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Medicine

हाइपोक्सिया-प्रेरित माउस फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप मॉडल में एकाधिक अंतःशिरा बोलस खुराक और आक्रामक हेमोडायनामिक मूल्यांकन

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/63839
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4,5, 4
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Vascular Surgery, The First Hospital of China Medical University, Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention, and Therapeutics of Aortic Aneurysm, 3VasoRx Inc., 4Yale Cardiovascular Research Center, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों में कई अंतःशिरा बोलस खुराक प्रशासन और आक्रामक हेमोडायनामिक निगरानी को निष्पादित करने के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। जांचकर्ता फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप के लिए भविष्य के चिकित्सीय यौगिक स्क्रीनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं।

Abstract

पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच) एक प्रगतिशील जीवन-धमकाने वाली बीमारी है, जो मुख्य रूप से फेफड़ों के छोटे फुफ्फुसीय धमनी को प्रभावित करती है। वर्तमान में, पीएएच का कोई इलाज नहीं है। नए यौगिकों की खोज करना महत्वपूर्ण है जिनका उपयोग पीएएच के इलाज के लिए किया जा सकता है। माउस हाइपोक्सिया-प्रेरित पीएएच मॉडल पीएएच अनुसंधान के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। यह मॉडल पीएएच समूह 3 रोग के मानव नैदानिक अभिव्यक्तियों को पुन: व्यवस्थित करता है और पीएएच के लिए नए प्रयोगात्मक उपचारों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण शोध उपकरण है। इस मॉडल का उपयोग कर अनुसंधान अक्सर चूहों में यौगिकों के प्रशासन की आवश्यकता होती है. एक यौगिक के लिए जिसे सीधे रक्तप्रवाह में देने की आवश्यकता होती है, अंतःशिरा (IV) प्रशासन का अनुकूलन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। आदर्श रूप से, IV इंजेक्शन प्रणाली को एक निर्धारित समय पाठ्यक्रम पर कई इंजेक्शन की अनुमति देनी चाहिए। हालांकि माउस हाइपोक्सिया-प्रेरित पीएएच मॉडल कई प्रयोगशालाओं में बहुत लोकप्रिय है, लेकिन इस मॉडल में कई IV बोलस खुराक और आक्रामक हेमोडायनामिक मूल्यांकन करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, हम माउस जुगुलर नस के माध्यम से कई चतुर्थ बोलस खुराक बाहर ले जाने के लिए और माउस हाइपोक्सिया प्रेरित पीएएच मॉडल में हेमोडायनामिक मूल्यांकन के लिए धमनी और सही वेंट्रिकल कैथीटेराइजेशन प्रदर्शन करने के लिए कैसे पर कदम दर कदम निर्देश प्रस्तुत करते हैं.

Introduction

फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच) को आराम 1,2 पर 20 मिमीएचजी से अधिक एक औसत फुफ्फुसीय धमनी सिस्टोलिक दबाव द्वारा परिभाषित किया गया है। यह एक प्रगतिशील और घातक बीमारी है जो फुफ्फुसीय धमनी दबाव में निरंतर ऊंचाई की विशेषता है, जिससे सही वेंट्रिकल अधिभार और अंततः सही वेंट्रिकुलर विफलता के कारण मृत्युहो जाती है। वर्तमान में, पीएएच का कोई इलाज नहीं है।

फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप के पशु मॉडल का उपयोग प्रयोगात्मक पीएएच उपचारों की प्रभावशीलता के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है। उन मॉडलों के बीच, माउस हाइपोक्सिया प्रेरित पीएएच मॉडल मानव पीएएच समूह 3 रोगके विकास 3,4 में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है. इस मॉडल का उपयोग अनुसंधान अक्सर उपन्यास यौगिक की प्रभावशीलता और सुरक्षा का मूल्यांकन करने के लिए चूहों में यौगिकों के प्रशासन की आवश्यकता होती है. इसलिए, जांचकर्ताओं यौगिक खुराक और hemodynamic माप के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रिया की जरूरत है इंजेक्शन स्थिरता और रक्तचाप माप प्रजनन क्षमता शुरू से अंत तक सुनिश्चित करने के लिए.

अंतःशिरा (चतुर्थ) इंजेक्शन और रक्तचाप को मापने के लिए तरीके साहित्य 5,6 में सूचित किया गया है. हालांकि, कार्यप्रणाली में दृश्य चित्रण और विस्तृत विवरण का अभाव है। यहां हम एक सफल IV बोलस इंजेक्शन और प्रणालीगत और दाएं वेंट्रिकल रक्तचाप के सटीक माप और रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रक्रियाएं पीएएच के लिए उपचार विकसित करने के लिए यौगिक प्रशासन मंच के चतुर्थ मार्ग में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं येल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया गया.

