Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln
Summary
Wir präsentieren Protokolle für einfache mikrofluidische Aktinfilament-Assays in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, die es ermöglichen, einzelne Aktinfilamente in Echtzeit genau zu überwachen und sie nacheinander verschiedenen Proteinlösungen auszusetzen.
Abstract
Um die komplexen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die den Auf- und Abbau von Aktinfilamenten regulieren, ist es ein großer Vorteil, einzelne Reaktionen live unter gut kontrollierten Bedingungen zu überwachen. Zu diesem Zweck sind in den letzten 20 Jahren Live-Single-Filament-Experimente entstanden, die hauptsächlich die Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) verwenden, und haben eine Fülle von Schlüsselergebnissen geliefert. Um die Möglichkeiten dieser Experimente weiter auszubauen und wiederkehrende problematische Artefakte zu vermeiden, haben wir 2011 einfache Mikrofluidik in diese Assays eingeführt. Diese Studie beschreibt unser grundlegendes Protokoll, bei dem einzelne Aktinfilamente an einem Ende an der passivierten Deckglasoberfläche verankert sind, sich an der Strömung ausrichten und nacheinander verschiedenen Proteinlösungen ausgesetzt werden können. Wir stellen auch die Protokolle für spezifische Anwendungen vor und erklären, wie kontrollierte mechanische Kräfte dank des viskosen Widerstands der fließenden Lösung angewendet werden können. Wir heben die technischen Vorbehalte dieser Experimente hervor und stellen kurz mögliche Entwicklungen vor, die auf dieser Technik basieren. Diese Protokolle und Erklärungen, zusammen mit der heutigen Verfügbarkeit von einfach zu bedienenden Mikrofluidikgeräten, sollten es Nicht-Spezialisten ermöglichen, diesen Assay in ihren Labors zu implementieren.
Introduction
Der Auf- und Abbau von Aktinfilamenten und Aktinfilamentnetzwerken wird durch mehrere biochemische Reaktionen gesteuert und hängt vom mechanischen Kontext ab. Um Einblick in diese komplexen Mechanismen zu erhalten, ist es von unschätzbarem Wert, einzelne Reaktionen auf einzelne Filamente (in ausreichend großer Anzahl) beobachten zu können. In den letzten Jahrzehnten hat sich die Beobachtung dynamischer Aktinfilamente in Echtzeit, meist unter Verwendung der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence), zu einer Schlüsseltechnik entwickelt und eine beeindruckende Liste von Ergebnissen geliefert, die mit biochemischen Assays in Bulk-Lösung nicht hätten erzielt werden können1.
Um dies zu erreichen, muss man fluoreszierend markierte Aktinfilamente nahe an der Oberfläche des Mikroskop-Deckglases halten, während man sie Lösungen von aktinbindenden Proteinen (ABPs) aussetzt, die auch fluoreszierend markiert werden können. Auf diese Weise können Ereignisse an einzelnen Filamenten unter gut kontrollierten biochemischen Bedingungen überwacht und so die Reaktionsgeschwindigkeiten quantifiziert werden. Es sollten jedoch eine Reihe spezifischer Einschränkungen in Betracht gezogen werden. Die künstliche Aufrechterhaltung von Filamenten in der Nähe der Oberfläche, oft dank mehrerer Verankerungspunkte oder durch die Verwendung eines Überfüllungsmittels wie Methylcellulose, kann ihr Verhalten verändern (z. B. Pausen in ihrer Polymerisation und Depolymerisationverursachen 2). Die Verfolgung der Kontur jedes Filaments kann eine Herausforderung darstellen, insbesondere wenn sich im Laufe der Zeit neue Filamente oder Filamentfragmente im Sichtfeld ansammeln. Die Reaktionen finden in einem endlichen Volumen statt, in dem die Konzentration von Aktinmonomeren und ABPs im Laufe der Zeit variieren kann, was es möglicherweise schwierig macht, genaue Geschwindigkeitskonstanten abzuleiten. Schließlich ist die Erneuerung oder Änderung der Lösung von ABPs in weniger als 30 s schwierig zu erreichen und führt oft zu einem inhomogenen Proteingehalt in der Probe.
Vor etwas mehr als 10 Jahren, inspiriert von dem, was bereits getan wurde, um einzelne Desoxyribonukleinsäure (DNA) Stränge3 zu untersuchen, führten wir eine neue Technik ein, die auf Mikrofluidik basiert, um einzelne Aktinfilamente zu beobachten und zu manipulieren4. Es erlaubt einem, die oben genannten Einschränkungen klassischer Single-Filament-Techniken zu umgehen. In diesen Mikrofluidik-Assays werden Aktinfilamente aus Spektrin-Aktin-Samen gezüchtet, die auf dem Deckglas adsorbiert sind. Filamente werden somit von einem Ende nur am Boden der mikrofluidischen Kammer verankert und schwanken über der Oberfläche, ohne zu kleben. Filamente richten sich an den Fluss eingehender Lösungen aus, erleichtern so die Überwachung ihrer Konturlänge und halten sie in einem flachen Bereich über dem Deckglas, in dem TIRF verwendet werden kann. Verschiedene Lösungen fließen gleichzeitig in die Kammer, ohne zu mischen, und die Filamente können ihnen nacheinander und schnell ausgesetzt werden.
Hier schlagen wir eine Reihe grundlegender Protokolle vor, um Einzelaktin-Filament-Mikrofluidik-Assays im Labor einzurichten. Deckgläser und Mikrofluidikkammern können im Voraus (in einem halben Tag) vorbereitet werden, und das Experiment selbst, bei dem mehrere biochemische Bedingungen getestet werden können, ist in weniger als einem Tag abgeschlossen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Vergleich zu Standard-Single-Filament-Verfahren, bei denen Aktinfilamente entlang ihrer Länge durch mehrere Punkte an der Oberfläche verankert oder durch ein Crowding-Mittel wie Methylcellulose nahe an der Oberfläche gehalten werden, bietet die Mikrofluidik eine Reihe von Vorteilen. Da die Wechselwirkungen mit der Oberfläche minimal sind, werden die künstlichen Pausen, die diese Wechselwirkungen sowohl während der Dehnung als auch der Depolymerisation auslösen können, vermieden. Die Filamente werden durch die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den B. Ladoux und R.-M. Mège Labor für die Verwendung ihrer UV-Reiniger Ausrüstung, und J. Heuvingh und 0. du Roure für die erste Schulung, die wir über die Vorbereitung von Formen auf Siliziumwafern und die Bereitstellung von Tipps zur Mikrofluidik erhalten haben. Wir danken für die Förderung durch den Europäischen Forschungsratszuschuss StG-679116 (an A.J.) und die Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin und Conformin (an G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
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