Summary
Этот протокол предусматривает поэтапную процедуру выполнения многократного внутривенного введения болюсных доз и инвазивного гемодинамического мониторинга у мышей. Исследователи могут использовать этот протокол для будущего скрининга терапевтических соединений на легочную артериальную гипертензию.
Abstract
Легочная артериальная гипертензия (ЛАГ) – прогрессирующее опасное для жизни заболевание, поражающее в первую очередь мелкие легочные артериолы легких. В настоящее время лекарства от ЛАГ не существует. Важно открыть новые соединения, которые можно использовать для лечения ЛАГ. Модель ЛАГ, индуцированной гипоксией у мышей, широко используется для исследования ЛАГ. Эта модель повторяет клинические проявления заболевания ЛАГ группы 3 у человека и является важным исследовательским инструментом для оценки эффективности новых экспериментальных методов лечения ЛАГ. Исследования с использованием этой модели часто требуют введения соединений мышам. Для соединения, которое необходимо вводить непосредственно в кровоток, оптимизация внутривенного (в/в) введения является ключевой частью экспериментальных процедур. В идеале система внутривенных инъекций должна допускать многократные инъекции в течение определенного периода времени. Несмотря на то, что модель ЛАГ, индуцированная гипоксией у мышей, очень популярна во многих лабораториях, в этой модели технически сложно выполнить многократное внутривенное болюсное дозирование и инвазивную оценку гемодинамики. В этом протоколе представлены пошаговые инструкции по проведению многократного внутривенного болюсного введения через яремную вену мыши и катетеризации артерий и правого желудочка для оценки гемодинамики на мышиной модели ЛАГ, индуцированной гипоксией.
Introduction
Легочная артериальная гипертензия (ЛАГ) определяется средним систолическим давлением в легочной артерии более 20 мм рт.ст. в покое 1,2. Это прогрессирующее и смертельное заболевание, характеризующееся устойчивым повышением давления в легочной артерии, приводящим к перегрузке правого желудочка и, в конечном итоге, к смерти из-занедостаточности правого желудочка. В настоящее время лекарства от ЛАГ не существует.
Использование животных моделей легочной гипертензии важно для проверки эффективности экспериментальной терапии ЛАГ. Среди этих моделей модель ЛАГ, индуцированная гипоксией у мышей, предоставила ключевую информацию о развитии болезни ЛАГ 3-й группы у человека3,4. Исследования с использованием этой модели часто требуют введения соединений на мышах для оценки эффективности и безопасности нового соединения. Таким образом, исследователям необходима детальная экспериментальная процедура дозирования соединений и гемодинамических измерений, чтобы обеспечить согласованность инъекций и воспроизводимость измерений артериального давления от начала до конца.
Методы внутривенных (в/в) инъекций и измерения артериального давления описаны в литературе 5,6. Однако методологии не хватает наглядной иллюстрации и подробного описания. Здесь мы проиллюстрируем основные этапы успешного внутривенного болюсного введения, а также точного измерения и регистрации системного и правого желудочкового давления. Процедуры, представленные здесь, являются важным ресурсом для исследователей, заинтересованных в внутривенном пути введения соединений для разработки лечения ЛАГ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с животными проводились в соответствии с протоколами, одобренными Институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Йельского университета.
1. Подготовка животных, инструментов, оборудования для измерения артериального давления и гипоксической камеры
- Акклиматизация животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальными животными, использованными для этого исследования, были самцы 8-недельных мышей C57BL/6 весом 25-27 г. При оценке количества животных, необходимых для эксперимента, следует учитывать несколько факторов, включая смертность, связанную с хирургическим вмешательством, неожиданные хирургические осложнения и внезапную неожиданную смерть. Используйте не менее 10 мышей в группе, чтобы достичь статистической мощности и избежать недостаточно мощных исследований.- После приема поместите животных в проветриваемые клетки для грызунов (группы по пять животных в клетке), обеспеченные соответствующей подстилкой, кормом для грызунов и водой. Дайте животным акклиматизироваться в новой среде (12-часовой цикл свет-темнота при 18-20 °C) в течение не менее 3 дней.
- Случайным образом распределите их по следующим группам: нормоксия (1-я группа), гипоксия (2-я группа) и гипоксия + 7C1/let-7 микроРНК (3-я группа).
- Подготовка хирургических инструментов и оборудования для измерения артериального давления.
- Стерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве (Рисунок 1A).
- Подготовьте импровизированную инъекционную платформу с самодельным наркозным конусом для носа (Рисунок 1B), шовными пакетами (Рисунок 1C) и оборудованием для процедуры ЛАГ (Рисунок 1D-F).