1. जानवरों, उपकरण, रक्तचाप मापने के उपकरण, और हाइपोक्सिया कक्ष की तैयारी

  1. पशु अनुकूलन।
    नोट: इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल प्रायोगिक जानवरों नर थे, 8 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों वजन 25-27 ग्राम. प्रयोग के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या का अनुमान लगाते समय कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए, जिसमें सर्जरी से जुड़ी मृत्यु दर, अप्रत्याशित सर्जिकल जटिलताएं और अचानक अप्रत्याशित मौत शामिल हैं। सांख्यिकीय शक्ति तक पहुँचने और कमजोर अध्ययन से बचने के लिए प्रति समूह कम से कम 10 चूहों का प्रयोग करें.
    1. स्वागत करने पर, जानवरों को हवादार कृंतक पिंजरों (प्रति पिंजरे में पांच जानवरों के समूह) में उचित बिस्तर, कृंतक चाउ और पानी प्रदान किया जाता है। जानवरों को कम से कम 3 दिनों के लिए नए वातावरण (18-20 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र) के लिए अभ्यस्त होने दें।
    2. बेतरतीब ढंग से उन्हें निम्नलिखित समूहों को असाइन करें: नॉर्मोक्सिया (समूह 1), हाइपोक्सिया (समूह 2), और हाइपोक्सिया + 7C1/let-7 miRNA (समूह 3)।
  2. सर्जिकल उपकरण और रक्तचाप मापने के उपकरण तैयार करना।
    1. आटोक्लेविंग (चित्रा 1 ए) द्वारा सभी सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज़ करें।
    2. एक घर का बना संज्ञापन नाक शंकु (चित्रा 1 बी), सिवनी पैक(चित्रा 1सी), और पीएएच प्रक्रिया(चित्रा 1डी-एफ)के लिए उपकरण के साथ एक अस्थायी इंजेक्शन मंच तैयार करें।
  3. फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच) प्रेरण के लिए प्रायोगिक सेटिंग।
    1. एन2 टैंक, ऑक्सीजन सेंसर, और अर्ध-सील हाइपोक्सिया कक्ष(चित्रा 2ए)सेट करें।
    2. ऑक्सीजन सेंसर में 10% ओ2 का एक सेट बिंदु स्थापित करें और सिस्टम को स्थिर-अवस्था (चित्रा 2बी, सी) तक पहुंचने दें।
    3. हाइपोक्सिया (समूह 2) और हाइपोक्सिया + 7C1/let-7 miRNA (समूह 3) 3 सप्ताह के लिए हाइपोक्सिया (10% हे2) में जानवरों रखें. हाइपोक्सिया के 3 सप्ताह के बाद, जानवरों को 1 सप्ताह(चित्रा 2डी)के लिए नॉर्मोक्सिक परिस्थितियों में रखें। नॉर्मॉक्सिक समूह (समूह 1) 4 सप्ताह तक नॉर्मोक्सिया में रहता है।
      नोट: (1) हाइपोक्सिया के 3 सप्ताह के बाद नॉर्मोक्सिया के 1 सप्ताह पीएएच और सही वेंट्रिकल दिलकी विफलता 7 के विकास के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। ऑक्सीजन सेंसर अर्ध-सील करने योग्य हाइपोक्सिया कक्ष के अंदर ओ2 एकाग्रता का पता लगाता है और गैस जलसेक ट्यूब के माध्यम से एन2 गैस को संक्रमित करके इसे ठीक करता है।
    4. प्रयोग की पूरी अवधि (3 सप्ताह) के लिए दैनिक जानवरों का निरीक्षण करें। एक पशुचिकित्सा से परामर्श करें यदि जानवर नाटकीय वजन घटाने और सांस लेने में कठिनाई जैसे संकट के लक्षण प्रदर्शित करते हैं। यदि गंभीर संकट में जानवरों के लिए इच्छामृत्यु आवश्यक है, तो पशु को अध्ययन से बाहर करें।
      नोट: हाइपोक्सिया एक्सपोजर माउस शरीर के वजन घटाने का कारण बनता है। 10% शरीर के वजन का नुकसान आमतौर पर पीएएच विकास के विश्वसनीय संकेत के रूप में उपयोग किया जाता है।
    5. हाइपोक्सिया कक्ष के व्यापक उद्घाटन से बचें. पिंजरे की सफाई, भोजन की भरपाई, पानी की बोतलें बदलने और यौगिक प्रशासन के लिए, प्रति सप्ताह 1 घंटे से अधिक नहीं के लिए कक्षों को खोलें।

2. गले की नस के माध्यम से अंतःशिरा बोलस इंजेक्शन

  1. माउस तैयारी और संज्ञाहरण.
    1. हाइपोक्सिया (समूह 2) और हाइपोक्सिया + 7C1/let-7 miRNA (समूह 3) माउस पिंजरों को हाइपोक्सिया कक्ष से बाहर निकालें और धीरे से पिंजरे से जानवर को हटा दें।
      नोट: 7C1/let-7 miRNA (1.5 मिलीग्राम/किग्रा IV/खुराक) के लिए खुराक आहार उपचार के 4 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह दो बार है। यह अनुशंसा की जाती है कि जांचकर्ता हाइपोक्सिया और हाइपोक्सिया + यौगिक उपचार पिंजरों दोनों को चतुर्थ इंजेक्शन के दौरान हाइपोक्सिया कक्ष से बाहर ले जाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी जानवरों को प्रति समय अंतराल हाइपोक्सिया एक्सपोजर का समान परिमाण प्राप्त हो।
    2. एक सटीक पैमाने का उपयोग माउस तौलना और अपने वजन (चित्रा 3 ए) रिकॉर्ड.
    3. माउस को संवेदनाहारी वेपोराइज़र से जुड़े संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में रखें और इसे बंद करें (चित्र 3बी)। थर्मल समर्थन प्रदान करें और संवेदनाहारी करते समय सूखने से रोकने के लिए दोनों आंखों पर आंख स्नेहक लागू करें। बेहोश होने तक माउस को 3% आइसोफ्लुरेन तक बेनकाब करें (चित्र 3सी-डी)।
    4. कक्ष से माउस निकालें और जबड़े से फर दाढ़ी उरोस्थि के बीच में दुम से. बाद में, जबड़े के कोण से फर दाढ़ी, गर्दन के किनारों के माध्यम से, और कंधों की ओर (चित्रा 3E).
    5. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे एक इंजेक्शन मंच पर एक लापरवाह स्थिति (पेट की ओर चेहरा ऊपर) में isoflurane-संवेदनाहारी माउस रखें. 1.5% आइसोफ्लुरेन के साथ नाक शंकु के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखें और धीरे-धीरे शरीर को स्थिर करने के लिए चिपकने वाली टेप के साथ चार पैरों को रोकें (चित्र 3एफ)।
    6. संज्ञाहरण के पर्याप्त स्तर को सुनिश्चित करने के लिए सीधे संदंश के साथ एक हानिकारक उत्तेजना (यानी, पैर की अंगुली चुटकी) लागू करें। संवेदनाहारी माउस से पहले और शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान उत्तेजना का जवाब नहीं देना चाहिए.
  2. इंजेक्शन एजेंट की तैयारी।
    1. बाँझ परिस्थितियों में 1.5 मिलीग्राम/किग्रा की खुराक पर एकल-खुराक इंजेक्शन यौगिक तैयार करें।
      नोट: इंजेक्शन यौगिक को कमरे के तापमान (आरटी) तक गर्म करें क्योंकि ठंडे पदार्थों के इंजेक्शन से असुविधा हो सकती है और माउस शरीर के तापमान में गिरावट हो सकती है (यदि यह यौगिक को नुकसान नहीं पहुंचाता है)। इष्टतम खुराक और यौगिक 7C1/let-7 miRNA इस अध्ययन में इस्तेमाल की अवधि पिछले प्रकाशनों 8,9 पर आधारित हैं.
    2. मात्रा इंजेक्शन किया जा करने के साथ बाँझ एकल उपयोग सिरिंज लोड. सिरिंज को सीधा पकड़ें और सिरिंज से हवा को बाहर निकालने के लिए सवार को आगे बढ़ाएं। सिरिंज का पुन: उपयोग न करें।
    3. जानवरों पर हेमोडायल्यूशन और असामान्य हृदय प्रभाव की घटनाओं को कम करने के लिए इंजेक्शन की मात्रा को 25 ग्राम माउस में 200 माइक्रोन तक सीमित करें। यदि एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है, तो इंजेक्शन यौगिक को 10 मिनट के अंतराल के साथ दो इंजेक्शन में विभाजित करें।
  3. चतुर्थ इंजेक्शन के लिए माउस तैयार करें.
    1. धीरे पोविडोन-आयोडीन समाधान और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक दौर के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को तीन बार साफ़ करें। शल्य चिकित्सा प्रक्रिया से 30 मिनट पहले ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम/किग्रा, वर्ग) का प्रशासन करें।
    2. एक स्केलपेल ब्लेड(चित्रा 3जी)का उपयोग करके गर्दन की मिडलाइन के दाईं ओर थोड़ा 0.5 सेमी अनुदैर्ध्य कटौती करें।
    3. सही बाहरी जुगुलर नस (चित्रा 3एच) का पता लगाने के लिए मांसपेशियों और वसा ऊतकों को अलग करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
      नोट: निशान गठन से बचने के लिए हर बार इंजेक्शन साइटों को घुमाएं।
    4. इंजेक्शन क्षेत्र (चित्रा 3 आई) के आसान दृश्य की अनुमति देने के लिए एक उच्च शक्ति उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।
  4. IV इंजेक्शन
    1. सुई बेवल का सामना करना पड़ (चित्रा 3 जे, कश्मीर) के साथ जुगुलर नस में एक 28 जी बाँझ सुई डालें.
      नोट: पूंछ नस इंजेक्शन जुगुलर नस इंजेक्शन का एक विकल्प है। हालांकि, नस की गहराई, चूहों की पूंछ की त्वचा के रंग और त्वचा की कठोरता में परिवर्तनशीलता के कारण इस तकनीक को दोहराना मुश्किल है।
    2. धीरे-धीरे नस में यौगिक इंजेक्ट करने के लिए सिरिंज सवार दबाएँ. सुई को इंजेक्टेंट के बैकफ्लो को रोकने के लिए अतिरिक्त 10 एस के लिए नस के भीतर रहने दें(चित्र 3एल)।
      नोट: नीली डाई इंजेक्शन के आसान दृश्य के लिए अनुमति देता है। परीक्षण सामग्री इंजेक्ट करते समय डाई शामिल न करें। एक गलत इंजेक्शन के परिणामस्वरूप IV इंजेक्शन साइट के आसपास नीली डाई का संचय होगा।
    3. सुई निकालें और रक्तस्राव को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट पर दबाव लागू करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें(चित्रा 3एम)।
    4. 5-0 सिवनी (चित्रा 3 एन) के साथ त्वचा सीवन. सर्जरी के बाद, जानवर को गर्म, स्वच्छ, शुष्क क्षेत्र में ले जाएं और मेलॉक्सिकैम (1 मिलीग्राम/किग्रा, वर्ग, क्यू 24 एच) प्रदान करें। कोई बिस्तर लेकिन नीचे एक कागज तौलिया में कवर के साथ एक साफ वसूली पिंजरे में पशु रखें.
      नोट: माउस संज्ञाहरण से जाग जाना चाहिए और वसूली पिंजरे में एक बार वापस 5 मिनट के भीतर चेतना हासिल करना चाहिए. संकट के संकेत के लिए माउस की निगरानी.
    5. जानवरों को उनके घर पिंजरे में लौटाएं और माउस पिंजरे को हाइपोक्सिया कक्ष में वापस रख दें।
      नोट: पूरी प्रक्रिया, एक माउस संवेदनाहारी से जुगुलर नस इंजेक्शन खत्म करने के लिए, एक एकल प्रयोगकर्ता द्वारा लगभग 10-15 मिनट लगते हैं। चूहों में normoxia जोखिम को कम करने के लिए, यह सिफारिश की है कि कम से कम दो जांचकर्ताओं एक जुगुलर नस इंजेक्शन प्रक्रिया को पूरा करने के लिए सहयोग.

