שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות
Summary
אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.
Abstract
על מנת לפענח את המנגנונים המולקולריים המורכבים המווסתים את ההרכבה והפירוק של חוטי אקטין, זהו נכס נהדר לניטור תגובות בודדות לחיות בתנאים מבוקרים היטב. כדי לעשות זאת, ניסויים חיים של נימה אחת הופיעו במהלך 20 השנים האחרונות, בעיקר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), וסיפקו שפע של תוצאות מפתח. בשנת 2011, על מנת להרחיב עוד יותר את האפשרויות של ניסויים אלה וכדי למנוע ממצאים בעייתיים חוזרים ונשנים, הצגנו מיקרופלואידיקה פשוטה במבחנים אלה. מחקר זה מפרט את הפרוטוקול הבסיסי שלנו, שבו חוטי אקטין בודדים מעוגנים בקצה אחד למשטח הכיסוי הפסיווי, מתיישרים עם הזרימה, ויכולים להיחשף ברצף לתמיסות חלבון שונות. אנו גם מציגים את הפרוטוקולים עבור יישומים ספציפיים ומסבירים כיצד ניתן ליישם כוחות מכניים מבוקרים, הודות לגרירה הצמיגית של הפתרון הזורם. אנו מדגישים את האזהרות הטכניות של ניסויים אלה ומציגים בקצרה התפתחויות אפשריות המבוססות על טכניקה זו. פרוטוקולים והסברים אלה, יחד עם הזמינות של כיום של ציוד מיקרופלואידיקה קל לשימוש, אמורים לאפשר למי שאינם מומחים ליישם בדיקה זו במעבדותיהם.
Introduction
ההרכבה והפירוק של חוטי אקטין ורשתות חוטי אקטין נשלטים על ידי מספר תגובות ביוכימיות ותלויים בהקשר המכני. על מנת לקבל תובנה על מנגנונים מורכבים אלה, זה לא יסולא בפז כדי להיות מסוגל לצפות בתגובות בודדות על חוטים בודדים (במספרים גדולים מספיק). במהלך העשורים האחרונים, התצפית על חוטי אקטין דינמיים בזמן אמת, בעיקר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), התגלתה כטכניקה מרכזית וסיפקה רשימה מרשימה של תוצאות שלא ניתן היה להשיג באמצעות בדיקות ביוכימיות של תמיסה בתפזורת1.
כדי להשיג זאת, יש לשמור על חוטי אקטין בעלי תווית פלואורסצנטית קרוב לפני השטח של כיסוי המיקרוסקופ תוך חשיפתם לתמיסות של חלבונים קושרי אקטין (ABPs), שגם אותם ניתן לתייג באופן פלואורסצנטי. פעולה זו מספקת אמצעי לניטור אירועים המתרחשים על חוטים בודדים בתנאים ביוכימיים מבוקרים היטב, ובכך לכמת את שיעורי התגובה. עם זאת, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות ספציפיות. שמירה מלאכותית על חוטים קרוב לפני השטח, לעתים קרובות הודות לנקודות עיגון מרובות או על ידי שימוש בחומר צפיפות כגון מתילצלולוז, יכולה לשנות את התנהגותם (למשל, לגרום להפסקות בפילמור ובדה-פולימריזציה שלהם2). מעקב אחר קווי המתאר של כל נימה יכול להיות מאתגר, במיוחד אם חוטים חדשים או שברי חוטים מצטברים בשדה הראייה לאורך זמן. התגובות מתרחשות בנפח סופי שבו הריכוז של מונומרים של אקטין ו-ABPs יכול להשתנות עם הזמן, מה שעלול להקשות על הפקת קבועי קצב מדויקים. לבסוף, קשה להשיג חידוש או שינוי של הפתרון של ABPs בפחות מ-30 שניות ולעתים קרובות יוביל לתכולת חלבון לא הומוגנית במדגם.
לפני קצת יותר מ-10 שנים, בהשראת מה שכבר נעשה כדי לחקור גדילים בודדים של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA)3, הצגנו טכניקה חדשה המבוססת על מיקרופלואידיקה כדי לבחון ולתפעל חוטי אקטין בודדים4. זה מאפשר לעקוף את המגבלות הנ”ל של טכניקות קלאסיות של נימה אחת. במבחני מיקרופלואידיקה אלה, חוטי אקטין גדלים מזרעי ספקטרין-אקטין הנספגים על הכיסוי. החוטים מעוגנים אפוא בקצה אחד בלבד לתחתית התא המיקרופלואידי ונעים מעל פני השטח מבלי להידבק. חוטים מתיישרים עם זרימת הפתרונות הנכנסים, ובכך מקלים על ניטור אורך קווי המתאר שלהם ושומרים עליהם באזור רדוד מעל הכיסוי שבו ניתן להשתמש ב- TIRF. פתרונות שונים זורמים בו זמנית לתוך התא ללא ערבוב, ואת החוטים ניתן לחשוף אותם ברצף ובמהירות.
כאן אנו מציעים סדרה של פרוטוקולים בסיסיים להקמת מבחני מיקרופלואידיקה חד-אקטיים במעבדה. ניתן להכין מראש כיסויים ותאי מיקרופלואידיקה (תוך חצי יום), והניסוי עצמו, שבו ניתן לבחון מספר מצבים ביוכימיים, נעשה תוך פחות מיום.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהשוואה לשיטות סטנדרטיות של נימה יחידה שבהן חוטי אקטין מעוגנים לפני השטח על ידי נקודות מרובות לאורכם או נשמרים קרוב אליו על ידי חומר צפיפות כגון מתילצלולוז, מיקרופלואידיקה מציעה מספר יתרונות. מכיוון שהאינטראקציות עם פני השטח הן מינימליות, נמנעות ההפסקות המלאכותיות שאינטראקציות אלה יכול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לב’ לאדו ולר’-מ’. מעבדת Mège לשימוש בציוד מנקה ה-UV שלהם, ו-J. Heuvingh ו-0. du Roure עבור האימון הראשוני שקיבלנו על הכנת תבניות על פרוסות סיליקון ומתן טיפים על microfluidics. אנו מכירים במימון מענק StG-679116 של מועצת המחקר האירופית (ל-A.J.) ומ-Agence Nationale de la Recherche מעניקים מוסקטין וקונפומין (ל-G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
- Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
- Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
- Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
- Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
- Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
- Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
- Jégou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
- Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
- Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
- Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
- Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
- Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
- Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
- Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
- Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
- Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
- Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
- Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
- Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
- Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).
- Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
- Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
- Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).
