Gjentatt intravenøs bolusdosering og invasiv hemodynamisk vurdering i en hypoksiindusert mus lungearterie hypertensjonsmodell

Summary

Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å utføre administrering av flere intravenøse bolusdoser og invasiv hemodynamisk overvåking hos mus. Etterforskere kan bruke denne protokollen for fremtidig terapeutisk sammensatt screening for pulmonal arterie hypertensjon.

Abstract

Pulmonal arteriell hypertensjon (PAH) er en progressiv livstruende sykdom, som primært påvirker små lungearterioler i lungene. Foreløpig finnes det ingen kur mot PAH. Det er viktig å oppdage nye forbindelser som kan brukes til å behandle PAH. Musehypoksiindusert PAH-modell er en mye brukt modell for PAH-forskning. Denne modellen rekapitulerer kliniske manifestasjoner av PAH gruppe 3 sykdom og er et viktig forskningsverktøy for å evaluere effekten av nye eksperimentelle terapier for PAH. Forskning ved hjelp av denne modellen krever ofte administrering av forbindelser i mus. For en forbindelse som må gis direkte inn i blodet, er optimalisering av intravenøs (IV) administrasjon en viktig del av eksperimentelle prosedyrer. Ideelt sett bør IV-injeksjonssystemet tillate flere injeksjoner over en bestemt tidsforløp. Selv om den musehypoksiinduserte PAH-modellen er svært populær i mange laboratorier, er det teknisk utfordrende å utføre flere intravenøs bolusdosering og invasiv hemodynamisk vurdering i denne modellen. I denne protokollen presenterer vi trinnvise instruksjoner om hvordan man utfører multippel intravenøs bolusdosering via vena jugularis hos mus og utfører arteriell og høyre ventrikkelkateterisering for hemodynamisk vurdering i musehypoksiindusert PAH-modell.

Introduction

Pulmonal arteriehypertensjon (PAH) er definert ved et gjennomsnittlig systolisk trykk i lungearterien større enn 20 mmHg i hvile ^1,2. Det er en progressiv og dødelig sykdom preget av en vedvarende forhøyning i pulmonalt arterielt trykk, noe som fører til overbelastning av høyre ventrikkel og til slutt død på grunn av høyre ventrikkelsvikt¹. Foreløpig finnes det ingen kur mot PAH.

Bruk av dyremodeller av pulmonal hypertensjon er viktig for å teste effektiviteten av eksperimentelle PAH-terapier. Blant disse modellene har den musehypoksiinduserte PAH-modellen gitt nøkkelinnsikt i human PAH gruppe 3 sykdomsutvikling ^3,4. Forskning ved hjelp av denne modellen krever ofte administrering av forbindelser i mus for å evaluere den nye forbindelsens effektivitet og sikkerhet. Derfor trenger etterforskere en detaljert eksperimentell prosedyre for sammensatt dosering og hemodynamiske målinger for å sikre injeksjonskonsistens og reproduserbarhet av blodtrykksmåling fra begynnelse til slutt.

Metoder for intravenøs (IV) injeksjon og blodtrykksmåling er rapportert i litteraturen ^5,6. Metodikken mangler imidlertid visuell illustrasjon og detaljert beskrivelse. Her illustrerer vi de viktigste trinnene for en vellykket intravenøs bolusinjeksjon og nøyaktig måling og registrering av systemisk og høyre ventrikkelblodtrykk. Prosedyrene som presenteres her er en viktig ressurs for etterforskere som er interessert i IV-ruten for sammensatt administrasjonsplattform for å utvikle en behandling for PAH.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble utført under protokoller godkjent av Yale University Institutional Animal Care and Use Committees.

