marque X) pour mesurer l’amplitude de la pression (Figure 7A).
- Déterminez l’amplitude maximale de l’onde de pression. Cela représente la pression systolique (Figure 7A, flèche rouge).
- Extrayez la région d’intérêt (zone grise de la figure 7B ) de l’image en appuyant sur Maj + Commande + 3 (pour Mac) ou Windows + Maj + S (pour PC Windows) et collez-la dans un fichier graphique.
- Analyse statistique des données de pression artérielle.
- Saisissez les données de pression artérielle individuelles de la souris dans un logiciel d’analyse statistique.
- Effectuer un test t de Student non apparié pour l’analyse statistique de deux groupes d’étude (normoxie vs hypoxie ; hypoxie vs hypoxie + miARN 7C1/let-7). Considérons les différences de valeurs moyennes aussi significatives que p < 0,05.
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Representative Results
L’anesthésie réduit souvent la pression artérielle. Par conséquent, une dose minimale d’anesthésie a été utilisée pour abolir les mouvements en réponse à un stimulus nocif. L’accès réussi à la chambre ventriculaire droite peut être visualisé lorsque la forme d’onde hémodynamique change dans différentes régions du système veineux (Figure 8).
Dans cette étude, les souris ont été assignées au hasard au groupe normoxique (21 %O2) (n = 10), au groupe hypoxie (10 %O2) (n = 10) ou au groupe hypoxie + 7C1/let-7 (n = 10). Pour examiner l’effet du miARN let-7 dans la suppression du développement des HAP induit par l’hypoxie, des miARN 7C1/let-7 formulés ont été administrés aux souris C57BL/6 par voie intraveineuse à une dose de 1,5 mg/kg deux fois par semaine pendant 4 semaines (figure 2D).
4 semaines après l’exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, la TAS et la RVSP ont été mesurées chez une souris à poitrine fermée. La figure 9A montre la courbe de pression artérielle représentative des groupes de traitement normoxique, hypoxie ou hypoxie + miARN 7C1/let-7. Par rapport à ceux du groupe témoin normoxie, RVSP était significativement plus élevé dans le groupe hypoxie. De plus, par rapport au groupe hypoxie, le traitement avec le composé miARN 7C1/let-7 chez la souris a entraîné une diminution significative de la RVSP (Figure 9B). La TAS n’a changé dans aucun groupe, ce qui est conforme aux rapports précédents7. Le miARN 7C1/let-7 cible les cellules endothéliales et diminue la cascadede signalisation 8 du TGFβ. Les données montrent que le miARN 7C1/let-7 1,5 mg/kg est très efficace pour abaisser la pression artérielle dans le ventricule droit, démontrant l’efficacité du bolus IV multiple.
Figure 1 : Instruments chirurgicaux et équipement de mesure de la pression artérielle requis pour les procédures d’hypertension artérielle pulmonaire. (A) Outils chirurgicaux utilisés pour l’HTAP. (B) Une plate-forme d’injection de fortune fabriquée à partir d’un tampon absorbant enroulé autour d’un support en polystyrène à partir d’un emballage conique de 50 ml. Fixation d’un tube d’anesthésie de 10 cm de long à la plate-forme d’injection en tant que cône nasal avec type. (C) Packs de suture. Suture 5-0 pour la fermeture de l’incision et 8-0 suture pour la ligature. (D-F) Équipement de mesure de la pression artérielle utilisé pour la procédure d’HTAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Contexte expérimental pour l’induction des HTAP. (A) Photographie de la mise en place du système hypoxique BioSpherix. Différentes parties du système d’induction sont indiquées. (B-C) Capteur d’oxygène surveillant la concentration d’O2 de la chambre d’hypoxie. (D) Calendrier expérimental pour le traitement des composés miARN 7C1/let-7 et l’exposition au niveau d’oxygène pour tous les groupes d’animaux pendant l’induction des HAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Photographies des principales étapes chirurgicales de l’injection de la veine jugulaire. (A) Souris sur une balance de poids. (B) Configuration du système d’induction