- Экспериментальная установка для индукции легочной артериальной гипертензии (ЛАГ).
- Установите баллон N2 , датчик кислорода и полугерметичную камеру гипоксии (Рисунок 2A).
- Установите заданное значение 10%O2 в датчике кислорода и дайте системе перейти в установившееся состояние (Рисунок 2B, C).
- Содержать животных с гипоксией (2-я группа) и гипоксией + 7C1/let-7 микроРНК (3-я группа) в условиях гипоксии (10%O2) в течение 3 недель. После 3 недель гипоксии поместите животных в нормоксические условия на 1 неделю (рис. 2D). Нормоксичная группа (1-я группа) остается в нормоксии в течение 4 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: (1) 3 недели гипоксии с последующей 1 неделей нормоксии является хорошо зарекомендовавшим себя методом развития ЛАГ и сердечной недостаточности правого желудочка7. Датчик кислорода определяет концентрацию O2 внутри полугерметичной гипоксической камеры и корректирует ее путем вливания газа N2 через трубку для инфузии газа. - Осматривайте животных ежедневно в течение всего срока эксперимента (3 недели). Проконсультируйтесь с ветеринаром, если животные проявляют признаки стресса, такие как резкая потеря веса и затрудненное дыхание. Если эвтаназия необходима животным, находящимся в тяжелом состоянии, исключите животное из исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие гипоксии приводит к потере массы тела мышей. Потеря 10% массы тела обычно используется в качестве надежного признака развития ЛАГ. - Избегайте чрезмерного раскрытия гипоксической камеры. Для чистки клеток, пополнения корма, смены бутылок с водой и введения компаунда открывайте камеры не более чем на 1 час в неделю.
2. Внутривенная болюсная инъекция через яремную вену
- Подготовка и обезболивание мышей.
- Выньте клетки мышей гипоксия (2-я группа) и гипоксия + 7C1/let-7 микроРНК (3-я группа) из гипоксической камеры и аккуратно извлеките животное из клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Режим дозирования 7C1/let-7 микроРНК (1,5 мг/кг внутривенно/доза) составляет два раза в неделю в течение 4 недель лечения. Рекомендуется, чтобы исследователи вынесли клетки для лечения гипоксии и гипоксии + соединения из камеры для лечения гипоксии во время внутривенной инъекции, чтобы убедиться, что все животные получают одинаковую величину воздействия гипоксии за интервал времени. - Взвесьте мышь с помощью прецизионных весов и запишите ее вес (рис. 3A).
- Поместите мышь в камеру для индукции анестезии, подключенную к испарителю анестезии, и закройте ее (Рисунок 3B). Обеспечьте тепловую поддержку и нанесите смазку для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание во время анестезии. Подвергайте мышь воздействию 3% изофлурана до потери сознания (рис. 3C-D).
- Выньте мышь из камеры и сбрейте шерсть от челюсти краниально до середины грудины каудально. Сбрейте шерсть сбоку от углов челюсти, по бокам шеи и к плечам (рис. 3E).
- Поместите мышь под наркозом изофлураном в положение лежа на спине (животом лицевой стороной вверх) на инъекционной платформе под диссекционным микроскопом. Поддерживайте анестезию через носовой конус с 1,5% изофлураном и осторожно удерживайте четыре ноги лейкопластырем, чтобы обездвижить тело (Рисунок 3F).
- Примените вредный раздражитель (например, щипок пальца ноги) прямыми щипцами, чтобы обеспечить адекватный уровень анестезии. Мышь под наркозом не должна реагировать на стимуляцию до и во время хирургической процедуры.
- Выньте клетки мышей гипоксия (2-я группа) и гипоксия + 7C1/let-7 микроРНК (3-я группа) из гипоксической камеры и аккуратно извлеките животное из клетки.
- Приготовление инъекционного агента.
- Готовят одноразовую инъекционную смесь в дозе 1,5 мг/кг в стерильных условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрейте инъекционный состав до комнатной температуры (RT), так как введение холодных веществ может вызвать дискомфорт и падение температуры тела мыши (если это не повредит соединение). Оптимальная доза и продолжительность действия микроРНК соединения 7C1/let-7, использованные в данном исследовании, основаны на предыдущих публикациях 8,9. - Наполните стерильный одноразовый шприц вводимым объемом. Держите шприц вертикально и продвигайте поршень, чтобы выпустить воздух из шприца. Не используйте шприц повторно.