3. रक्तचाप माप

  1. रक्तचाप मापने के लिए उपकरण तैयार करें।
    1. हेमोडायनामिक माप(चित्रा 4ए)से पहले कम से कम 30 मिनट पहले 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व-गर्म पीबीएस में 1.0 एफ कैथेटर की नोक भिगोएँ।
    2. वांछित कैथेटर टिप स्थान के लिए कैथेटर प्रविष्टि साइट से दूरी को मापें. उदाहरण के लिए, गर्दन के मध्य करने के लिए महाधमनी आरोही माउस के बीच की दूरी लगभग 1-1.2 सेमी है. हृदय के दाहिने वेंट्रिकल से गर्दन के मध्य के बीच की दूरी लगभग 2.3-2.8 सेमी है।
    3. सम्मिलन गहराई (चित्रा 4 बी) का एक दृश्य संकेत प्रदान करने के लिए दो कैथेटर दूरी चिह्नों को चिह्नित करें।
    4. दबाव ट्रांसड्यूसर के लिए कैथेटर संलग्न करें, डेटा अधिग्रहण डिवाइस पर इनपुट चैनल 1 के लिए दबाव ट्रांसड्यूसर कनेक्ट करें, दबाव-मात्रा नियंत्रण इकाई चालू करें, और डेटा अधिग्रहण रक्तचाप विश्लेषण सॉफ्टवेयर शुरू करें। एक नया रक्तचाप विश्लेषण दस्तावेज़ बनाएं और दबाव के लिए चैनल 1 सेट करें।
    5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक दबाव अंशांकन प्रदर्शन. पूरे सेटअप को कम से कम 5 मिनट(चित्रा 4सी)के लिए स्थिर करने की अनुमति दें।
    6. रक्तचाप विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, चैनल 1 ड्रॉपडाउन मेनू (चित्रा 4 डी, लाल तीर) से इकाइयों रूपांतरण का चयन करें।
    7. डिफ़ॉल्ट इकाइयों रूपांतरण मान (चित्रा 4E) सेट करें।
      नोट: रक्तचाप को पारा (mmHg) के मिलीमीटर के रूप में दर्शाया जाता है। दबाव नियंत्रण इकाई से मानकीकृत दबाव उत्पादन 1 वी प्रति 100 मिमीएचजी है। 25 mmHg 0.25 V आउटपुट शी संबंधित आहे आणि 100 mm Hg 1 V आउटपुटशी संबंधित आहे.
  2. रक्तचाप माप प्रक्रिया के लिए माउस तैयार करें.
    1. एक नाक शंकु के माध्यम से 3% isoflurane साँस लेना के साथ माउस एनेस्थेटाइज.
    2. सूखापन को रोकने के लिए माउस आंखों की नेत्र सतह पर सीधे पशु चिकित्सा मरहम लागू करें, क्योंकि माउस संज्ञाहरण के तहत अपनी आँखें बंद नहीं कर सकता है। संज्ञाहरण के तहत माउस की गर्दन से फर दाढ़ी.
    3. पोविडोन-आयोडीन समाधान और 70% इथेनॉल झाड़ू के तीन वैकल्पिक दौर के साथ मुंडा क्षेत्र को साफ़ करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे एक इंजेक्शन मंच पर एक लापरवाह स्थिति में संवेदनाहारी माउस रखें. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण (1.5% isoflurane) बनाए रखने के लिए नाक शंकु में माउस की नाक रखें.
    4. हानिकारक उत्तेजना के लिए संवेदनाहारी माउस की मोटर प्रतिक्रिया का परीक्षण करें। संवेदनाहारी माउस सर्जरी से पहले और दौरान एक हानिकारक उत्तेजना का जवाब नहीं देना चाहिए.
      नोट: इनहेलेबल (आइसोफ्लुरेन) और इंजेक्टेबल (केटामाइन / ज़ाइलाज़िन) एनेस्थेटिक्स रक्तचाप को कम कर सकते हैं। सामान्य तौर पर, आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन एनेस्थीसिया का केटामाइन / ज़ाइलाज़िन की तुलना में रक्तचाप को कम करने पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है। इसलिए, आइसोफ्लुरेन केटामाइन/ज़ाइलाज़ीन पर पसंदीदा इनहेलेंट एनेस्थेटिक है। संज्ञाहरण की उचित गहराई को प्राप्त करना सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हेमोडायनामिक माप के लिए महत्वपूर्ण है। अन्वेषक प्रत्येक माउस के लिए संज्ञाहरण की गहराई स्थिर रखने की जरूरत है.
  3. आरोही महाधमनी कैथीटेराइजेशन
    1. संज्ञाहरण के पर्याप्त स्तर को सुनिश्चित करने के लिए सीधे संदंश के साथ एक हानिकारक उत्तेजना (यानी, पैर की अंगुली चुटकी) लागू करें। जबड़ा से उरोस्थि (चित्रा 5 ए) तक त्वचा का एक मिडलाइन चीरा बनाओ।
    2. लार ग्रंथियों को अलग करें और श्वासनली (चित्रा 5बी)का पर्दाफाश करें।
    3. सही मन्या धमनी और सही बाहरी जुगुलर नस (चित्रा 5 सी) का पर्दाफाश करने के लिए जहाजों के साथ नरम ऊतक को साफ करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
    4. कैरोटिड धमनी में हेरफेर करते समय वासोस्पास्म के विकास को धीमा करने के लिए गुहा में पीबीएस के 0.5 एमएल डालें।
    5. ध्यान से सही मन्या धमनी का एक 5 मिमी खंड अलग. धमनी को अधिक दृश्यमान बनाने के लिए पृष्ठभूमि के रूप में पोत के नीचे बाँझ सफेद कागज का एक टुकड़ा रखें(चित्र 5डी)।
      नोट: ध्यान से धमनी से वेगस तंत्रिका (सफेद) अलग और कटौती या तंत्रिका या धमनी को नुकसान नहीं सुनिश्चित करें.
    6. 8-0 का उपयोग करना सिवनी पोत (चित्रा 5E) के कपाल अंत बंद करने के लिए एक स्थायी गाँठ (#1) टाई.
    7. महाधमनी से रक्त के प्रवाह को अस्थायी रूप से रोकने के लिए पहली ढीली गाँठ (#2) बाँधें। फिर, पहले दो टांके (चित्रा 5 एफ) के बीच एक दूसरी ढीली गाँठ (#3) बाँधें। दूसरी ढीली गाँठ (#3) जल्दी से नियुक्ति के बाद कैथेटर सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    8. 25 जी सुई का उपयोग करके, एक छोटा छेद बनाएं, जो कैथेटर को पारित करने के लिए काफी बड़ा हो, #3 और #1 संयुक्ताक्षर(चित्रा 5जी)के बीच पोत के अनुरूप हो।
      नोट: कैरोटिड धमनियां हृदय से ऑक्सीजन युक्त रक्त ले जाती हैं और बहुत अधिक दबाव डालती हैं। यदि कैरोटिड धमनी कट जाती है, तो उस दबाव से रक्त बाहर निकल जाएगा (चित्र 5H)।