d’anesthésie chez les rongeurs. Différentes parties du système d’induction sont indiquées. (C-D) Photos d’une souris anesthésiée à l’isoflurane dans une chambre d’induction. (E) Zone chirurgicale enlevée par la fourrure. (F) Une souris placée sur une plate-forme d’injection et a respiré 1,5 % d’isoflurane à travers un cône nasal à partir d’un vaporisateur. (G) Incision cutanée pour l’approche de la veine jugulaire. (H) Dissection chirurgicale de la veine jugulaire externe droite. (I) Imagerie à grossissement plus élevé montrant la veine jugulaire droite isolée. Notez un papier blanc sous le vaisseau, rendant la veine plus visible. (J-K) Insertion de l’aiguille de la veine jugulaire droite avec le biseau vers le haut. (L) Injection d’un composé avec un colorant bleuâtre dans la veine jugulaire. (M) Appliquer une pression sur le site d’injection à l’aide d’un coton-tige après avoir retiré l’aiguille. (N) Suturer la plaie avec une suture 5-0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Étalonnage du cathéter. (A) Trempage de l’embout du cathéter 1,0 F dans du PBS préchauffé à 37 °C. (B) Des marques de distance sur le cathéter pour aider à estimer la profondeur d’insertion du cathéter dans l’aorte ascendante et le ventricule droit. (C) Équipement de mesure de la pression artérielle soumis à un étalonnage de base zéro. (Ca') Capture d’écran de l’analyse de la pression artérielle par logiciel d’analyse de base du cathéter. (D) Dans le menu déroulant Canal 1, sélectionnez la boîte de dialogue Conversion d’unités dans le logiciel d’analyse de la pression artérielle. (E) Réglage des valeurs de conversion d’unités par défaut pour convertir le signal de tension d’entrée en mmHg. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Interventions chirurgicales pour les mesures de la pression artérielle systémique (TAS). (A) Une incision médiane de la mandibule au sternum sur la peau du cou. (B) Séparation de la glande salivaire pour exposer la trachée. (C) Artère carotide droite exposée et veine jugulaire externe droite après dissection tissulaire. (D) Une section isolée de 5 mm de l’artère carotide. (E, F) Suture nœud permanent à l’extrémité crânienne et deux nœuds lâches à l’extrémité caudale. (G,H) Faire un petit trou (marque X) sur l’artère carotide juste caudale au nœud permanent (#1). (I) Insertion du cathéter dans l’artère carotide. (J) Fixation du cathéter avec un nœud de suture moyen (#3). (K,L) Relâcher doucement le premier nœud lâche (#2). (M) Ondes de pression artérielle représentatives. (N) Desserrement du nœud de suture moyen (#3). (O,P) Resserrer le nœud de suture moyen (#3) autour du vaisseau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Interventions chirurgicales pour les mesures de la pression systolique du ventricule droit (RVSP). (A) Ligature des petites branches de la veine jugulaire droite (pointes de flèches bleues). (B) Un nœud permanent (#1) sur l’extrémité crânienne de la veine jugulaire. (C) Un nœud lâche (#2) sur l’extrémité caudale de la veine jugulaire. (D) Faire un petit trou sur la veine jugulaire droite caudale au nœud permanent (#1). (E) Insertion d’un cathéter dans la veine jugulaire à travers un petit trou (marque X). (F) Resserrer le nœud caudal (#2) autour du cathéter et du vaisseau. (G) Pousser le cathéter dans le ventricule droit du cœur. (H) Représentant RVSP. (I) Resserrer le nœud caudal (#2) autour du vaisseau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Analyse des données du logiciel d’analyse de la pression artérielle après l’enregistrement. (A) Utilisation du curseur de forme d’onde pour mesurer l’amplitude de la pression à partir des données brutes du logiciel d’analyse de la pression artérielle dans le canal 1. (B) Extraction de la région d’intérêt de l’image brute du logiciel d’analyse de la pression artérielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Transition de forme d’onde hémodynamique pendant le cathétérisme du