- Ограничьте объем инъекции до 200 мкл для мыши весом 25 г, чтобы уменьшить частоту гемодилюции и аномальных сердечных эффектов у животных. Если требуется больший объем, разделите состав для инъекций на две инъекции с интервалом 10 мин.
- Готовят одноразовую инъекционную смесь в дозе 1,5 мг/кг в стерильных условиях.
- Подготовьте мышь к внутривенному введению.
- Аккуратно потрите прооперированную область три раза тремя чередующимися циклами раствора повидон-йода и 70% этанола. Ввести бупренорфин (0,05 мг/кг, SQ) за 30 минут до хирургического вмешательства.
- Сделайте продольный надрез 0,5 см немного правее средней линии шеи лезвием скальпеля (рис. 3G).
- Используйте щипцы, чтобы отделить мышечную и жировую ткани, чтобы найти правую наружную яремную вену (Рисунок 3H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз меняйте места инъекций, чтобы избежать образования рубцов. - Используйте мощный объектив, чтобы можно было легко визуализировать область впрыска (рис. 3I).
- Внутривенная инъекция
- Введите стерильную иглу 28 G в яремную вену скосом иглы вверх (рис. 3J, K).
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в хвостовую вену является альтернативой инъекции в яремную вену. Однако этот метод трудно проводить повторное дозирование из-за вариативности глубины вен, цвета кожи хвоста мышей и твердости кожи. - Медленно нажмите на поршень шприца, чтобы ввести соединение в вену. Оставьте иглу в вене еще на 10 с, чтобы предотвратить обратный ток инъектора (Рисунок 3L).
ПРИМЕЧАНИЕ: Голубоватый краситель позволяет легко визуализировать инъекцию. Не включайте краситель при введении испытуемых материалов. Неточная инъекция приведет к накоплению синюшного красителя вокруг места внутривенной инъекции. - Извлеките иглу и ватным тампоном надавите на место инъекции, чтобы предотвратить кровотечение (Рисунок 3M).
- Зашить кожу швом 5-0 (Рисунок 3N). После операции переместите животное в теплое, чистое, сухое место и дайте ему мелоксикам (1 мг/кг, SQ, каждые 24 часа). Поместите животное в чистую клетку без подстилки, но со дном, покрытым бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна прийти в себя после анестезии и прийти в сознание в течение 5 минут после возвращения в клетку для восстановления. Следите за мышью на предмет признаков стресса. - Верните животных в домашнюю клетку, а мышиную клетку поместите обратно в камеру гипоксии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура, от обезболивания мыши до конечной инъекции в яремную вену, занимает около 10-15 минут одним экспериментатором. Чтобы сократить воздействие нормоксии на мышей, рекомендуется, чтобы по крайней мере два исследователя сотрудничали для выполнения процедуры инъекции в яремную вену.
- Введите стерильную иглу 28 G в яремную вену скосом иглы вверх (рис. 3J, K).
3. Измерение артериального давления
- Подготовьте приборы для измерения артериального давления.
- Замочите наконечник катетера 1,0 °F в предварительно нагретом PBS при температуре 37 °C не менее чем за 30 минут до измерения гемодинамики (Рисунок 4A).
- Измерьте расстояние от места введения катетера до желаемого места наконечника катетера. Например, расстояние между восходящей аортой мыши и серединой шеи составляет примерно 1-1,2 см. Расстояние от правого желудочка сердца до середины шеи составляет примерно 2,3-2,8 см.
- Отметьте две отметки расстояния между катетером, чтобы обеспечить визуальную индикацию глубины введения (Рисунок 4B).
- Прикрепите катетер к датчику давления, подключите датчик давления к входному каналу 1 устройства сбора данных, включите блок управления давлением и объемом и запустите программное обеспечение для анализа артериального давления для сбора данных. Создайте новый документ анализа артериального давления и установите канал 1 для давления.
- Выполните калибровку давления в соответствии с протоколом производителя. Дайте всей установке стабилизироваться в течение не менее 5 минут (Рисунок 4C).
- В программном обеспечении для анализа артериального давления выберите «Преобразование единиц измерения » в раскрывающемся меню «Канал 1 » (рис. 4D, красная стрелка).
- Задайте значения преобразования единиц измерения по умолчанию (рис. 4E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Артериальное давление выражается в миллиметрах ртутного столба (мм рт. ст.). Стандартизированное выходное давление блока управления давлением составляет 1 В на 100 мм рт. 25 мм рт.ст. соответствует выходу 0,25 В, а 100 мм рт.ст. соответствует выходу 1 В.
- Подготовьте мышь к процедуре измерения артериального давления.
- Обезболивайте мышь 3% ингаляцией изофлурана через носовой конус.