    9. टिप से कैथेटर 1.5 इंच पकड़ो और धीरे धमनी (एक्स निशान) के छेद के माध्यम से कैथेटर की नोक डालना. कैथेटर और पोत के चारों ओर मध्य सिवनी नोड (#2) को कस लें जो अभी भी कैथेटर(चित्रा 5I-J)के पारित होने की अनुमति देता है।
      नोट: इस कदम अभ्यास की आवश्यकता है। इस कदम के साथ संभावित जटिलताओं कैथेटर प्रविष्टि साइट और vasospasm. पर खून बह रहा शामिल. जब रक्तस्राव होता है, तो रक्तस्राव धमनी से रक्त की हानि रक्त की मात्रा को कम कर देती है, जिससे प्रणालीगत रक्तचाप में गंभीर गिरावट आती है। गंभीरता के कारण, जानवर एक मानवीय समापन बिंदु पर पहुंच गया है और उसे इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। यंत्रवत् प्रेरित वासोस्पास्म के लिए, यह आमतौर पर रक्त वाहिकाओं के लगातार संकुचन के कारण कैथेटर सम्मिलन के दौरान होता है। यह रक्त वाहिका को छोटा खोलता है और कैरोटिड धमनी में कैथेटर की उन्नति को रोकता है। कैथेटर अग्रिम करने के लिए प्रतिरोध के खिलाफ अत्यधिक बल का प्रयोग न करें. जब मध्यम या गंभीर वासोस्पास्म प्रतिरोध का सामना करना पड़ता है, तो थोड़ी देर में फिर से प्रयास करें या एक छोटे कैथेटर (जैसे, 1.0 एफ) का उपयोग करें। अनुभवी माइक्रोसर्जन आरोही महाधमनी कैथीटेराइजेशन के लिए 100% सफलता दर प्राप्त कर सकते हैं।
    10. कैथेटर सेंसर टिप के साथ पहली ढीली गाँठ (#2) गुजरता है के बाद, कैथेटर सुरक्षित करने के लिए दूसरी ढीली गाँठ (#3) अधिक कसकर जकड़ना और धीरे पहली ढीली गाँठ (#2) (चित्रा 5K, एल) जारी करें।
    11. कैथेटर(चित्रा 4बी)पर निशान के अनुसार आरोही महाधमनी की ओर कैथेटर डालना जारी रखें जब तक कि दबाव विश्लेषण एक धमनी रक्तचाप प्रोफाइल(चित्रा 5एम)दिखाता है। डेटा अधिग्रहण प्रणाली और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रणालीगत रक्तचाप (एसबीपी) डेटा रिकॉर्ड करें।
    12. कैथेटर को बाहर निकालने की अनुमति देने के लिए मध्य सिवनी नोड (#3) को ढीला करें (चित्र 5N)।
    13. कैरोटिड धमनी (चित्रा 5O-P) से कैथेटर खींचने से पहले पोत के चारों ओर मध्य सिवनी नोड (#3) टाई।
    14. पीबीएस में कैथेटर रखें.
  4. सही दिल कैथीटेराइजेशन।
    1. ध्यान से आसपास के संयोजी ऊतक से सही बाहरी गले नस को अलग और 8-0 के साथ सभी छोटी शाखाओं ligate सिवनी (नीले तीर) (चित्रा 6 ए)।
      नोट: सही दिल कैथीटेराइजेशन के लिए, दिल आमतौर पर सही जुगुलर नस के माध्यम से पहुँचा जाता है।
    2. 8-0 का उपयोग करना सिवनी, पोत के कपाल अंत को बंद करने के लिए एक स्थायी गाँठ (#1) बाँधें (चित्र 6ख)। फिर, पोत (चित्रा 6C) के दुम के अंत पर एक ढीली गाँठ (#2) बाँधें।
    3. स्थायी गाँठ (#1) (चित्रा 6 डी) के लिए एक छोटा छेद समीपस्थ बनाने के लिए 25 जी सुई का उपयोग करें।
      नोट: जुगुलर नसें ऑक्सीजन रहित रक्त को हृदय तक ले जाती हैं और कम दबाव डालती हैं। यदि गले की नस काट दी जाती है, तो रक्त बाहर नहीं निकलेगा (चित्र 6डी, ई)।
    4. कैथेटर पकड़ो और नस (एक्स-मार्क)(चित्रा 6ई)के कट में कैथेटर डालें और कैथेटर और पोत(चित्रा 6एफ)के चारों ओर दुम गाँठ (#2) कस लें।
    5. धीरे-धीरे और धीरे कैथेटर को दाहिने दिल में धकेलें। कैथेटर मार्क (चित्रा 4 बी) के आधार पर कैथेटर टिप गहराई की निगरानी करें।
      नोट: बंद छाती चूहों में सही वेंट्रिकुलर सिस्टोलिक दबाव (आरवीएसपी) का आकलन जटिल आरवी शरीर रचना विज्ञान और संरचना के कारण एक चुनौती है। इस कदम के लिए उच्च स्तर की विशेषज्ञता और बहुत सारे अभ्यास की आवश्यकता होती है। एक अनुभवी माइक्रोसर्जन के हाथों में, सही वेंट्रिकल कैथीटेराइजेशन के लिए सफल दर 90% तक पहुंच सकती है।
    6. सॉफ्टवेयर में दबाव लहर अनुरेखण के अनुसार कैथेटर टिप स्थिति का आकलन करें। जब कैथेटर की नोक सही वेंट्रिकल में होती है, तो मॉनिटर एक विशिष्ट आरवीएसपी ट्रेसिंग(चित्रा 6जी,एच)दिखाएगा।
      नोट: जब फुफ्फुसीय दबाव घटता का आकार atypical (जैसे, नुकीला घटता) दिखता है, तो इसका मतलब कैथेटर की गलत स्थिति है। धीरे कैथेटर एक छोटा सा वापस खींच द्वारा कैथेटर स्थिति को समायोजित करें, और फिर धीरे-धीरे सही वेंट्रिकल के भीतर एक और अधिक केंद्रीय स्थिति के लिए कैथेटर को आगे. अनुसंधान डेटा में कलाकृतियों की पीढ़ी से बचने के लिए, अन्वेषक सही वेंट्रिकल कैथीटेराइजेशन पर लंबे समय तक (1 मिनट से अधिक नहीं) या दोहराया प्रयास (नहीं दो से अधिक प्रयास) से बचना चाहिए.
    7. कैथेटर स्थिर रखें और 5 मिनट के लिए डेटा एकत्र.
    8. रिकॉर्डिंग पूरा होने के बाद, ध्यान से कैथेटर बाहर खींच और पोत (चित्रा 6I) के आसपास दुम गाँठ (#2) टाई. कैथेटर वापस पीबीएस समाधान में रखें.
      नोट: प्रयोग के पूरा होने के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1% पाचन एंजाइम समाधान के साथ कैथेटर को साफ करें। हेमोडायनामिक स्थिति का आकलन करने के अलावा, जांचकर्ता पीएएच हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा के लिए दिल और फेफड़ों की कटाई कर सकते हैं। एकाधिक चतुर्थ बोलस खुराक की प्रभावशीलता सुनिश्चित करने के लिए, जांचकर्ता फेफड़े की एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं और लेट-7 miRNA स्तरों को माप सकते हैं।