1. Klargjøring av dyr, verktøy, blodtrykksmåleutstyr og hypoksikammer

1. Dyr akklimatisering.
   MERK: Eksperimentelle dyr som ble brukt til denne studien var hann, 8 uker gamle C57BL/6 mus som veide 25-27 g. Flere faktorer bør vurderes ved estimering av antall dyr som kreves for forsøket, inkludert operasjonsassosiert dødelighet, uventede kirurgiske komplikasjoner og plutselig uventet død. Bruk minst 10 mus per gruppe for å nå statistisk styrke og unngå underpowered studier.
   1. Ved mottak, hus dyrene i ventilerte gnagerbur (grupper på fem dyr per bur) utstyrt med passende sengetøy, gnager chow og vann. La dyrene akklimatisere seg til det nye miljøet (12 timers lys-mørk syklus ved 18-20 °C) i minst 3 dager.
   2. Tilordne dem tilfeldig til følgende grupper: Normoksi (gruppe 1), hypoksi (gruppe 2) og hypoksi + 7C1 / let-7 miRNA (gruppe 3).
2. Kirurgiske verktøy og klargjøring av blodtrykksmåleutstyr.
   1. Steriliser alle kirurgiske verktøy ved autoklavering (figur 1A).
   2. Klargjør en provisorisk injeksjonsplattform med hjemmelaget anestesinesekjegle (figur 1B), suturpakker (figur 1C) og utstyr for PAH-prosedyren (figur 1D-F).
3. Eksperimentell setting for pulmonal arterie hypertensjon (PAH) induksjon.
   1. Still inn N_2-tanken , oksygensensoren og det semisealable hypoksikammeret (figur 2A).
   2. Etabler et settpunkt på 10 %_O2 i oksygensensoren og la systemet nå steady state (figur 2B, C).
   3. Hold hypoksi (gruppe 2) og hypoksi + 7C1 / let-7 miRNA (gruppe 3) dyr i hypoksi (10% O₂) i 3 uker. Etter 3 uker med hypoksi, plasser dyrene under normoksiske forhold i 1 uke (figur 2D). Den normoksiske gruppen (gruppe 1) forblir i normoksi i 4 uker.
      MERK: (1) 3 uker med hypoksi etterfulgt av 1 uke med normoksi er en veletablert metode for å utvikle PAH og hjertesvikt i høyre ventrikkel⁷. Oksygensensoren oppdager O_{2-konsentrasjon} inne i det semisealable hypoksikammeret og korrigerer det ved infusjon av N_2-gass gjennom gassinfusjonsrøret.
   4. Inspiser dyrene daglig i hele forsøkets varighet (3 uker). Rådfør deg med en veterinær hvis dyrene viser tegn på nød som dramatisk vekttap og pustevansker. Hvis eutanasi er nødvendig for dyrene i alvorlig nød, ekskluder dyret fra studien.
      MERK: Hypoksi eksponering forårsaker mus kroppsvekt tap. Et tap på 10% kroppsvekt brukes vanligvis som en pålitelig indikasjon på PAH-utvikling.
   5. Unngå omfattende åpning av hypoksikammeret. For burrengjøring, påfylling av mat, bytte vannflasker og sammensatt administrasjon, åpne kamrene i ikke mer enn 1 time per uke.