- Наносите ветеринарную мазь непосредственно на глазную поверхность глаз мыши, чтобы предотвратить сухость, так как мышь не может закрыть глаза под наркозом. Сбрейте шерсть с шеи мыши под наркозом.
- Потрите выбритую область тремя чередующимися циклами раствора повидон-йода и тампоном с 70% этанолом. Поместите мышь под наркозом в положение лежа на спине на инъекционной платформе под диссекционным микроскопом. Поместите нос мыши в носовой конус, чтобы поддерживать анестезию (1,5% изофлурана) на протяжении всей хирургической процедуры.
- Проверьте двигательную реакцию мыши под наркозом на вредный раздражитель. Мышь под наркозом не должна реагировать на вредные раздражители до и во время операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингаляционные (изофлуран) и инъекционные (кетамин/ксилазин) анестетики могут снижать артериальное давление. В целом, ингаляционная анестезия изофлураном оказывает незначительное влияние на снижение артериального давления, чем кетамин/ксилазин. Таким образом, изофлуран является предпочтительным ингаляционным анестетиком по сравнению с кетамином/ксилазином. Достижение соответствующей глубины анестезии имеет решающее значение для точных и воспроизводимых гемодинамических измерений. Исследователь должен поддерживать постоянную глубину анестезии для каждой мыши.
- Катетеризация восходящей аорты
- Примените вредный раздражитель (например, щипок пальца ноги) прямыми щипцами, чтобы обеспечить адекватный уровень анестезии. Сделайте срединный разрез кожи от нижней челюсти до грудины (Рисунок 5А).
- Отделите слюнные железы и обнажите трахею (рис. 5Б).
- Используйте щипцы, чтобы очистить мягкие ткани вдоль сосудов, чтобы обнажить правую сонную артерию и правую наружную яремную вену (рис. 5C).
- Введите в полость 0,5 мл PBS, чтобы замедлить развитие вазоспазма при манипуляциях с сонной артерией.
- Аккуратно изолируют участок правой сонной артерии диаметром 5 мм. Поместите лист стерильной белой бумаги под сосуд в качестве фона, чтобы сделать артерию более заметной (рисунок 5D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно отделите блуждающий нерв (белый) от артерии и следите за тем, чтобы не порезать и не повредить нерв или артерию. - Использование 8-0 Шов завязывают постоянным узлом (#2), чтобы закрыть краниальный конец сосуда (Рисунок 5E).
- Завяжите первый свободный узел (#2), чтобы временно перекрыть кровоток из аорты. Затем завяжите второй свободный узел (#2) между первыми двумя швами (Рисунок 5F). Второй свободный узел (#2) будет использоваться для быстрой фиксации катетера после установки.
- С помощью иглы 25 G сделайте небольшое отверстие, достаточно большое, чтобы пройти через катетер, на одной линии с сосудом между лигатурами #3 и #1 (рис. 5G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сонные артерии несут насыщенную кислородом кровь от сердца и имеют очень высокое давление. Если сонная артерия перерезана, это давление приведет к тому, что кровь вытечет наружу (рис. 5H). - Держите катетер на расстоянии 1,5 дюйма от наконечника и осторожно введите кончик катетера через отверстие артерии (X-метка). Затяните средний шовный узел (#2) вокруг катетера и сосуда, который все еще пропускает катетер (Рисунок 5I-J).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требует практики. Потенциальные осложнения на этом этапе включают кровотечение в месте введения катетера и спазм сосудов. При возникновении кровотечения кровопотеря из кровоточащей артерии уменьшает объем крови, что приводит к резкому падению системного артериального давления. Из-за тяжести животное достигло гуманной конечной точки и должно быть усыплено. При механически индуцированном вазоспазме он обычно возникает во время введения катетера, вызванного стойким сужением кровеносных сосудов. Это уменьшает отверстие кровеносного сосуда и препятствует продвижению катетера к сонной артерии. Не прилагайте чрезмерных усилий против сопротивления для продвижения катетера. При возникновении умеренной или тяжелой резистентности к спазму сосудов повторите попытку через некоторое время или используйте катетер меньшего размера (например, 1,0 F). Опытные микрохирурги могут достичь 100% успеха при катетеризации восходящей аорты. - После того, как катетер пройдет первый свободный узел (#2) наконечником датчика, затяните второй свободный узел (#2) более плотно, чтобы зафиксировать катетер, и осторожно отпустите первый свободный узел (#2) (Рисунок 5K, L).
