マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する
Summary
我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。
Abstract
アクチンフィラメントの組み立てと分解を調節する複雑な分子メカニズムを解読するために、よく制御された条件下で個々の反応を監視することは大きな資産です。そのために、過去20年間に全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた生きたシングルフィラメント実験が登場し、重要な結果をもたらしました。2011年には、これらの実験の可能性をさらに広げ、繰り返し発生する問題のあるアーティファクトを回避するために、これらのアッセイに単純なマイクロフルイディクスを導入しました。この研究は、個々のアクチンフィラメントが不動態化されたカバースリップ表面に一端で固定され、流れに整列し、異なるタンパク質溶液に連続的に曝露され得るという、我々の基本的なプロトコルを詳述する。また、特定のアプリケーション向けのプロトコルを提示し、流れる溶液の粘性抗力のおかげで、制御された機械的力を適用する方法について説明します。我々は、これらの実験の技術的注意点を強調し、この技術に基づいて可能な開発を簡単に提示する。これらのプロトコルと説明は、使いやすいマイクロフルイディクス装置の今日の可用性とともに、非専門家がラボでこのアッセイを実施できるはずです。
Introduction
アクチンフィラメントおよびアクチンフィラメントネットワークの組み立ておよび分解は、いくつかの生化学反応によって制御され、機械的文脈に依存する。これらの複雑なメカニズムについての洞察を得るためには、個々のフィラメント上の個々の反応を(十分に多数で)観察できることは非常に貴重です。過去数十年にわたり、主に全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を用いた動的アクチンフィラメントのリアルタイム観察は、重要な技術として浮上し、バルク溶液生化学的アッセイ1では得られなかった結果の印象的なリストを提供してきました。
これを達成するには、蛍光標識されたアクチンフィラメントを顕微鏡カバースリップの表面近くに維持し、蛍光標識も可能なアクチン結合タンパク質(ABP)の溶液にさらす必要があります。そうすることで、適切に制御された生化学的条件下で個々のフィラメントで起こっている事象を監視し、反応速度を定量化する手段が提供されます。ただし、いくつかの特定の制限を考慮する必要があります。フィラメントを表面近くに人為的に維持することは、しばしば複数のアンカーポイントのおかげで、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤を使用することによって、それらの挙動を変えることができる(例えば、それらの重合および解重合の一時停止を引き起こす2)。各フィラメントの輪郭を追跡することは、特に新しいフィラメントまたはフィラメントの断片が時間の経過とともに視野に蓄積する場合、困難な場合があります。反応は有限の体積で起こり、アクチンモノマーおよびABPの濃度は時間の経過とともに変化する可能性があり、正確な速度定数を導出することが困難になる可能性があります。最後に、ABPの溶液を更新または変更することは、30秒未満で達成することは困難であり、しばしばサンプル中の不均一なタンパク質含有量につながる。
10年以上前、個々のデオキシリボ核酸(DNA)鎖3を研究するためにすでに行われたことに触発されて、個々のアクチンフィラメント4を観察および操作するためのマイクロフルイディクスに基づく新しい技術を導入しました。これにより、古典的なシングルフィラメント技術の前述の制限を回避することができます。これらのマイクロフルイディクスアッセイでは、アクチンフィラメントは、カバースリップに吸着されたスペクトリンアクチン種子から成長させる。したがって、フィラメントは、マイクロ流体チャンバの底部にのみ一端によって固定され、固着することなく表面上で変動する。フィラメントは入ってくる溶液の流れと整合するため、輪郭の長さの監視が容易になり、TIRFを使用できるカバースリップの上の浅い領域に維持されます。異なる溶液は混合することなく同時にチャンバに流され、フィラメントは逐次的かつ迅速にそれらに曝され得る。
ここでは、ラボでシングルアクチンフィラメントマイクロフルイディクスアッセイを設定するための一連の基本的なプロトコルを提案します。カバースリップとマイクロフルイディクスチャンバーは事前に(半日で)準備することができ、いくつかの生化学的条件をテストできる実験自体は1日未満で行われます。
Protocol
Representative Results
Discussion
アクチンフィラメントが長さに沿って複数の点によって表面に固定されるか、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤によって表面の近くに維持される標準的なシングルフィラメント法と比較して、マイクロフルイディクスは多くの利点を提供する。表面との相互作用は最小限であるため、これらの相互作用が伸長および解重合の両方の間に誘発し得る人工的な一時停止は回避され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.ラドゥーとR.-M.に感謝しています。彼らのUVクリーナー装置の使用のためのMègeラボ、およびJ. Heuvinghと0。デュ・ルーレは、シリコンウェーハ上の金型の準備とマイクロ流体学のヒントの提供について受けた初期トレーニングを受けました。我々は、欧州研究評議会グラントStG-679116(A.J.へ)及びAgence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin(G.R.-L.)からの資金提供を認める。
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
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