2. Intravenøs bolusinjeksjon via vena jugularis

1. Musepreparasjon og anestesi.
   1. Ta ut hypoksi (gruppe 2) og hypoksi + 7C1 / let-7 miRNA (gruppe 3) musebur fra hypoksikammeret og fjern dyret forsiktig fra buret.
      MERK: Doseringsregimet for 7C1/let-7 miRNA (1,5 mg/kg i.v./dose) er to ganger per uke i 4 ukers behandling. Det anbefales at etterforskere tar både hypoksi og hypoksi + sammensatte behandlingsbur ut av hypoksikammeret under IV-injeksjon for å sikre at alle dyrene får samme størrelse av hypoksieksponering per tidsintervall.
   2. Vei musen med en presisjonsvekt og registrer vekten (figur 3A).
   3. Plasser musen i et anestesiinduksjonskammer koblet til bedøvelsesfordamperen og lukk den (figur 3B). Gi termisk støtte og bruk øyesmøremiddel på begge øynene for å forhindre tørking mens du bedøver. Utsett musen for 3 % isofluran til den er bevisstløs (figur 3C-D).
   4. Fjern musen fra kammeret og barber pelsen fra kjeven kranialt til midten av brystbenet kaudalt. Barber pelsen sideveis fra kjevevinklene, gjennom sidene av nakken og mot skuldrene (figur 3E).
   5. Plasser den isofluranbedøvede musen i liggende stilling (med magesiden opp) på en injeksjonsplattform under et disseksjonsmikroskop. Oppretthold anestesien via en nesekjegle med 1,5 % isofluran og hold forsiktig fast de fire bena med tape for å immobilisere kroppen (figur 3F).
   6. Påfør en skadelig stimulus (dvs. tåklemme) med rette tang for å sikre et tilstrekkelig nivå av anestesi. Den bedøvede musen skal ikke reagere på stimuleringen før og under hele den kirurgiske prosedyren.
2. Forberedelse av injeksjonsmiddel.
   1. Tilbered en enkeltdose injeksjonsforbindelse i en dose på 1,5 mg/kg under sterile forhold.
      MERK: Varm injeksjonsforbindelsen til romtemperatur (RT) siden injeksjon av kalde stoffer kan forårsake ubehag og fall i musens kroppstemperatur (hvis dette ikke skader forbindelsen). Den optimale dosen og varigheten av forbindelsen 7C1 / let-7 miRNA brukt i denne studien er basert på tidligere publikasjoner ^8,9.
   2. Fyll den sterile engangssprøyten med volumet som skal injiseres. Hold sprøyten loddrett og før stempelet for å drive ut luften fra sprøyten. Sprøyten skal ikke brukes om igjen.
   3. Begrens injeksjonsvolumet til 200 μL i en 25 g mus for å redusere forekomsten av hemodilusjon og unormale hjerteeffekter på dyrene. Hvis et større volum er nødvendig, del injeksjonsforbindelsen i to injeksjoner med et intervall på 10 minutter.
3. Forbered musen for IV injeksjon.
   1. Skrubb det kirurgiske området forsiktig tre ganger med tre alternerende runder med povidon-jodoppløsning og 70% etanol. Administrer buprenorfin (0,05 mg/kg, SQ) 30 minutter før det kirurgiske inngrepet.
   2. Lag et 0,5 cm langsgående kutt litt til høyre for nakkens midtlinje ved hjelp av et skalpellblad (figur 3G).
   3. Bruk tang for å skille muskel og fettvev for å finne høyre vena jugularis ytre (figur 3H).
      MERK: Varier injeksjonsstedene hver gang for å unngå arrdannelse.
   4. Bruk en objektivlinse med høy effekt for å gjøre det enkelt å visualisere injeksjonsområdet (figur 3I).
4. IV injeksjon
   1. Stikk en 28 G steril nål inn i vena jugularis med nålens skråkant oppover (figur 3J, K).
      MERK: Hale vene injeksjon er et alternativ til jugularis vene injeksjon. Imidlertid er denne teknikken vanskelig å utføre gjentatt dosering på grunn av variasjonen i venedybde, musens halehudfarge og hudhardhet.
   2. Trykk sprøytestempelet langsomt for å injisere forbindelsen inn i venen. La nålen forbli i venen i ytterligere 10 timer for å hindre tilbakestrømning av injektanten (figur 3L).
      MERK: Det blåaktige fargestoffet gjør det enkelt å visualisere injeksjonen. Ikke inkluder fargestoffet når du injiserer testmaterialer. En unøyaktig injeksjon vil resultere i akkumulering av blåaktig fargestoff rundt IV injeksjonsstedet.
   3. Fjern nålen og bruk en bomullspinne til å trykke på injeksjonsstedet for å forhindre blødning (figur 3M).
   4. Sutur huden med 5-0 sutur (figur 3N). Etter operasjonen, flytt dyret til et varmt, rent, tørt område og gi meloksikam (1 mg / kg, SQ, q24h). Plasser dyret i et rent gjenopprettingsbur uten sengetøy, men bunnen dekket av et papirhåndkle.
      MERK: Musen skal være våken fra anestesi og gjenvinne bevisstheten innen 5 min når den er tilbake til oppvåkningsburet. Overvåk musen for tegn på nød.
   5. Sett dyrene tilbake til buret og sett museburet tilbake i hypoksikammeret.
      MERK: Hele prosedyren, fra bedøvelse av en mus til etterbehandling av jugularveninjeksjon, tar omtrent 10-15 minutter av en enkelt eksperimentør. For å forkorte normoksieksponeringen hos mus, anbefales det at minst to etterforskere samarbeider for å oppnå en injeksjonsprosedyre i jugularvenen.