4. रक्तचाप डेटा विश्लेषण

  1. रक्तचाप रिकॉर्डिंग की जांच करें।
    1. रक्तचाप विश्लेषण सॉफ्टवेयर डेटा फ़ाइल खोलें (PAH JOVE.adicht)।
    2. चैनल 1 में, दबाव संकेत का प्रतिनिधित्व करने वाले क्षेत्र का चयन करें और दबाव आयाम(चित्रा 7ए)को मापने के लिए पीक (एक्स-मार्क) पर तरंग कर्सर रखें।
    3. दाब तरंग का अधिकतम आयाम ज्ञात कीजिए। यह सिस्टोलिक दबाव (चित्रा 7 ए, लाल तीर) का प्रतिनिधित्व करता है।
    4. Shift + Command + 3 (Mac के लिए) या Windows + Shift + S (Windows PC के लिए) दबाकर छवि से रुचि का क्षेत्र (चित्र 7B ग्रे क्षेत्र) निकालें और इसे ग्राफिक्स फ़ाइल में पेस्ट करें।
  2. रक्तचाप डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण।
    1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में व्यक्तिगत माउस रक्तचाप डेटा दर्ज करें।
    2. दो अध्ययन समूहों (नॉर्मोक्सिया बनाम हाइपोक्सिया; हाइपोक्सिया बनाम हाइपोक्सिया + 7 सी 1 / लेट -7 एमआईआरएनए) के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक अप्रकाशित छात्र का टी-टेस्ट करें। माध्य मानों में अंतर को p < 0.05 के रूप में महत्वपूर्ण मानें।

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Representative Results

एनेस्थीसिया अक्सर रक्तचाप को कम करता है। इसलिए, एक हानिकारक उत्तेजना के जवाब में आंदोलनों को खत्म करने के लिए संज्ञाहरण की एक न्यूनतम खुराक का उपयोग किया गया था। सफल सही वेंट्रिकुलर कक्ष का उपयोग शिरापरक प्रणालियों (चित्रा 8) के विभिन्न क्षेत्रों में हेमोडायनामिक तरंग परिवर्तन के रूप में कल्पना की जा सकती है।