- Продолжайте вводить катетер по направлению к восходящей аорте в соответствии с отметкой на катетере (Рисунок 4B) до тех пор, пока анализ давления не покажет профиль артериального давления (Рисунок 5M). Записывайте данные системного артериального давления (САД) с помощью системы сбора данных и программного обеспечения.
- Ослабьте средний шовный узел (#2), чтобы можно было вытащить катетер (Рисунок 5N).
- Перевяжите средний шовный узел (#2) вокруг сосуда перед извлечением катетера из сонной артерии (рис. 5O-P).
- Поместите катетер в PBS.
- Катетеризация правых отделов сердца.
- Аккуратно изолируют правую наружную яремную вену от окружающей соединительной ткани и перевязывают все мелкие ветви 8-0 шов (синие наконечники стрел) (рис. 6А).
ПРИМЕЧАНИЕ: При катетеризации правых отделов сердца доступ к сердцу обычно осуществляется через правую яремную вену. - Использование 8-0 наложить шов, завязать постоянный узел (#2), чтобы закрыть краниальный конец сосуда (Рисунок 6Б). Затем завяжите свободный узел (#2) на каудальном конце сосуда (рис. 6C).
- С помощью иглы 25 G сделайте небольшое отверстие проксимальнее постоянного узла (#2) (Рисунок 6D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Яремные вены несут деоксигенированную кровь к сердцу и имеют низкое давление. Если перерезать яремную вену, кровь не будет хлестать наружу (рис. 6D, E). - Возьмитесь за катетер и введите катетер в разрез вены (X-метка) (Рисунок 6E) и затяните хвостовой узел (#2) вокруг катетера и сосуда (Рисунок 6F).
- Медленно и осторожно протолкните катетер в правое сердце. Контролируйте глубину наконечника катетера в зависимости от метки катетера (Рисунок 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка систолического давления в правом желудочке (RVSP) у мышей с закрытой грудной клеткой является сложной задачей из-за сложной анатомии и структуры ПЖ. Этот шаг требует высокого уровня знаний и большой практики. В руках опытного микрохирурга успешность катетеризации правого желудочка может приблизиться к 90%. - Оцените положение наконечника катетера в соответствии с трассировкой волны давления в программном обеспечении. Когда кончик катетера находится в правом желудочке, монитор покажет типичную трассировку RVSP (рис. 6G, H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если форма кривых легочного давления выглядит нетипичной (например, остроконечные кривые), это означает неправильное положение катетера. Отрегулируйте положение катетера, осторожно потянув катетер немного назад, а затем медленно продвигая катетер в более центральное положение в правом желудочке. Во избежание генерации артефактов в данных исследования следует избегать длительных (не более 1 мин) или повторных попыток (не более двух попыток) катетеризации правого желудочка. - Держите катетер неподвижно и собирайте данные в течение 5 минут.
- После завершения записи осторожно вытащите катетер и завяжите хвостовой узел (#2) вокруг сосуда (рис. 6I). Поместите катетер обратно в раствор PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения эксперимента очистите катетер 1% раствором пищеварительного фермента в соответствии с инструкциями производителя. В дополнение к оценке гемодинамического статуса, исследователи могут собирать сердца и легкие для гистопатологического исследования ЛАГ. Чтобы обеспечить эффективность многократного внутривенного болюсного введения, исследователи могут изолировать эндотелиальные клетки легких и измерять уровни микроРНК let-7.
- Аккуратно изолируют правую наружную яремную вену от окружающей соединительной ткани и перевязывают все мелкие ветви 8-0 шов (синие наконечники стрел) (рис. 6А).
4. Анализ данных артериального давления
- Изучите запись артериального давления.
- Откройте файл данных программного обеспечения для анализа артериального давления (PAH JOVE.adicht).
- В канале 1 выберите область, представляющую сигнал давления, и поместите курсор осциллограммы на пик (X-метка) для измерения амплитуды давления (Рисунок 7A).
- Определите максимальную амплитуду волны давления. Он представляет собой систолическое давление (рис. 7А, красная стрелка).
- Извлеките интересующую область (серая область на рисунке 7B ) из изображения, нажав клавиши Shift + Command + 3 (для Mac) или Windows + Shift + S (для ПК с Windows) и вставьте ее в графический файл.
- Статистический анализ данных артериального давления.
- Введите данные об артериальном давлении отдельных мышей в программное обеспечение для статистического анализа.
- Выполнить непарный t-критерий Стьюдента для статистического анализа двух исследуемых групп (нормоксия против гипоксии; гипоксия против гипоксии + 7C1/let-7 микроРНК). Считайте различия в средних значениях значимыми от p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анестезия часто снижает артериальное давление. Поэтому использовалась минимальная доза анестезии, чтобы отменить движения в ответ на вредный раздражитель. Успешный доступ к камере правого желудочка можно визуализировать по изменению формы гемодинамических волн в различных отделах венозной системы (рис. 8).
