Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina
Summary
Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.
Abstract
Al fine di decifrare i complessi meccanismi molecolari che regolano l’assemblaggio e lo smontaggio dei filamenti di actina, è una grande risorsa monitorare le singole reazioni dal vivo in condizioni ben controllate. Per fare ciò, negli ultimi 20 anni sono emersi esperimenti dal vivo a singolo filamento, per lo più utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e hanno fornito una miniera di risultati chiave. Nel 2011, al fine di espandere ulteriormente le possibilità di questi esperimenti ed evitare artefatti problematici ricorrenti, abbiamo introdotto semplici microfluidiche in questi test. Questo studio descrive in dettaglio il nostro protocollo di base, in cui i singoli filamenti di actina sono ancorati da un’estremità alla superficie passivata del coverslip, si allineano con il flusso e possono essere successivamente esposti a diverse soluzioni proteiche. Presentiamo anche i protocolli per applicazioni specifiche e spieghiamo come possono essere applicate forze meccaniche controllate, grazie alla resistenza viscosa della soluzione scorrevole. Evidenziamo gli avvertimenti tecnici di questi esperimenti e presentiamo brevemente i possibili sviluppi basati su questa tecnica. Questi protocolli e spiegazioni, insieme alla disponibilità odierna di apparecchiature di microfluidica facili da usare, dovrebbero consentire ai non specialisti di implementare questo test nei loro laboratori.
Introduction
L’assemblaggio e lo smontaggio di filamenti di actina e reti di filamenti di actina sono controllati da diverse reazioni biochimiche e dipendono dal contesto meccanico. Al fine di ottenere informazioni su questi complessi meccanismi, è inestimabile essere in grado di osservare le singole reazioni sui singoli filamenti (in numero sufficientemente grande). Negli ultimi decenni, l’osservazione di filamenti dinamici di actina in tempo reale, per lo più utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), è emersa come una tecnica chiave e ha fornito un elenco impressionante di risultati che non avrebbero potuto essere ottenuti con i saggi biochimici di soluzione di massa1.
Per raggiungere questo obiettivo, è necessario mantenere filamenti di actina marcati fluorescentemente vicino alla superficie del coverslip del microscopio mentre li si espone a soluzioni di proteine leganti l’actina (ABP), che possono anche essere etichettate fluorescentemente. Ciò fornisce un mezzo per monitorare gli eventi che si verificano su singoli filamenti in condizioni biochimiche ben controllate e quindi quantificare le velocità di reazione. Tuttavia, dovrebbero essere prese in considerazione una serie di limitazioni specifiche. Mantenere artificialmente i filamenti vicini alla superficie, spesso grazie a più punti di ancoraggio o utilizzando un agente di affollamento come la metilcellulosa, può alterare il loro comportamento (ad esempio, causando pause nella loro polimerizzazione e depolimerizzazione2). Tracciare il contorno di ciascun filamento può essere difficile, in particolare se nuovi filamenti o frammenti di filamento si accumulano nel campo visivo nel tempo. Le reazioni avvengono in un volume finito in cui la concentrazione di monomeri di actina e ABP può variare nel tempo, rendendo potenzialmente difficile ricavare costanti di velocità accurate. Infine, rinnovare o modificare la soluzione di ABP è difficile da ottenere in meno di 30 s e spesso porterà a un contenuto proteico disomogeneo nel campione.
Poco più di 10 anni fa, ispirati da quanto già fatto per studiare i singoli filamenti di Acido Desossiribonucleico (DNA)3, abbiamo introdotto una nuova tecnica basata sulla microfluidica per osservare e manipolare i singoli filamenti di actina4. Permette di aggirare le suddette limitazioni delle tecniche classiche a singolo filamento. In questi saggi di microfluidica, i filamenti di actina vengono coltivati da semi di spettrina-actina adsorbiti sul coperchio. I filamenti sono quindi ancorati da un’estremità solo al fondo della camera microfluidica e fluttuano sopra la superficie senza attaccarsi. I filamenti si allineano con il flusso delle soluzioni in entrata, facilitando così il monitoraggio della loro lunghezza del contorno e mantenendoli in una regione poco profonda sopra il coperchio in cui è possibile utilizzare TIRF. Diverse soluzioni vengono simultaneamente fatte fluire nella camera senza miscelazione e i filamenti possono essere esposti a loro in sequenza e rapidamente.
Qui, proponiamo una serie di protocolli di base per impostare saggi di microfluidica a filamento singolo di actina in laboratorio. Coverslips e camere microfluidiche possono essere preparati in anticipo (in mezza giornata) e l’esperimento stesso, in cui è possibile testare diverse condizioni biochimiche, viene eseguito in meno di un giorno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto ai metodi standard a filamento singolo in cui i filamenti di actina sono ancorati alla superficie da più punti lungo la loro lunghezza o mantenuti vicino ad essa da un agente di affollamento come la metilcellulosa, la microfluidica offre una serie di vantaggi. Poiché le interazioni con la superficie sono minime, vengono evitate le pause artificiali che queste interazioni possono indurre sia durante l’allungamento che durante la depolimerizzazione. I filamenti sono allineati dal flusso, paralleli tra loro, faci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a B. Ladoux e R.-M. Laboratorio Mège per l’uso delle loro apparecchiature di pulizia UV, e J. Heuvingh e 0. du Roure per la formazione iniziale che abbiamo ricevuto sulla preparazione di stampi su wafer di silicio e fornendo suggerimenti sulla microfluidica. Riconosciamo i finanziamenti della sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca StG-679116 (ad A.J.) e delle sovvenzioni agence Nationale de la Recherche Muscactin e Conformin (a G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
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