3. Blodtrykksmåling

1. Forbered instrumenter for blodtrykksmåling.
   1. Bløtlegg spissen av 1,0 F kateter i 37 °C forvarmet PBS minst 30 minutter før hemodynamisk måling (figur 4A).
   2. Mål avstanden fra kateterinnstikkstedet til ønsket plassering av kateterspissen. For eksempel er avstanden mellom musen som stiger opp til midten av nakken ca. 1-1,2 cm. Avstanden mellom høyre hjertekammer til midten av nakken er ca. 2,3-2,8 cm.
   3. Merk to kateteravstandsmarkeringer for å gi en visuell indikasjon på innføringsdybden (figur 4B).
   4. Fest kateteret til trykkomformeren, koble trykktransduseren til inngangskanal 1 på datainnsamlingsenheten, slå på trykk-volumkontrollenheten og start programvare for blodtrykksanalyse for datainnsamling. Opprett et nytt blodtrykksanalysedokument og angi kanal 1 for trykk.
   5. Utfør en trykkkalibrering i henhold til produsentens protokoll. La hele oppsettet stabilisere seg i minst 5 minutter (figur 4C).
   6. I blodtrykksanalyseprogramvare velger du Enhetskonvertering fra rullegardinmenyen Kanal 1 (figur 4D, rød pil).
   7. Angi standard konverteringsverdier for enheter (figur 4E).
      MERK: Blodtrykk er representert som millimeter kvikksølv (mmHg). Den standardiserte trykkeffekten fra trykkreguleringsenheten er 1 V per 100 mmHg. 25 mmHg tilsvarer 0,25 V effekt, og 100 mm Hg tilsvarer 1 V utgang.
2. Forbered musen for blodtrykksmålingsprosedyre.
   1. Bedøv musen med 3% isofluran innånding gjennom en nesekegle.
   2. Påfør veterinærsalven direkte på den okulære overflaten av museøynene for å forhindre tørrhet, da musen ikke kan lukke øynene under anestesi. Barber pelsen fra musens nakke mens du er under anestesi.
   3. Skrubb det barberte området med tre alternerende runder med povidon-jodoppløsning og 70% etanolpinne. Plasser den bedøvede musen i liggende stilling på en injeksjonsplattform under et disseksjonsmikroskop. Plasser musens nese i nesekjeglen for å opprettholde anestesi (1,5% isofluran) gjennom hele den kirurgiske prosedyren.
   4. Test den bedøvede musens motorrespons på den skadelige stimulansen. Den bedøvede musen skal ikke reagere på en skadelig stimulans før og under operasjonen.
      MERK: Inhalerbare (isofluran) og injiserbare (ketamin / xylazin) anestetika kan redusere blodtrykket. Generelt har isofluran inhalasjonsanestesi en liten effekt på å senke blodtrykket enn ketamin/xylazin. Derfor er isofluran det foretrukne anestetikum på sniffestoffer fremfor ketamin/xylazin. Å oppnå riktig dybde av anestesi er kritisk for nøyaktige og reproduserbare hemodynamiske målinger. Etterforskeren må holde dybden av anestesi konstant for hver mus.
3. Stigende aortakateterisering
   1. Påfør en skadelig stimulus (dvs. tåklemme) med rette tang for å sikre et tilstrekkelig nivå av anestesi. Lag et midtlinjesnitt av huden fra kjeven til brystbenet (figur 5A).
   2. Separer spyttkjertlene og eksponer luftrøret (figur 5B).
   3. Bruk tang for å fjerne bløtvevet langs karene for å eksponere høyre halspulsåre og høyre vena jugularis eksterna (figur 5C).
   4. Sett 0,5 ml PBS i hulrommet for å bremse utviklingen av vasospasme mens du manipulerer halspulsåren.
   5. Isoler forsiktig en 5 mm seksjon av høyre halspulsåre. Plasser et stykke sterilt hvitt papir under beholderen som bakgrunn for å gjøre arterien mer synlig (figur 5D).
      MERK: Forsiktig skille vagus nerve (hvit) fra arterien og sørg for ikke å kutte eller skade nerve eller arterie.
   6. Med 8-0 suturbind en permanent knute (# 1) for å stenge av kranieenden av fartøyet (figur 5E).
   7. Bind en første løs knute (# 2) for å midlertidig okkludere blodstrømmen fra aorta. Deretter knytter du en ny løs knute (# 3) mellom de to første suturene (figur 5F). Den andre løse knuten (# 3) vil bli brukt til å raskt feste kateteret etter plassering.
   8. Bruk en 25 G nål til å lage et lite hull, stort nok til å passere kateteret, på linje med beholderen mellom #3 og #1 ligaturer (figur 5G).
      MERK: Carotisarterier bærer oksygenert blod fra hjertet og har svært høyt trykk. Hvis halspulsåren kuttes, vil dette trykket føre til at blodet spruter ut (figur 5H).
   9. Hold kateteret 1,5 inches fra spissen og forsiktig sette spissen av kateteret gjennom hullet i arterien (X-). Stram den midtre suturknuten (# 3) rundt kateteret og beholderen som fortsatt tillater passasje av kateteret (figur 5I-J).
