Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen
Summary
We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.
Abstract
Om de complexe moleculaire mechanismen te ontcijferen die de assemblage en demontage van actinefilamenten reguleren, is het een grote aanwinst om individuele reacties live in goed gecontroleerde omstandigheden te monitoren. Om dit te doen, zijn er de afgelopen 20 jaar levende single-filament experimenten ontstaan, meestal met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie, en hebben ze een schat aan belangrijke resultaten opgeleverd. In 2011, om de mogelijkheden van deze experimenten verder uit te breiden en terugkerende problematische artefacten te voorkomen, introduceerden we eenvoudige microfluïdica in deze testen. Deze studie beschrijft ons basisprotocol, waarbij individuele actinefilamenten aan één uiteinde worden verankerd aan het gepassiveerde coverslipoppervlak, worden uitgelijnd met de stroom en achtereenvolgens kunnen worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen. We presenteren ook de protocollen voor specifieke toepassingen en leggen uit hoe gecontroleerde mechanische krachten kunnen worden toegepast, dankzij de viskeuze weerstand van de stromende oplossing. We belichten de technische kanttekeningen van deze experimenten en presenteren kort mogelijke ontwikkelingen op basis van deze techniek. Deze protocollen en verklaringen, samen met de huidige beschikbaarheid van eenvoudig te gebruiken microfluïdica-apparatuur, moeten niet-specialisten in staat stellen deze test in hun laboratoria te implementeren.
Introduction
De assemblage en demontage van actinefilamenten en actinefilamentnetwerken worden gecontroleerd door verschillende biochemische reacties en zijn afhankelijk van de mechanische context. Om inzicht te krijgen in deze complexe mechanismen is het van onschatbare waarde om individuele reacties op individuele filamenten (in voldoende grote aantallen) te kunnen waarnemen. In de afgelopen decennia is de observatie van dynamische actinefilamenten in realtime, meestal met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie, naar voren gekomen als een belangrijke techniek en heeft een indrukwekkende lijst van resultaten opgeleverd die niet konden worden verkregen met biochemische testen met bulkoplossing1.
Om dit te bereiken, moet men fluorescerend gelabelde actinefilamenten dicht bij het oppervlak van de microscoopdeksels houden terwijl ze worden blootgesteld aan oplossingen van actinebindende eiwitten (ABPs), die ook fluorescerend kunnen worden gelabeld. Dit biedt een middel om gebeurtenissen die plaatsvinden op individuele filamenten in goed gecontroleerde biochemische omstandigheden te volgen en zo de reactiesnelheden te kwantificeren. Er moet echter rekening worden gehouden met een aantal specifieke beperkingen. Het kunstmatig dicht bij het oppervlak houden van filamenten, vaak dankzij meerdere verankeringspunten of door het gebruik van een verdringingsmiddel zoals methylcellulose, kan hun gedrag veranderen (bijvoorbeeld pauzes veroorzaken in hun polymerisatie en depolymerisatie2). Het volgen van de contouren van elk filament kan een uitdaging zijn, vooral als nieuwe filamenten of filamentfragmenten zich in de loop van de tijd ophopen in het gezichtsveld. De reacties vinden plaats in een eindig volume waar de concentratie van actinemonomeren en ABP’s in de loop van de tijd kan variëren, waardoor het mogelijk moeilijk wordt om nauwkeurige snelheidsconstanten af te leiden. Ten slotte is het vernieuwen of wijzigen van de oplossing van ABPs moeilijk te bereiken in minder dan 30 s en zal het vaak leiden tot een inhomogeen eiwitgehalte in het monster.
Iets meer dan 10 jaar geleden, geïnspireerd door wat er al werd gedaan om individuele Desoxyribonucleïnezuur (DNA) strengen3 te bestuderen, introduceerden we een nieuwe techniek op basis van microfluïdica om individuele actinefilamenten te observeren en te manipuleren4. Het stelt men in staat om de bovengenoemde beperkingen van klassieke single-filament technieken te omzeilen. In deze microfluïdische assays worden actinefilamenten gekweekt uit spectrine-actinezaden die op de coverslip zijn geadsorbeerd. Filamenten worden dus aan één uiteinde alleen aan de onderkant van de microfluïdische kamer verankerd en fluctueren boven het oppervlak zonder te plakken. Filamenten stemmen zich af op de stroom van binnenkomende oplossingen, waardoor de bewaking van hun contourlengte wordt vergemakkelijkt en ze in een ondiep gebied boven de afdekplaat worden gehouden waar TIRF kan worden gebruikt. Verschillende oplossingen worden tegelijkertijd in de kamer gestroomd zonder te mengen, en de filamenten kunnen er sequentieel en snel aan worden blootgesteld.
Hier stellen we een reeks basisprotocollen voor om single-actine-filament microfluïdica-testen in het laboratorium op te zetten. Coverslips en microfluïdicakamers kunnen van tevoren worden voorbereid (in een halve dag) en het experiment zelf, waarbij verschillende biochemische omstandigheden kunnen worden getest, wordt in minder dan een dag uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergeleken met standaard single-filament methoden waarbij actinefilamenten op meerdere punten over hun lengte aan het oppervlak worden verankerd of er dicht bij worden gehouden door een verdringingsmiddel zoals methylcellulose, biedt microfluïdica een aantal voordelen. Omdat interacties met het oppervlak minimaal zijn, worden de kunstmatige pauzes die deze interacties kunnen induceren tijdens zowel rek als depolymerisatie vermeden. De filamenten worden uitgelijnd door de stroom, parallel aan elkaar, waardoor hun monitor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de B. Ladoux en R.-M. dankbaar. Mège lab voor het gebruik van hun UV-reiniger apparatuur, en J. Heuvingh en 0. du Roure voor de initiële training die we kregen over het bereiden van mallen op siliciumwafers en het geven van tips over microfluïdica. We erkennen financiering van European Research Council Grant StG-679116 (aan A.J.) en Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin en Conformin (aan G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
- Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
- Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
- Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
- Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
- Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
- Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
- Jégou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
- Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
- Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
- Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
- Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
- Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
- Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
- Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
- Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
- Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
- Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
- Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
- Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
- Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).
- Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
- Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
- Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).