ventricule droit. (A-D) Traces représentatives des changements de pression pendant le cathétérisme du ventricule droit d’une souris C57BL/6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Figures de représentation de l’analyse de la pression artérielle et analyse des données. (A) Courbes représentatives de la SBP et du RVSP chez les souris traitées par normoxie, hypoxie et hypoxie + miARN 7C1/let-7. (B) Graphiques récapitulatifs de la TAS et du PSRV chez les souris traitées par normoxie, hypoxie et hypoxie + miARN 7C1/let-7 (NS : non significatif ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; test t de Student bilatéral non apparié). N = 10 par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Plusieurs modèles animaux d’hypertension pulmonaire ont été établis pour imiter les événements de résistance vasculaire pulmonaire élevés chez les sujets humains. Parmi eux, le modèle d’HTAP induite par l’hypoxie chez la souris a été largement utilisé pour évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies expérimentales pour l’HTAP. La recherche utilisant ce modèle nécessite souvent l’administration de composés aux souris. En comparaison avec d’autres protocoles d’injection intraveineuse (IV) et d’évaluation hémodynamique invasive publiés, cette méthode fournit à la fois une illustration visuelle et une description détaillée.
Il y a trois étapes critiques pour la bonne exécution de la procédure et pour obtenir des mesures précises et reproductibles de la pression artérielle. Tout d’abord, assurez-vous que l’aiguille de la seringue est correctement positionnée dans la veine jugulaire. Une injection incorrecte de la veine jugulaire peut entraîner une injection sous-cutanée. Deuxièmement, assurez-vous de la profondeur suffisante de l’anesthésie. Une profondeur d’anesthésie constante dans chaque souris est importante pour la génération de données comparables entre les groupes. Une anesthésie trop profonde peut entraîner une diminution significative de la pression artérielle. En plus de l’anesthésie par inhalation d’isoflurane, l’injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine est une autre méthode d’anesthésie largement utilisée pour la chirurgie de la souris. Les deux méthodes présentent des avantages et des inconvénients. L’anesthésie par inhalation d’isoflurane présente plusieurs avantages par rapport à la kétamine/xylazine injectable, notamment une apparition rapide, l’absence de médicaments contrôlés, une récupération rapide et un contrôle beaucoup plus facile de la profondeur de l’anesthésie. Les inconvénients sont le coût de l’équipement, l’odeur désagréable et l’exposition humaine aux gaz anesthésiques résiduaires. Troisièmement, assurez-vous que le cathéter se trouve à l’intérieur du ventricule droit du cœur. Des tentatives prolongées ou infructueuses de cathétérisme du ventricule droit peuvent entraîner de fausses lectures de tension artérielle.
L’injection IV chez la souris est principalement administrée par les veines latérales de la queue. Bien que cette voie soit facile à atteindre avec des aiguilles, cette technique est parfois difficile à réaliser en bolus IV multiple. Les deux principaux défis de la mise en œuvre de cette technique sont la variabilité de la profondeur des veines et la difficulté de visualisation des aiguilles en raison de la couleur de la peau et de la dureté de la peau de la queue de souris. Plus important encore, il n’y a aucun moyen de confirmer si tout le contenu de l’injection a réussi à pénétrer dans la circulation sanguine et non dans les tissus environnants. La veine jugulaire est un site d’accès privilégié parce que (1) elle est cliniquement pertinente, (2) elle fournit une confirmation visuelle de l’administration de l’injectat dans la veine, (3) elle permet plusieurs injections d’un groupe d’animaux au cours de l’expérience, et (4) cette technique d’injection est sûre et la procédure ne provoque aucun effet secondaire.