इस अध्ययन में, चूहों को बेतरतीब ढंग से नॉर्मोक्सिक (21% ओ2) समूह (एन = 10), हाइपोक्सिया (10% ओ2) समूह (एन = 10), या हाइपोक्सिया + 7 सी 1 / लेट -7 उपचार समूह (एन = 10) को सौंपा गया था। हाइपोक्सिया-प्रेरित पीएएच विकास के दमन में लेट-7 miRNA के प्रभाव की जांच करने के लिए, तैयार 7C1/let-7 miRNA को C57BL/6 चूहों को अंतःशिरा रूप से 1.5 मिलीग्राम/किग्रा की खुराक पर प्रति सप्ताह दो बार 4 सप्ताह(चित्रा 2डी)के लिए प्रशासित किया गया था।

हाइपोक्सिया या नॉर्मोक्सिया के संपर्क में आने के 4 सप्ताह बाद, एसबीपी और आरवीएसपी को एक बंद-छाती माउस में मापा गया था। चित्रा 9 ए नॉर्मोक्सिक, हाइपोक्सिया, या हाइपोक्सिया + 7 सी 1 / लेट -7 एमआईआरएनए उपचार समूहों से प्रतिनिधि रक्तचाप वक्र दिखाता है। नॉर्मोक्सिया नियंत्रण समूह में उन लोगों की तुलना में, हाइपोक्सिया समूह में आरवीएसपी में काफी वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, हाइपोक्सिया समूह की तुलना में, चूहों में 7सी1/लेट-7 एमआईआरएनए यौगिक के साथ उपचार के परिणामस्वरूप आरवीएसपी(चित्रा 9बी)में काफी कमी आई। एसबीपी किसी भी समूह में नहीं बदला, जो पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है7. 7C1/let-7 miRNA एंडोथेलियल कोशिकाओं को लक्षित करता है और TGFβ सिग्नलिंग कैस्केड8 को कम करता है। आंकड़ों से पता चलता है कि 7C1/let-7 miRNA 1.5 mg/kg सही वेंट्रिकल में रक्तचाप को कम करने में अत्यधिक प्रभावी है, जो कई IV बोलस खुराक की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करता है।

Figure 1
चित्र 1: फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक सर्जिकल उपकरण और रक्तचाप माप उपकरण। (ए) पीएएच प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले सर्जिकल उपकरण। (बी) एक 50 एमएल शंक्वाकार पैकेज से स्टायरोफोम रैक के चारों ओर लिपटे एक शोषक पैड से बना एक अस्थायी इंजेक्शन मंच। प्रकार के साथ नाक शंकु के रूप में इंजेक्शन मंच के लिए एक 10 सेमी लंबाई संज्ञाहरण ट्यूब संज्ञाहरण संज्ञाहरण संलग्न. (सी) सिवनी पैक। चीरा बंद करने के लिए 5-0 सिवनी और 8-0 बंधाव के लिए सिवनी। (डीएफ) पीएएच प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले रक्तचाप माप उपकरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पीएएच प्रेरण के लिए प्रायोगिक सेटिंग। (ए) बायोस्फेरिक्स हाइपोक्सिक सिस्टम की स्थापना की तस्वीर। प्रेरण प्रणाली के विभिन्न भागों का संकेत दिया गया है। (बी-सी) ऑक्सीजन सेंसर हाइपोक्सिया कक्ष ओ2 एकाग्रता की निगरानी। (डी)पीएएच प्रेरण के दौरान सभी पशु समूहों के लिए 7सी1/एलईटी-7 एमआईआरएनए यौगिक उपचार और ऑक्सीजन स्तर के जोखिम के लिए प्रायोगिक समयरेखा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जुगुलर नस इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण शल्य चिकित्सा कदम की तस्वीरें. (ए) एक वजन पैमाने पर माउस. (बी) कृंतक संज्ञाहरण प्रेरण प्रणाली सेटअप। प्रेरण प्रणाली के विभिन्न भागों का संकेत दिया गया है। (सी-डी) एक प्रेरण कक्ष में एक isoflurane-संवेदनाहारी माउस के चित्र. (ई) फर सर्जिकल क्षेत्र को हटा दिया। (एफ)एक माउस एक इंजेक्शन मंच पर रखा और एक vaporizer से एक नाक शंकु के माध्यम से 1.5% isoflurane सांस ली. (छ) जुगुलर नस दृष्टिकोण के लिए त्वचा चीरा। (एच) सही बाहरी जुगुलर नस का सर्जिकल विच्छेदन। (I) पृथक सही जुगुलर नस दिखा उच्च आवर्धन इमेजिंग. पोत के नीचे एक श्वेत पत्र पर ध्यान दें, जिससे नस अधिक दिखाई दे। (जम्मू-कश्मीर) बेवल के साथ सही जुगुलर नस सुई सम्मिलन। (एल) गले की नस में नीले रंग की डाई के साथ एक यौगिक का इंजेक्शन। (एम) सुई वापस लेने के बाद एक कपास झाड़ू का उपयोग कर इंजेक्शन साइट पर दबाव लागू करना। (एन) 5-0 सिवनी के साथ घाव को सीवन करना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कैथेटर अंशांकन। (ए) 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म पीबीएस में 1.0 एफ कैथेटर टिप भिगोना। (बी) आरोही महाधमनी और दाएं वेंट्रिकल में कैथेटर के सम्मिलन की गहराई का अनुमान लगाने में मदद करने के लिए कैथेटर पर दूरी के निशान। (सी) शून्य बेसलाइन अंशांकन से गुजरने वाले रक्तचाप मापने वाले उपकरण। (सीए') रक्तचाप विश्लेषण सॉफ्टवेयर आधारित कैथेटर आधारभूत विश्लेषण का स्क्रीनशॉट. (डी) चैनल 1 ड्रॉपडाउन मेनू के तहत, रक्तचाप विश्लेषण सॉफ्टवेयर में इकाइयों रूपांतरण संवाद का चयन करना। (E) इनपुट वॉल्यूम को बदलने के लिए डिफ़ॉल्ट यूनिट रूपांतरण मान सेट करनाtagई संकेत mmHg इकाई के लिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रणालीगत रक्तचाप (एसबीपी) माप के लिए सर्जिकल प्रक्रियाएं। (ए) गर्दन की त्वचा पर जबड़ा से उरोस्थि तक एक मध्य रेखा चीरा। (बी) श्वासनली को उजागर करने के लिए लार ग्रंथि का पृथक्करण। (सी) ऊतक विच्छेदन के बाद सही कैरोटिड धमनी और सही बाहरी जुगुलर नस को उजागर किया। (डी) कैरोटिड धमनी का एक पृथक 5 मिमी खंड। (ई, एफ) कपाल छोर पर सीवन स्थायी गाँठ और दुम के छोर पर दो ढीली गांठें। (जी, एच) मन्या धमनी पर एक छोटा सा छेद (एक्स निशान) सिर्फ स्थायी गाँठ (#1) के लिए दुम बनाना. (I) कैरोटिड धमनी में कैथेटर का सम्मिलन। (जे) एक मध्य सिवनी गाँठ (#3) के साथ कैथेटर सुरक्षित करना। (कश्मीर, एल) धीरे से पहली ढीली गाँठ (#2) जारी करना। (एम) प्रतिनिधि धमनी दबाव तरंगें। (एन) मध्य सिवनी नोड (#3) को ढीला करना। (ओ, पी) पोत के चारों ओर मध्य सिवनी नोड (#3) कस रहा है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सही वेंट्रिकल सिस्टोलिक दबाव (आरवीएसपी) माप के लिए सर्जिकल प्रक्रियाएं। (ए) सही जुगुलर नस (नीले तीरहेड) की छोटी शाखाओं का बंधाव। (बी) गले की नस के कपाल अंत पर एक स्थायी गाँठ (#1)। (सी) गले की नस के दुम के अंत पर एक ढीली गाँठ (#2)। (डी) स्थायी गाँठ (#1) के लिए दाहिने जुगुलर नस दुम पर एक छोटा छेद बनाना। (ई) एक छोटे से छेद (एक्स निशान) के माध्यम से गले नस में एक कैथेटर की सम्मिलन. (एफ) कैथेटर और पोत के आसपास दुम गाँठ (#2) कस रहा है. (छ) दिल के सही वेंट्रिकल में कैथेटर धक्का. (ज) प्रतिनिधि आरवीएसपी। (I) पोत के चारों ओर दुम नोड (#2) को कसना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: रिकॉर्डिंग के बाद रक्तचाप विश्लेषण सॉफ्टवेयर डेटा विश्लेषण। (ए) चैनल 1 में कच्चे रक्तचाप विश्लेषण सॉफ्टवेयर डेटा से दबाव आयाम को मापने के लिए तरंग कर्सर का उपयोग करना। (बी) कच्चे रक्तचाप विश्लेषण सॉफ्टवेयर डेटा छवि से ब्याज के क्षेत्र को निकालने. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: सही वेंट्रिकल कैथीटेराइजेशन के दौरान हेमोडायनामिक तरंग संक्रमण। (ए-डी) C57BL/6 माउस के माउस दाएं वेंट्रिकल कैथीटेराइजेशन के दौरान दबाव परिवर्तन के प्रतिनिधि निशान। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: रक्तचाप विश्लेषण प्रतिनिधित्व आंकड़े और डेटा विश्लेषण। (ए) प्रतिनिधि एसबीपी और आरवीएसपी घटता नॉर्मोक्सिया, हाइपोक्सिया, और हाइपोक्सिया + 7 सी 1 / लेट -7 एमआईआरएनए ने चूहों का इलाज किया। (बी) नॉर्मोक्सिया, हाइपोक्सिया, और हाइपोक्सिया + 7 सी 1 / लेट -7 एमआईआरएनए इलाज चूहों में एसबीपी और आरवीएसपी के सारांश भूखंडों (एनएस: महत्वपूर्ण नहीं; ** पी < 0.01; *** पी < 0.001; अप्रकाशित दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट)। एन = 10 प्रति समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मानव विषयों में ऊंचा फुफ्फुसीय संवहनी प्रतिरोध घटनाओं की नकल करने के लिए कई फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप पशु मॉडल स्थापित किए गए हैं। उनमें से, माउस हाइपोक्सिया-प्रेरित पीएएच मॉडल का व्यापक रूप से पीएएच के लिए नए प्रयोगात्मक उपचारों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया है। इस मॉडल का उपयोग कर अनुसंधान अक्सर चूहों को यौगिकों के प्रशासन की आवश्यकता होती है. अन्य प्रकाशित अंतःशिरा (चतुर्थ) इंजेक्शन और आक्रामक हेमोडायनामिक मूल्यांकन प्रोटोकॉल की तुलना में, यह विधि दृश्य चित्रण और विस्तृत विवरण दोनों प्रदान करती है।