В этом исследовании мыши были случайным образом распределены в группу нормоксии (21% O2) (n = 10), группу гипоксии (10% O2) (n = 10) или группу лечения гипоксией + 7C1/let-7 (n = 10). Для изучения влияния микроРНК let-7 на подавление развития ЛАГ, вызванной гипоксией, мышам C57BL/6 вводили внутривенно в дозе 1,5 мг/кг миРНК 7C1/let-7 (рис. 2D).
Через 4 недели после воздействия гипоксии или нормоксии САД и РВСП измеряли у мышей с закрытой грудной клеткой. На рисунке 9А показана репрезентативная кривая артериального давления в группах лечения нормоксикой, гипоксией или гипоксией + 7C1/let-7 микроРНК. По сравнению с контрольной группой, принимавшей нормоксию, РВСП был значительно повышен в группе гипоксии. Кроме того, по сравнению с группой гипоксии, лечение соединением 7C1/let-7 микроРНК у мышей приводило к значительному снижению РВСП (рис. 9Б). СБП не изменилось ни в одной группе, что согласуется с предыдущими сообщениями7. МикроРНК 7C1/let-7 нацелена на эндотелиальные клетки и снижает TGFβ сигнальный каскад8. Данные показывают, что 7C1/let-7 микроРНК 1,5 мг/кг обладает высокой эффективностью в снижении артериального давления в правом желудочке, демонстрируя эффективность многократного внутривенного болюсного введения.
Рисунок 1: Хирургические инструменты и оборудование для измерения артериального давления, необходимые для лечения легочной артериальной гипертензии. (A) Хирургические инструменты, используемые для процедуры ЛАГ. (B) Импровизированная платформа для инъекций, изготовленная из впитывающей прокладки, обернутой вокруг штатива из пенополистирола из конической упаковки объемом 50 мл. Прикрепление наркозной трубки длиной 10 см к инъекционной платформе в виде носового конуса с типом. (C) Шовные пакеты. 5-0 шов для закрытия разреза и 8-0 шов для перевязки. (Д-Ж) Оборудование для измерения артериального давления, используемое для процедуры ЛАГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальная установка индукции ЛАГ. (А) Фотография настройки гипоксической системы BioSpherix. Показаны различные части индукционной системы. (В-В) Кислородный датчик, контролирующий концентрацию O2 в гипоксической камере. (D) Экспериментальный график лечения соединением 7C1/let-7 микроРНК и воздействия уровня кислорода на все группы животных во время индукции ЛАГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Фотографии основных хирургических этапов инъекции в яремную вену. (А) Мышь на весах. (Б) Настройка индукционной системы анестезии грызунов. Показаны различные части индукционной системы. (К-Д) Фотографии мыши, обезболинной изофлураном, в индукционной камере. (E) Удаление шерсти в зоне хирургического вмешательства. (F) Мышь, помещенная на инъекционную платформу и дышащая 1,5% изофлураном через носовой конус из испарителя. (G) Разрез кожи для доступа к яремной вене. (H) Хирургическое рассечение правой наружной яремной вены. (I) Визуализация с большим увеличением, показывающая изолированную правую яремную вену. Обратите внимание на белую бумагу под сосудом, чтобы сделать вену более заметной. (Дж-К) Введение иглы в правую яремную вену со скосом вверх. (L) Инъекция соединения с голубоватым красителем в яремную вену. (M) Надавливание на место инъекции с помощью ватного тампона после извлечения иглы. (N) Зашивание раны швом 5-0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Калибровка катетера. (A) Замачивание наконечника катетера 1,0 °F в предварительно нагретом 37 °C PBS. (B) Разметка расстояния на катетере, помогающая оценить глубину введения катетера в восходящую аорту и правый желудочек. (C) Оборудование для измерения артериального давления, проходящее калибровку с нулевой базовой линией. (Ка') Скриншот анализа артериального давления на основе программного обеспечения для анализа катетера. (D) В раскрывающемся меню «Канал 1 » выберите диалоговое окно «Преобразование единиц» в программном обеспечении для анализа артериального давления. (E) Установка значений преобразования единиц измерения по умолчанию для преобразования входного сигнала напряжения в единицу измерения мм рт.