      MERK: Dette trinnet krever øvelse. De potensielle komplikasjonene med dette trinnet inkluderer blødning på kateterinnføringsstedet og vasospasme. Når blødning oppstår, reduserer blodtap fra blødningsarterien blodvolumet, noe som fører til et alvorlig fall i systemisk blodtrykk. På grunn av alvorlighetsgraden har dyret nådd et humant endepunkt og må avlives. For mekanisk indusert vasospasme oppstår det vanligvis under kateterinnsetting forårsaket av en vedvarende sammentrekning av blodkarene. Dette gjør blodkaråpningen mindre og forhindrer kateterfremgang til halspulsåren. Ikke bruk overdreven kraft mot motstand for å fremme kateteret. Når moderat eller alvorlig vasospasmeresistens oppstår, prøv igjen om en liten stund eller bruk et mindre kateter (f.eks. 1,0 F). Erfarne mikrokirurger kan oppnå 100% suksessrate for stigende aortakateterisering.
   10. Etter at kateteret har passert den første løse knuten (# 2) med sensorspissen, fest den andre løse knuten (# 2) for å sikre kateteret og slipp forsiktig den første løse knuten (figur 5K, L).
   11. Fortsett å føre kateteret mot aorta under oppadstigende i henhold til merket på kateteret (figur 4B) inntil trykkanalysen viser arteriell blodtrykksprofil (figur 5M). Registrer systemisk blodtrykk (SBP) data ved hjelp av datainnsamlingssystemet og programvaren.
   12. Løsne den midtre suturknuten (# 3) slik at kateteret kan trekkes ut (figur 5N).
   13. Bind den midtre suturknuten (# 3) rundt karet før du trekker kateteret ut av halspulsåren (figur 5O-P).
   14. Plasser kateteret i PBS.
4. Høyre hjertekateterisering.
   1. Isoler forsiktig den høyre ytre jugularvenen fra det omkringliggende bindevevet og liger alle de små grenene med 8-0 sutur (blå pilspisser) (figur 6A).
      MERK: For høyre hjertekateterisering er hjertet vanligvis tilgjengelig via høyre halsvene.
   2. Med 8-0 sutur, bind en permanent knute (# 1) for å stenge av kranieenden av fartøyet (figur 6B). Deretter knytter du en løs knute (# 2) på den kaudale enden av fartøyet (figur 6C).
   3. Bruk en 25 G kanyle til å lage et lite hull proksimalt for den permanente knuten (figur 1D).
      MERK: Jugular vener bærer deoksygenert blod til hjertet og har lavt trykk. Hvis halsvenen er kuttet, vil blodet ikke sprute ut (figur 6D, E).
   4. Hold kateteret og stikk kateteret inn i skjæringen av venen (X-merket) (figur 6E) og stram den kaudale knuten (# 2) rundt kateteret og karet (figur 6F).
   5. Skyv kateteret sakte og forsiktig inn i høyre hjerte. Overvåk kateterspissdybden basert på katetermerket (figur 4B).
      MERK: Vurdering av høyre ventrikulær systolisk trykk (RVSP) i lukkede brystmus er en utfordring på grunn av den komplekse RV-anatomien og strukturen. Dette trinnet krever et høyt nivå av kompetanse og mye praksis. I hendene på en erfaren mikrokirurg kan den vellykkede frekvensen for høyre ventrikkelkateterisering nærme seg 90%.
   6. Vurder posisjonen til kateterspissen i henhold til trykkbølgesporingen i programvaren. Når spissen av kateteret er i høyre ventrikkel, vil skjermen vise en typisk RVSP-sporing (figur 6G, H).
      MERK: Når formen på lungetrykkskurver ser atypisk ut (f.eks. piggete kurver), innebærer dette feil posisjonering av kateteret. Juster kateterposisjonen ved å trekke kateteret forsiktig litt tilbake, og deretter sakte fremme kateteret til en mer sentral posisjon i høyre ventrikkel. For å unngå generering av artefakter i forskningsdata, bør etterforskeren unngå langvarige (ikke mer enn 1 min) eller gjentatte forsøk (ikke mer enn to forsøk) på høyre ventrikkelkateterisering.
   7. Hold kateteret ubevegelig og samle inn dataene i 5 minutter.
   8. Etter at opptaket er fullført, trekk kateteret forsiktig ut og bind den kaudale knuten (# 2) rundt beholderen (figur 6I). Plasser kateteret tilbake i PBS-oppløsning.
      MERK: Etter at forsøket er fullført, rengjør kateteret med 1% fordøyelsesenzymoppløsning i henhold til produsentens instruksjoner. I tillegg til å vurdere hemodynamisk status, kan forskere høste hjerter og lunger for PAH histopatologisk undersøkelse. For å sikre effektiviteten av flere IV bolusdosering, kan etterforskere isolere lungeendotelceller og måle let-7 miRNA-nivåer.

