Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única
Summary
Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.
Abstract
Con el fin de descifrar los complejos mecanismos moleculares que regulan el ensamblaje y desmontaje de los filamentos de actina, es un gran activo monitorear las reacciones individuales en vivo en condiciones bien controladas. Para hacerlo, han surgido experimentos en vivo de un solo filamento en los últimos 20 años, principalmente utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), y han proporcionado un tesoro de resultados clave. En 2011, con el fin de ampliar aún más las posibilidades de estos experimentos y evitar artefactos problemáticos recurrentes, introdujimos microfluídica simple en estos ensayos. Este estudio detalla nuestro protocolo básico, donde los filamentos de actina individuales se anclan por un extremo a la superficie pasivada de la cubierta, se alinean con el flujo y pueden exponerse sucesivamente a diferentes soluciones proteicas. También presentamos los protocolos para aplicaciones específicas y explicamos cómo se pueden aplicar las fuerzas mecánicas controladas, gracias al arrastre viscoso de la solución que fluye. Destacamos las advertencias técnicas de estos experimentos y presentamos brevemente los posibles desarrollos basados en esta técnica. Estos protocolos y explicaciones, junto con la disponibilidad actual de equipos de microfluídica fáciles de usar, deberían permitir a los no especialistas implementar este ensayo en sus laboratorios.
Introduction
El montaje y desmontaje de filamentos de actina y redes de filamentos de actina están controlados por varias reacciones bioquímicas y dependen del contexto mecánico. Para obtener información sobre estos complejos mecanismos, es invaluable poder observar reacciones individuales en filamentos individuales (en cantidades suficientemente grandes). En las últimas décadas, la observación de filamentos dinámicos de actina en tiempo real, principalmente utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), se ha convertido en una técnica clave y ha proporcionado una impresionante lista de resultados que no se podrían haber obtenido con ensayos bioquímicos de solución a granel1.
Para lograr esto, es necesario mantener los filamentos de actina marcados fluorescentemente cerca de la superficie de la cubierta del microscopio mientras se exponen a soluciones de proteínas de unión a actina (ABP), que también pueden ser marcadas fluorescentemente. Hacerlo proporciona un medio para monitorear los eventos que tienen lugar en filamentos individuales en condiciones bioquímicas bien controladas y, por lo tanto, cuantificar las velocidades de reacción. Sin embargo, deben considerarse una serie de limitaciones específicas. El mantenimiento artificial de los filamentos cerca de la superficie, a menudo gracias a múltiples puntos de anclaje o mediante el uso de un agente de apiñamiento como la metilcelulosa, puede alterar su comportamiento (por ejemplo, causando pausas en su polimerización y despolimerización2). El seguimiento del contorno de cada filamento puede ser un desafío, especialmente si se acumulan nuevos filamentos o fragmentos de filamento en el campo de visión con el tiempo. Las reacciones tienen lugar en un volumen finito donde la concentración de monómeros de actina y ABP puede variar con el tiempo, lo que potencialmente dificulta la obtención de constantes de velocidad precisas. Finalmente, renovar o cambiar la solución de ABP es difícil de lograr en menos de 30 s y a menudo conducirá a un contenido de proteína no homogéneo en la muestra.
Hace poco más de 10 años, inspirados por lo que ya se hizo para estudiar las hebras individuales de ácido desoxirribonucleico (ADN)3, introdujimos una nueva técnica basada en microfluídica para observar y manipular filamentos de actina individuales4. Permite eludir las limitaciones antes mencionadas de las técnicas clásicas de filamento único. En estos ensayos de microfluídica, los filamentos de actina se cultivan a partir de semillas de espectrina-actina adsorbidas en el cobertor. Por lo tanto, los filamentos se anclan por un extremo solo a la parte inferior de la cámara microfluídica y fluctúan por encima de la superficie sin pegarse. Los filamentos se alinean con el flujo de las soluciones entrantes, lo que facilita el monitoreo de la longitud de su contorno y los mantiene en una región poco profunda por encima del espolón donde se puede usar TIRF. Diferentes soluciones fluyen simultáneamente en la cámara sin mezclarse, y los filamentos se pueden exponer a ellas secuencial y rápidamente.
Aquí, proponemos una serie de protocolos básicos para establecer ensayos de microfluídica de filamento de actina única en el laboratorio. Las cámaras de coverslips y microfluidos se pueden preparar con anticipación (en medio día), y el experimento en sí, donde se pueden probar varias condiciones bioquímicas, se realiza en menos de un día.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con los métodos estándar de filamento único en los que los filamentos de actina están anclados a la superficie por múltiples puntos a lo largo de su longitud o mantenidos cerca de ella por un agente de apiñamiento como la metilcelulosa, la microfluídica ofrece una serie de ventajas. Como las interacciones con la superficie son mínimas, se evitan las pausas artificiales que estas interacciones pueden inducir durante el alargamiento y la despolimerización. Los filamentos están alineados por el flu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a B. Ladoux y R.-M. Mège lab para el uso de sus equipos de limpieza UV, y J. Heuvingh y 0. du Roure para la capacitación inicial que recibimos sobre la preparación de moldes en obleas de silicio y la provisión de consejos sobre microfluídica. Reconocemos la financiación de la subvención StG-679116 del Consejo Europeo de Investigación (a A.J.) y las becas de la Agence Nationale de la Recherche Muscactin y Conformin (a G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
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