प्रक्रिया के सफल निष्पादन के लिए और सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रक्तचाप माप प्राप्त करने के लिए तीन महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि सिरिंज सुई सही ढंग से गले नस में तैनात है. गलत जुगुलर नस इंजेक्शन के परिणामस्वरूप चमड़े के नीचे इंजेक्शन हो सकता है। दूसरा, संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करें। प्रत्येक माउस में लगातार संवेदनाहारी गहराई डेटा की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है जो समूहों के बीच तुलनीय हैं। बहुत गहरी संज्ञाहरण रक्तचाप के स्तर में उल्लेखनीय कमी का कारण बन सकता है। आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन एनेस्थीसिया के अलावा, केटामाइन/ज़ाइलज़ीन का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन माउस सर्जरी के लिए एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला संवेदनाहारी तरीका है। दोनों विधियों के फायदे और नुकसान हैं। आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन एनेस्थीसिया के इंजेक्शन योग्य केटामाइन/ज़ाइलाज़ीन पर कई फायदे हैं, जिसमें त्वरित शुरुआत, कोई नियंत्रित दवा नहीं, तेजी से वसूली शामिल है, और संज्ञाहरण की गहराई को नियंत्रित करना बहुत आसान है। नुकसान उपकरण की लागत, अप्रिय गंध, और अपशिष्ट संवेदनाहारी गैसों के लिए मानव जोखिम हैं। तीसरा, सुनिश्चित करें कि कैथेटर दिल के दाहिने वेंट्रिकल के अंदर है। सही वेंट्रिकल कैथीटेराइजेशन पर लंबे समय तक या कई असफल प्रयास झूठे रक्तचाप रीडिंग का कारण बन सकते हैं।

चूहों में चतुर्थ इंजेक्शन मुख्य रूप से पार्श्व पूंछ नसों के माध्यम से प्रशासित है. जबकि इस मार्ग को सुइयों के साथ पहुंचना आसान है, इस तकनीक को कभी-कभी कई IV बोलस खुराक करना मुश्किल होता है। इस तकनीक को करने में दो प्रमुख चुनौतियां नसों की गहराई में परिवर्तनशीलता और चूहों की पूंछ, त्वचा के रंग और त्वचा की कठोरता के कारण सुई दृश्य की कठिनाई हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह पुष्टि करने का कोई तरीका नहीं है कि इंजेक्शन की पूरी सामग्री सफलतापूर्वक रक्तप्रवाह में प्रवेश कर गई है और आसपास के ऊतकों में नहीं। जुगुलर नस एक पसंदीदा पहुंच साइट है क्योंकि (1) यह चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक है, (2) यह नस को इंजेक्शन के वितरण की दृश्य पुष्टि प्रदान करता है, (3) यह प्रयोग के दौरान जानवरों के समूह के कई इंजेक्शन की अनुमति देता है, और (4) यह इंजेक्शन तकनीक सुरक्षित है, और प्रक्रिया किसी भी दुष्प्रभाव का कारण नहीं बनती है।

