Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único
Summary
Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.
Abstract
A fim de decifrar os complexos mecanismos moleculares que regulam a montagem e desmontagem de filamentos actin, é um grande trunfo monitorar reações individuais que vivem em condições bem controladas. Para isso, experimentos de filamento único ao vivo surgiram nos últimos 20 anos, principalmente usando microscopia total de fluorescência interna (TIRF) e forneceram uma série de resultados-chave. Em 2011, a fim de ampliar ainda mais as possibilidades desses experimentos e evitar artefatos problemáticos recorrentes, introduzimos microfluidos simples nesses ensaios. Este estudo detalha nosso protocolo básico, onde filamentos de actina individuais são ancorados por uma extremidade à superfície passivated de deslizamento de cobertura, alinhados com o fluxo, e podem ser sucessivamente expostos a diferentes soluções proteicas. Também apresentamos os protocolos para aplicações específicas e explicamos como forças mecânicas controladas podem ser aplicadas, graças ao arrasto viscoso da solução de fluxo. Destacamos as ressalvas técnicas desses experimentos e apresentamos brevemente possíveis desenvolvimentos com base nessa técnica. Esses protocolos e explicações, juntamente com a disponibilidade atual de equipamentos de microfluidos fáceis de usar, devem permitir que não especialistas implementem este ensaio em seus laboratórios.
Introduction
A montagem e desmontagem de filamentos de actin e redes de filamentos de actin são controladas por diversas reações bioquímicas e dependem do contexto mecânico. Para obter uma visão desses mecanismos complexos, é inestimável ser capaz de observar reações individuais em filamentos individuais (em números suficientemente grandes). Ao longo das últimas décadas, a observação de filamentos dinâmicos de actina em tempo real, principalmente usando microscopia total de fluorescência interna (TIRF), emergiu como uma técnica-chave e forneceu uma lista impressionante de resultados que não poderiam ter sido obtidos com ensaios bioquímicos de solução em massa1.
Para isso, é preciso manter filamentos de actina fluorescente rotulados perto da superfície do microscópio, ao mesmo tempo em que os expõe a soluções de proteínas de ligação de actina (ABPs), que também podem ser rotuladas fluorescentemente. Isso fornece um meio de monitorar eventos que ocorrem em filamentos individuais em condições bioquímicas bem controladas e, assim, quantificar as taxas de reação. No entanto, uma série de limitações específicas devem ser consideradas. Manter artificialmente filamentos próximos à superfície, muitas vezes graças a múltiplos pontos de ancoragem ou usando um agente de aglomeração como metilcelulose, pode alterar seu comportamento (por exemplo, causando pausas em sua polimerização e despomerização2). Rastrear o contorno de cada filamento pode ser desafiador, especialmente se novos filamentos ou fragmentos de filamento se acumularem no campo de visão ao longo do tempo. As reações ocorrem em um volume finito onde a concentração de monômeros e ABPs actina pode variar ao longo do tempo, potencialmente dificultando a derivação de constantes de taxa precisa. Por fim, renovar ou mudar a solução de ABPs é difícil de alcançar em menos de 30 anos e muitas vezes levará ao conteúdo proteico inhomogêneo na amostra.
Há pouco mais de 10 anos, inspirados pelo que já foi feito para estudar as cadeias individuais de ácido desoxiribonucleico (DNA)3, introduzimos uma nova técnica baseada em microfluidos para observar e manipular filamentos individuais de actin4. Permite contornar as limitações acima mencionadas das técnicas clássicas de filamento único. Nestes ensaios de microfluidos, os filamentos de actina são cultivados a partir de sementes de espectrin-actin adsorvidas no deslizamento de cobertura. Os filamentos são, portanto, ancorados por uma extremidade apenas na parte inferior da câmara microfluida e flutuam acima da superfície sem furar. Os filamentos se alinham com o fluxo de soluções de entrada, facilitando assim o monitoramento do comprimento do contorno e mantendo-os em uma região rasa acima do deslizamento de cobertura onde a TIRF pode ser usada. Diferentes soluções são simultaneamente fluídas para a câmara sem misturar, e os filamentos podem ser expostos a eles sequencialmente e rapidamente.
Aqui, propomos uma série de protocolos básicos para configurar ensaios de microfluidos de filamento único no laboratório. Tampas e câmaras de microfluidos podem ser preparadas com antecedência (em meio dia), e o experimento em si, onde várias condições bioquímicas podem ser testadas, é feito em menos de um dia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparado aos métodos padrão de filamento único, onde filamentos de actina são ancorados na superfície por vários pontos ao longo de seu comprimento ou mantidos perto dele por um agente de aglomeração como metilcelulose, os microfluidos oferecem uma série de vantagens. Como as interações com a superfície são mínimas, as pausas artificiais que essas interações podem induzir durante o alongamento e a despomerização são evitadas. Os filamentos são alinhados pelo fluxo, paralelos uns aos outros, facilitan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos ao B. Ladoux e R.-M. Laboratório Mège para o uso de seus equipamentos de limpeza UV, e J. Heuvingh e 0. du Roure para o treinamento inicial que recebemos na preparação de moldes em wafers de silício e fornecendo dicas sobre microfluidos. Reconhecemos o financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa Grant StG-679116 (para A.J.) e Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (para G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
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