ст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Хирургические процедуры для измерения системного артериального давления (САД). (А) Срединный разрез от нижней челюсти до грудины на коже шеи. (Б) Отделение слюнной железы для обнажения трахеи. (C) Обнажение правой сонной артерии и правой наружной яремной вены после рассечения ткани. (D) Изолированный участок сонной артерии диаметром 5 мм. (Д,Ж) Наложите шов на постоянный узел на черепной конечности и два свободных узла на хвостовой конечности. (Г,Н) Проделывание небольшого отверстия (X-метки) на сонной артерии чуть ближе к постоянному узлу (#2). (I) Введение катетера в сонную артерию. (J) Фиксация катетера средним шовным узлом (#2). (К,Л) Аккуратно освобождаем первый свободный узел (#2). (M) Репрезентативные волны артериального давления. (N) Ослабление среднего шовного узла (#2). (О,) Затягивание среднего шовного узла (#2) вокруг сосуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Хирургические процедуры для измерения систолического давления в правом желудочке (RVSP). (А) Перевязка мелких ветвей правой яремной вены (синие стрелки). (Б) Постоянный узел (#2) на краниальном конце яремной вены. (C) Свободный узел (#2) на каудальном конце яремной вены. (D) Проделывание небольшого отверстия в правой яремной вене каудально от постоянного узла (#2). (E) Введение катетера в яремную вену через небольшое отверстие (X-метка). (F) Затягивание хвостового узла (#2) вокруг катетера и сосуда. (G) Проталкивание катетера в правый желудочек сердца. (H) Представитель RVSP. (I) Стягивание каудального узла (#2) вокруг сосуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анализ данных программного обеспечения для анализа артериального давления после записи. (A) Использование курсора осциллограммы для измерения амплитуды давления по необработанным данным программного обеспечения для анализа артериального давления в канале 1. (B) Извлечение интересующей области из изображения необработанных данных программного обеспечения для анализа артериального давления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Переход формы гемодинамического сигнала при катетеризации правого желудочка. (А-Г) Репрезентативные следы изменения давления во время катетеризации правого желудочка мыши C57BL/6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Репрезентативные цифры анализа артериального давления и анализ данных. (A) Репрезентативные кривые САД и РВСП у мышей, получавших нормоксию, гипоксию и гипоксию + 7C1/let-7 микроРНК. (B) Суммарные графики САД и РВСП у мышей, получавших нормоксию, гипоксию и гипоксию + 7C1/let-7 микроРНК (NS: не значимо; **p < 0,01; ***p < 0,001; непарный двусторонний t-критерий Стьюдента). N = 10 на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Было создано несколько моделей легочной гипертензии на животных, чтобы имитировать повышенное легочное сосудистое сопротивление у людей. Среди них модель ЛАГ, индуцированная гипоксией у мышей, широко использовалась для оценки эффективности новых экспериментальных методов лечения ЛАГ. Исследования с использованием этой модели часто требуют введения соединений мышам. По сравнению с другими опубликованными протоколами внутривенных (в/в) инъекций и инвазивной оценки гемодинамики, этот метод обеспечивает как визуальную иллюстрацию, так и подробное описание.
Существует три критически важных шага для успешного выполнения процедуры и получения точных и воспроизводимых измерений артериального давления. Во-первых, убедитесь, что игла шприца правильно расположена в яремной вене. Неправильная инъекция в яремную вену может привести к подкожной инъекции. Во-вторых, обеспечьте достаточную глубину анестезии. Постоянная глубина анестезии у каждой мыши важна для получения данных, сопоставимых между группами. Слишком глубокая анестезия может вызвать значительное снижение уровня артериального давления. В дополнение к ингаляционной анестезии изофлураном, внутрибрюшинная инъекция кетамина/ксилазина является еще одним широко используемым методом анестезии для хирургии мышей. Оба способа имеют свои преимущества и недостатки. Ингаляционная анестезия изофлураном имеет ряд преимуществ по сравнению с инъекционным кетамином/ксилазином, включая быстрое начало, отсутствие контролируемых препаратов, быстрое восстановление и гораздо более легкий контроль глубины анестезии. Недостатками являются стоимость оборудования, неприятный запах, воздействие на человека отработанных анестезирующих газов. В-третьих, убедитесь, что катетер находится внутри правого желудочка сердца. Длительные или многократные неудачные попытки катетеризации правого желудочка могут привести к ложным показаниям артериального давления.