चूहों में रक्तचाप रिकॉर्ड करने के तीन तरीके हैं: (1) गैर-इनवेसिव पूंछ-कफ प्लेथिस्मोग्राफी10. सिस्टम एक अनुदैर्ध्य अध्ययन के दौरान बार-बार माप को सक्षम करते हैं। (2) रेडियो टेलीमेट्री11. सिस्टम जागृत और स्वतंत्र रूप से चलती प्रयोगशाला जानवरों में वास्तविक समय रक्तचाप की निगरानी को सक्षम करते हैं। (3) आक्रामक इंट्रा-धमनी कैथेटर12. सिस्टम तीव्र एसबीपी और आरवीएसपी माप सक्षम करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम उच्च निष्ठा प्रणालीगत और सही वेंट्रिकल दबाव माप के लिए एक दबाव कैथेटर चुना. हालाँकि, इस विधि की कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, दबाव कैथेटर और रक्तचाप मापने के उपकरण महंगे हैं (चित्रा 1ई-एफ)। दूसरा, इसे जानवरों को एनेस्थेटाइज़ करने की आवश्यकता होती है, इससे रक्तचाप में कमी आती है। तीसरा, सही हृदय कैथीटेराइजेशन एक टर्मिनल प्रक्रिया है जो धारावाहिक माप की अनुमति नहीं देती है। चौथा, एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित माइक्रोसर्जन द्वारा भी प्रक्रिया सीखना आसान नहीं है।

एक बार रक्तचाप दर्ज हो जाने के बाद, अन्वेषक हिस्टोलॉजिकल पीएएच लक्षण वर्णन के लिए जानवरों से दिल और फेफड़ों को अलग कर सकता है। उदाहरण के लिए, सही वेंट्रिकुलर दीवार मोटाई माप सही वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि और मांसपेशियों फुफ्फुसीय धमनी रीमॉडेलिंग के लिए पेशी फुफ्फुसीय डिस्टल पोत विश्लेषण। आंकड़ों से पता चलता है कि 7C1/let-7 miRNA फुफ्फुसीय रक्तचाप को कम करने में अत्यधिक प्रभावी है, जो हमारे कई IV बोलस खुराक की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, जांचकर्ता इंजेक्शन सामग्री की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए ताजा पृथक पूरे फेफड़े से फेफड़े के एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं।

सारांश में, यह प्रोटोकॉल माउस हाइपोक्सिया-प्रेरित पीएएच मॉडल में कई चतुर्थ बोलस खुराक और आक्रामक हेमोडायनामिक निगरानी को निष्पादित करने के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। जांचकर्ता IV इंजेक्शन और हेमोडायनामिक निगरानी की आवश्यकता वाले कृंतक मॉडल की विस्तृत विविधता के लिए यहां वर्णित जुगुलर नस इंजेक्शन और धमनी/दाएं वेंट्रिकल कैथीटेराइजेशन तकनीकों का उपयोग कर सकते हैं।

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Disclosures

K Zsebo, M Simons आणि P-Y Chen VasoRx, Inc. चे वैज्ञानिक संस्थापक आणि शेधारक आहेत. M Simons VasoRx, Inc. च्या वैज्ञानिक सल्लाहकार बोर्डचे सदस्य आहेत. HJ डकर्स VasoRx चे कर्मचारी आणि शेयरधारक आहे. अन्य लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम का समर्थन किया गया था, भाग में, एनआईएच अनुदान P30AR070253 (पीवाईसी), कार्डियोवास्कुलर मेडिकल रिसर्च एजुकेशन फंड (पीवाईसी), वासोआरएक्स, इंक फंड (एमएस) और एनआईएच अनुदान HL135582 (एमएस), HL152197 (एमएस) के तहत प्रदान किए गए संयुक्त जीवविज्ञान कंसोर्टियम माइक्रोग्रांट द्वारा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-0 prolene suture pack Ethicon 8698G for incision closure
8-0 nylon suture pack AROSurgical Instruments T06A08N14-13 for ligation
Anesthesia induction chamber VETEQUIP #941444 Holds the animal during anesthesia exposure
Catheter Interface Cable PEC-4D Millar for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000
Charcoal canister filters VETEQUIP #931401  to help remove waste anesthetic gases
Cotton swabs McKesson 24-106 for applying pressure to the injection site to prevent bleeding
Fine scissors Fine Science Tools 14059-11 Surgical tools
Insulin syringe 28 G EXEL 26027 for jugular vein IV injection
Isoflurane COVETRUS #029405 for mouse anesthesia
LabChart 8 Software ADInstruments for data analysis
Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) Millar for invasive blood pressure measurement
Needle-25 G BD 305124 for making a samll hole in a vessel
Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor BioSpherix E702 for oxygen concentration monitoring
PCU-2000 Pressure Control Unit Millar for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35
PowerLab 4/35 ADInstruments for Data Acquisition.
Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation.
Prism 8 GraphPad for statistics and scientific graphing
Semisealable hypoxia chamber BioSpherix an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals
Spring Scissors Fine Science Tools 15021-15 Surgical tools
Tweezer Style 4 Electron Microscopy Sciences 0302-4-PO Surgical tools
VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA VasoRx, Inc. Lot# B2-L-16Apr IV injection compound
VIP 3000 Veterinary Vaporizer COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. for accurate anesthesia delivery

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References

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अंतःशिरा बोलस खुराक इनवेसिव हेमोडायनामिक आकलन हाइपोक्सिया-प्रेरित माउस पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप मॉडल फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप पीएएच अनुसंधान प्रायोगिक चिकित्सा माउस जुगुलर नस धमनी कैथीटेराइजेशन दाएं वेंट्रिकल कैथीटेराइजेशन पीएएच मॉडल
हाइपोक्सिया-प्रेरित माउस फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप मॉडल में एकाधिक अंतःशिरा बोलस खुराक और आक्रामक हेमोडायनामिक मूल्यांकन
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Qin, L., Jiang, B., Zsebo, K., Duckers, H. J., Simons, M., Chen, P. Y. Multiple Intravenous Bolus Dosing and Invasive Hemodynamic Assessment in a Hypoxia-Induced Mouse Pulmonary Artery Hypertension Model. J. Vis. Exp. (189), e63839, doi:10.3791/63839 (2022).

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