Il existe trois façons d’enregistrer la pression artérielle chez la souris : (1) Pléthysmographie non invasive de la coiffe de la queue10. Les systèmes permettent des mesures répétées au cours d’une étude longitudinale. (2) Radiotélémétrie11. Les systèmes permettent de surveiller la pression artérielle en temps réel chez les animaux de laboratoire éveillés et se déplaçant librement. (3) Cathéters intra-artériels invasifs12. Les systèmes permettent des mesures de TAS et de PSR aiguës. Dans ce protocole, nous avons choisi un cathéter de pression pour les mesures de pression systémique et ventratriculaire droite haute fidélité. Cependant, cette méthode présente certaines limites. Premièrement, le cathéter de pression et l’équipement de mesure de la pression artérielle sont coûteux (figure 1E-F). Deuxièmement, il faut anesthésier les animaux, ce qui provoque une diminution de la pression artérielle. Troisièmement, le cathétérisme cardiaque droit est une procédure terminale qui ne permet pas de mesures en série. Quatrièmement, la procédure n’est pas facile à apprendre, même par un microchirurgien bien formé.
Une fois la pression artérielle enregistrée, l’investigateur peut isoler les cœurs et les poumons des animaux pour la caractérisation histologique de l’HTAP. Par exemple, les mesures de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite pour l’hypertrophie ventriculaire droite et l’analyse des vaisseaux distaux pulmonaires musculés pour le remodelage de l’artère pulmonaire musculaire. Les données montrent que le miARN 7C1/let-7 est très efficace pour abaisser la pression artérielle pulmonaire, démontrant l’efficacité de notre dosage multiple de bolus IV. De plus, les chercheurs peuvent isoler les cellules endothéliales pulmonaires du poumon entier fraîchement isolé pour évaluer l’efficacité des matériaux injectés.
En résumé, ce protocole fournit une procédure étape par étape pour l’exécution de plusieurs bolus IV et la surveillance hémodynamique invasive dans un modèle d’HTAP induite par l’hypoxie chez la souris. Les chercheurs peuvent utiliser les techniques d’injection de la veine jugulaire et de cathétérisme du ventricule artériel/droit décrites ici pour une grande variété de modèles de rongeurs nécessitant une injection intraveineuse et une surveillance hémodynamique.
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Disclosures
K Zsebo, M Simons et P-Y Chen sont les fondateurs scientifiques et les actionnaires de VasoRx, Inc. M Simons est membre du conseil consultatif scientifique de VasoRx, Inc. HJ Duckers est un employé et actionnaire de VasoRx. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus, en partie, par une microsubvention du Joint Biology Consortium fournie dans le cadre de la subvention P30AR070253 des NIH (PYC), du Fonds d’éducation en recherche médicale cardiovasculaire (PYC), du Fonds VasoRx, Inc. (MS) et des subventions des NIH HL135582 (MS), HL152197 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 prolene suture pack | Ethicon | 8698G | for incision closure |
| 8-0 nylon suture pack | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | for ligation |
| Anesthesia induction chamber | VETEQUIP | #941444 | Holds the animal during anesthesia exposure |
| Catheter Interface Cable PEC-4D | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000 | |
| Charcoal canister filters | VETEQUIP | #931401 | to help remove waste anesthetic gases |
| Cotton swabs | McKesson | 24-106 | for applying pressure to the injection site to prevent bleeding |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Surgical tools |
| Insulin syringe 28 G | EXEL | 26027 | for jugular vein IV injection |
| Isoflurane | COVETRUS | #029405 | for mouse anesthesia |
| LabChart 8 Software | ADInstruments | for data analysis | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) | Millar | for invasive blood pressure measurement | |
| Needle-25 G | BD | 305124 | for making a samll hole in a vessel |
| Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor | BioSpherix | E702 | for oxygen concentration monitoring |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation. |
|
| Prism 8 | GraphPad | for statistics and scientific graphing | |
| Semisealable hypoxia chamber | BioSpherix | an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | Surgical tools |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | Surgical tools |
| VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | Lot# B2-L-16Apr | IV injection compound |
| VIP 3000 Veterinary Vaporizer | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | for accurate anesthesia delivery |
References
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- Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
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