4. Analyse av blodtrykksdata

1. Undersøk blodtrykksregistreringen.
   1. Åpne datafilen for blodtrykksanalyse (PAH JOVE.adicht).
   2. I kanal 1 velger du et område som representerer trykksignalet og plasserer bølgeformmarkøren på toppen (X-merket) for å måle trykkamplitude (figur 7A).
   3. Bestem maksimal amplitude av trykkbølgen. Dette representerer det systoliske trykket (figur 7A, rød pil).
   4. Trekk ut interesseområdet (gråområde i figur 7B ) fra bildet ved å trykke på Shift + Command + 3 (for Mac) eller Windows + Shift + S (for Windows PC) og lim det inn i en grafikkfil.
2. Statistisk analyse av blodtrykksdata.
   1. Skriv inn de enkelte musens blodtrykksdata i statistisk analyseprogramvare.
   2. Utfør en uparret Student t-test for statistisk analyse av to studiegrupper (normoksi vs. hypoksi; hypoksi vs. hypoksi + 7C1 / let-7 miRNA). Vurder forskjellene i gjennomsnittsverdier så signifikante som p < 0,05.

Representative Results

Anestesi reduserer ofte blodtrykket. Derfor ble en minimumsdose anestesi brukt til å avskaffe bevegelsene som svar på en skadelig stimulus. Vellykket tilgang til høyre ventrikkelkammer kan visualiseres når den hemodynamiske bølgeformen endres i forskjellige regioner av venøse systemer (figur 8).

I denne studien ble mus randomisert til normoksisk (21% O₂) gruppe (n = 10), hypoksi (10% O₂) gruppe (n = 10) eller hypoksi + 7C1 / let-7 behandlingsgruppe (n = 10). For å undersøke effekten av let-7 miRNA i undertrykkelsen av hypoksiindusert PAH-utvikling, ble formulert 7C1/let-7 miRNA administrert til C57BL/6-musene intravenøst i en dose på 1,5 mg/kg to ganger per uke i 4 uker (figur 2D).

4 uker etter eksponering for hypoksi eller normoksi ble SBP og RVSP målt i lukket brystmus. Figur 9A viser den representative blodtrykkskurven fra normoksiske, hypoksi eller hypoksi + 7C1/let-7 miRNA-behandlingsgruppene. Sammenlignet med de i normoksi-kontrollgruppen økte RVSP signifikant i hypoksigruppen. I tillegg, sammenlignet med hypoksigruppen, resulterte behandling med 7C1 / let-7 miRNA-forbindelse hos mus i signifikant redusert RVSP (figur 9B). SBP endret seg ikke i noen grupper, noe som stemmer overens med de tidligere rapportene⁷. 7C1 / let-7 miRNA retter seg mot endotelceller og reduserer TGFβ signalkaskade⁸. Dataene viser at 7C1/let-7 miRNA 1,5 mg/kg er svært effektivt for å senke blodtrykket i høyre ventrikkel, noe som viser effektiviteten av multippel IV bolusdosering.