Внутривенная инъекция мышам преимущественно вводится через боковые хвостовые вены. Несмотря на то, что этот путь легко добраться с помощью игл, этот метод иногда затрудняет проведение многократного внутривенного болюсного введения. Двумя основными проблемами при выполнении этого метода являются вариабельность глубины вен и сложность визуализации иглы из-за цвета кожи хвоста мышей и твердости кожи. Что еще более важно, нет никакого способа подтвердить, что все содержимое инъекции успешно попало в кровоток, а не в окружающие ткани. Яремная вена является предпочтительным местом доступа, потому что (1) она клинически значима, (2) она обеспечивает визуальное подтверждение доставки инъекции в вену, (3) она позволяет проводить многократные инъекции группе животных в ходе эксперимента, и (4) эта техника инъекции безопасна, и процедура не вызывает никаких побочных эффектов.
Существует три способа регистрации артериального давления у мышей: (1) Неинвазивная плетизмография с манжетой хвоста10. Системы позволяют проводить повторные измерения в ходе лонгитюдного исследования. (2) Радиотелеметрия11. Системы позволяют в режиме реального времени контролировать артериальное давление у бодрствующих и свободно движущихся лабораторных животных. (3) Инвазивные внутриартериальные катетеры12. Системы позволяют измерять острое САД и РВСП. В этом протоколе мы выбрали катетер давления для высокоточных системных измерений и измерения давления в правом желудочке. Однако этот метод имеет некоторые ограничения. Во-первых, катетер для измерения давления и оборудование для измерения артериального давления стоят дорого (рис. 1E-F). Во-вторых, требуется обезболивание животных, что вызывает снижение артериального давления. В-третьих, катетеризация правых отделов сердца является терминальной процедурой, которая не позволяет проводить серийные измерения. В-четвертых, процедуре нелегко научиться даже хорошо обученному микрохирургу.
После того, как артериальное давление зарегистрировано, исследователь может изолировать сердце и легкие от животных для гистологической характеристики ЛАГ. Например, измерение толщины стенки правого желудочка для гипертрофии правого желудочка и анализ мускуляризированных дистальных сосудов легочной артерии для ремоделирования мышечно-легочной артерии. Данные показывают, что микроРНК 7C1/let-7 очень эффективна в снижении легочного артериального давления, демонстрируя эффективность многократного внутривенного болюсного введения. Кроме того, исследователи могут изолировать эндотелиальные клетки легких от свежевыделенного целого легкого, чтобы оценить эффективность вводимых материалов.
Таким образом, этот протокол представляет собой пошаговую процедуру выполнения многократного внутривенного болюсного дозирования и инвазивного гемодинамического мониторинга в модели ЛАГ, индуцированной гипоксией у мышей. Исследователи могут использовать методы инъекции в яремную вену и катетеризацию артерий/правого желудочка, описанные здесь, для широкого спектра моделей грызунов, требующих внутривенного введения и гемодинамического мониторинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
К. Зсебо, М. Саймонс и-И Чен являются научными основателями и акционерами VasoRx, Inc. М. Саймонс является членом Научно-консультативного совета VasoRx, Inc. Х. Дж. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана микрогрантом Объединенного биологического консорциума, предоставленным в рамках гранта NIH P30AR070253 (PYC), Образовательного фонда сердечно-сосудистых медицинских исследований (PYC), Фонда VasoRx, Inc. (MS) и грантов NIH HL135582 (MS), HL152197 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 prolene suture pack | Ethicon | 8698G | for incision closure |
| 8-0 nylon suture pack | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | for ligation |
| Anesthesia induction chamber | VETEQUIP | #941444 | Holds the animal during anesthesia exposure |
| Catheter Interface Cable PEC-4D | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000 | |
| Charcoal canister filters | VETEQUIP | #931401 | to help remove waste anesthetic gases |
| Cotton swabs | McKesson | 24-106 | for applying pressure to the injection site to prevent bleeding |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Surgical tools |
| Insulin syringe 28 G | EXEL | 26027 | for jugular vein IV injection |
| Isoflurane | COVETRUS | #029405 | for mouse anesthesia |
| LabChart 8 Software | ADInstruments | for data analysis | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) | Millar | for invasive blood pressure measurement | |
| Needle-25 G | BD | 305124 | for making a samll hole in a vessel |
| Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor | BioSpherix | E702 | for oxygen concentration monitoring |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation. |
|
| Prism 8 | GraphPad | for statistics and scientific graphing | |
| Semisealable hypoxia chamber | BioSpherix | an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | Surgical tools |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | Surgical tools |
| VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | Lot# B2-L-16Apr | IV injection compound |
| VIP 3000 Veterinary Vaporizer | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | for accurate anesthesia delivery |
References
- McLaughlin, V. V., McGoon, M. D.
- Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
- Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
- Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512 (2021).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739 (2012).
- Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088 (2020).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
- Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
- Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291 (2009).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090 (2019).