Figur 1 Kirurgiske instrumenter og blodtrykksmåleutstyr som kreves ved hypertensjon i lungearterien. (A) Kirurgiske verktøy som brukes til PAH-prosedyre. (B) En provisorisk injeksjonsplattform laget av en absorberende pute viklet rundt et isoporstativ fra en 50 ml konisk pakke. Feste et 10 cm langt anestesirør til injeksjonsplattformen som nesekjegle med type. (C) Suturpakker. 5-0 sutur for snittavslutning og 8-0 sutur for ligering. (VG Nett) Utstyr for blodtrykksmåling som brukes til PAH-prosedyren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Eksperimentell setting for PAH-induksjon. (A) Fotografi av oppsett av BioSpherix hypoksisk system. Ulike deler av induksjonssystemet er indikert. (B-C) Oksygensensor overvåker hypoksikammerets_{O2-konsentrasjon}. (D) Eksperimentell tidslinje for 7C1 / let-7 miRNA-forbindelsesbehandling og oksygennivåeksponering for alle dyregrupper under PAH-induksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Fotografier av viktige kirurgiske trinn for halsveneinjeksjon. (A) Mus på en vektskala. (B) Oppsett av induksjonssystem for gnagerbedøvelse. Ulike deler av induksjonssystemet er indikert. (VG Nett) Bilder av en isofluranbedøvet mus i et induksjonskammer. (E) Pels fjernet kirurgisk sone. (F) En mus plassert på en injeksjonsplattform og pustet 1,5 % isofluran gjennom en nesekjegle fra en fordamper. (G) Hudsnitt for halsvenetilnærming. (H) Kirurgisk disseksjon av høyre vena jugularis eksterna. (I) Avbildning med høyere forstørrelse som viser den isolerte høyre vena jugularis. Legg merke til et hvitt papir under fartøyet, slik at venen blir mer synlig. (J-K) Høyre jugularvenenålinnsetting med skråningen opp. (L) Injeksjon av en forbindelse med blåaktig fargestoff i halsvenen. (M) Trykk på injeksjonsstedet ved hjelp av en bomullspinne etter at kanylen er trukket ut. (N) Suturering av såret med en 5-0 sutur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Kateterkalibrering. (A) Bløtlegging av 1.0 F kateterspiss i 37 °C forvarmet PBS. (B) Avstandsmarkeringer på kateteret for å estimere dybden av innsetting av kateteret i den stigende aorta og høyre ventrikkel. (C) Blodtrykksmåleutstyr som gjennomgår en null baseline kalibrering. (Ca') Skjermbilde av programvarebasert kateterbaselinjeanalyse for blodtrykksanalyse. (D) Under rullegardinmenyen Kanal 1 velger du dialogboksen Enhetskonvertering i programvaren for blodtrykksanalyse. (E) Angi standard enhetskonverteringsverdier for å konvertere inngangsspenningssignalet til mmHg-enhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5 Kirurgiske prosedyrer for systemisk blodtrykksmåling (SBP). (A) Et midtlinjesnitt fra kjeven til brystbenet på nakkehuden. (B) Separasjon av spyttkjertelen for å eksponere luftrøret. (C) Eksponert høyre halspulsåre og høyre vena jugularis eksterna etter vevsdisseksjon. (D) En isolert 5 mm seksjon av halspulsåren. (E,F) Sutur permanent knute ved kranialekstremiteten og to løse knuter i haleekstremiteten. (G,H) Å lage et lite hull (X-) på halspulsåren bare kaudalt til den permanente knuten (# 1). (I) Innsetting av kateteret i halspulsåren. (J) Sikring av kateteret med en midtre suturknute (# 3). (K,L) Slipp forsiktig den første løse knuten (# 2). (M) Representative arterielle trykkbølger. (N) Løsne den midterste suturknuten (# 3). (O,P) Stramme den midterste suturknuten (# 3) rundt fartøyet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6 Kirurgiske prosedyrer for måling av systolisk trykk i høyre ventrikkel (RVSP). (A) Ligering av de små grenene i høyre vena jugularis (blå pilspisser). (B) En permanent knute (# 1) på kranialenden av halsvenen. (C) En løs knute (# 2) på den kaudale enden av halsvenen. (D) Å lage et lite hull på høyre halsvene kaudalt til den permanente knuten (# 1). (E) Innsetting av et kateter i vena jugularis gjennom et lite hull (X-merke). (F) Stram den kaudale knuten (# 2) rundt kateteret og karet. (G) Skyve kateteret inn i høyre ventrikkel i hjertet. (H) Representant RVSP. (I) Stramme den kaudale knuten (# 2) rundt fartøyet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Dataanalyse av programvare for blodtrykksanalyse etter registrering. (A) Bruke bølgeformmarkør til å måle trykkamplitude fra programvaredata for rå blodtrykksanalyse i kanal 1. (B) Trekke ut interesseområdet fra databildet for rå blodtrykksanalyseprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8 Hemodynamisk bølgeformovergang ved høyre ventrikkelkateterisering. (A-D) Representative spor av trykkforandringer under høyre ventrikkelkateterisering av en C57BL/6-mus fra mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Blodtrykksanalyse, representasjonstall og dataanalyse. (A) Representative SBP- og RVSP-kurver i normoksi, hypoksi og hypoksi + 7C1 / let-7 miRNA-behandlede mus. (B) Sammendragsplott av SBP og RVSP i normoksi, hypoksi og hypoksi + 7C1 / let-7 miRNA-behandlede mus (NS: ikke signifikant; **p < 0,01; ***p < 0,001; uparret tosidig Student t-test). N = 10 per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Flere dyremodeller av pulmonal hypertensjon er etablert for å etterligne de forhøyede pulmonale vaskulære resistenshendelsene hos mennesker. Blant dem har musehypoksi-indusert PAH-modell blitt mye brukt for å evaluere effektiviteten av nye eksperimentelle terapier for PAH. Forskning ved hjelp av denne modellen krever ofte administrering av forbindelser til musene. Sammenlignet med andre publiserte intravenøse (IV) injeksjoner og invasive hemodynamiske vurderingsprotokoller, gir denne metoden både visuell illustrasjon og detaljert beskrivelse.

Det er tre kritiske trinn for vellykket gjennomføring av prosedyren og for å oppnå nøyaktige og reproduserbare blodtrykksmålinger. Forsikre deg først om at sprøytenålen er riktig plassert i halsvenen. Feil injeksjon av vena jugularis kan føre til subkutan injeksjon. For det andre, sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi. Konsistent bedøvelsesdybde i hver mus er viktig for generering av data som er sammenlignbare mellom grupper. For dyp anestesi kan føre til en betydelig reduksjon i blodtrykksnivået. I tillegg til isofluran inhalasjonsanestesi, er intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin en annen mye brukt bedøvelsesmetode for musekirurgi. Begge metodene har fordeler og ulemper. Den isofluran inhalasjon anestesi har flere fordeler over injiserbare ketamin / xylazin, inkludert rask innsettende, ingen kontrollerte legemidler, rask utvinning, og er mye lettere å kontrollere dybden av anestesi. Ulempene er kostnaden for utstyret, ubehagelig lukt og menneskelig eksponering for anestetiske avfallsgasser. For det tredje, sørg for at kateteret er inne i høyre hjertekammer. Langvarige eller flere mislykkede forsøk på høyre ventrikkelkateterisering kan forårsake falske blodtrykksavlesninger.

IV-injeksjon hos mus administreres hovedsakelig via laterale haleårer. Selv om denne ruten er lett å nå med nåler, er det noen ganger vanskelig å utføre flere i.v. bolusdoser. De to store utfordringene ved å utføre denne teknikken er variasjonen i venedybde og vanskeligheten med nålvisualisering på grunn av mus, halehudfarge og hudhardhet. Enda viktigere, det er ingen måte å bekrefte om hele innholdet i injeksjonen har kommet inn i blodet og ikke det omkringliggende vevet. Jugularvenen er et foretrukket tilgangssted fordi (1) den er klinisk relevant, (2) den gir visuell bekreftelse på tilførsel av injektat til venen, (3) den tillater flere injeksjoner av en gruppe dyr i løpet av forsøket, og (4) denne injeksjonsteknikken er trygg, og prosedyren forårsaker ingen bivirkninger.

Det er tre måter å registrere blodtrykk hos mus: (1) Ikke-invasiv hale-mansjett pletysmografi¹⁰. Systemene muliggjør gjentatte målinger i løpet av en longitudinell studie. (2) Radiotelemetri¹¹. Systemene muliggjør overvåking av blodtrykk i sanntid hos våkne og fritt bevegelige forsøksdyr. (3) Invasive intraarterielle katetre¹². Systemene muliggjør akutte SBP- og RVSP-målinger. I denne protokollen valgte vi et trykkkateter for hi-fidelity systemiske og høyre ventrikkeltrykkmålinger. Denne metoden har imidlertid noen begrensninger. For det første er trykkkateteret og blodtrykksmåleutstyret dyrt (figur 1E-F). For det andre krever det bedøvelse av dyrene, dette medfører reduksjon i blodtrykket. For det tredje er høyre hjertekateterisering en terminal prosedyre som ikke tillater serielle målinger. For det fjerde er prosedyren ikke lett å lære selv av en godt trent mikrokirurg.

Når blodtrykket er registrert, kan etterforskeren isolere hjerter og lunger fra dyrene for histologisk PAH-karakterisering. For eksempel høyre ventrikkelveggtykkelsesmålinger for høyre ventrikulær hypertrofi og muskelisert lungedistal karanalyse for muskel lungearterie remodellering. Dataene viser at 7C1/let-7 miRNA er svært effektivt for å senke pulmonalt blodtrykk, noe som viser effektiviteten av vår multiple IV bolusdosering. I tillegg kan etterforskere isolere lungeendotelceller fra den nylig isolerte hele lungen for å evaluere effektiviteten av injiserte materialer.

Oppsummert gir denne protokollen en trinnvis prosedyre for å utføre flere IV-bolusdoser og invasiv hemodynamisk overvåking i en musehypoksi-indusert PAH-modell. Etterforskere kan bruke jugularveneinjeksjon og arteriell / høyre ventrikkelkateteriseringsteknikker beskrevet her for bredt utvalg av gnagermodeller som krever IV-injeksjon og hemodynamisk overvåking.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 prolene suture pack	Ethicon	8698G	for incision closure
8-0 nylon suture pack	AROSurgical Instruments	T06A08N14-13	for ligation
Anesthesia induction chamber	VETEQUIP	#941444	Holds the animal during anesthesia exposure
Catheter Interface Cable PEC-4D	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000
Charcoal canister filters	VETEQUIP	#931401	to help remove waste anesthetic gases
Cotton swabs	McKesson	24-106	for applying pressure to the injection site to prevent bleeding
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	Surgical tools
Insulin syringe 28 G	EXEL	26027	for jugular vein IV injection
Isoflurane	COVETRUS	#029405	for mouse anesthesia
LabChart 8 Software	ADInstruments		for data analysis
Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F)	Millar		for invasive blood pressure measurement
Needle-25 G	BD	305124	for making a samll hole in a vessel
Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor	BioSpherix	E702	for oxygen concentration monitoring
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35
PowerLab 4/35	ADInstruments		for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation.
Prism 8	GraphPad		for statistics and scientific graphing
Semisealable hypoxia chamber	BioSpherix		an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Surgical tools
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	Surgical tools
VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA	VasoRx, Inc.	Lot# B2-L-16Apr	IV injection compound
VIP 3000 Veterinary Vaporizer	COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC.		for accurate anesthesia delivery