Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.
Aktin filamentlerinin montajını ve sökülmesini düzenleyen karmaşık moleküler mekanizmaları deşifre etmek için, iyi kontrol edilen koşullarda yaşayan bireysel reaksiyonları izlemek büyük bir varlıktır. Bunu yapmak için, son 20 yılda, çoğunlukla toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak canlı tek filament deneyleri ortaya çıkmış ve bir dizi önemli sonuç sağlamıştır. 2011 yılında, bu deneylerin olanaklarını daha da genişletmek ve tekrarlayan sorunlu eserlerden kaçınmak için, bu testlere basit mikroakışkanlar getirdik. Bu çalışma, bireysel aktin filamentlerinin pasifleştirilmiş örtü kayma yüzeyine bir ucuyla tutturulduğu, akışla hizalandığı ve farklı protein çözeltilerine art arda maruz bırakılabildiği temel protokolümüzü detaylandırmaktadır. Ayrıca belirli uygulamalar için protokolleri sunuyoruz ve akan çözeltinin viskoz sürtünmesi sayesinde kontrollü mekanik kuvvetlerin nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Bu deneylerin teknik uyarılarını vurguluyoruz ve bu tekniğe dayanan olası gelişmeleri kısaca sunuyoruz. Bu protokoller ve açıklamalar, günümüzde kullanımı kolay mikroakışkan ekipmanlarının mevcudiyeti ile birlikte, uzman olmayanların bu testi laboratuvarlarında uygulamalarına izin vermelidir.
Aktin filamentlerinin ve aktin filament ağlarının montajı ve sökülmesi, çeşitli biyokimyasal reaksiyonlarla kontrol edilir ve mekanik bağlama bağlıdır. Bu karmaşık mekanizmalar hakkında fikir edinmek için, bireysel filamentler üzerindeki bireysel reaksiyonları (yeterince büyük sayılarda) gözlemleyebilmek paha biçilmezdir. Son yıllarda, dinamik aktin filamentlerinin gerçek zamanlı olarak, çoğunlukla toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak gözlemlenmesi, anahtar bir teknik olarak ortaya çıkmış ve toplu çözelti biyokimyasal tahlilleri ile elde edilemeyen sonuçların etkileyici bir listesini sağlamıştır1.
Bunu başarmak için, floresan olarak etiketlenmiş aktin filamentlerini mikroskop kapağının yüzeyine yakın tutmak ve bunları floresan olarak etiketlenebilen aktin bağlayıcı proteinlerin (ABP’ler) çözeltilerine maruz bırakmak gerekir. Bunu yapmak, iyi kontrol edilen biyokimyasal koşullarda bireysel filamentlerde meydana gelen olayları izlemek ve böylece reaksiyon hızlarını ölçmek için bir araç sağlar. Bununla birlikte, bir dizi özel sınırlama dikkate alınmalıdır. Filamentlerin yüzeye yakın yapay olarak korunması, genellikle birden fazla sabitleme noktası sayesinde veya metilselüloz gibi bir kalabalık ajan kullanarak, davranışlarını değiştirebilir (örneğin, polimerizasyon ve depolimerizasyonda duraklamalara neden olabilir2). Her bir filamentin konturunu izlemek, özellikle de zaman içinde görüş alanında yeni filamentler veya filament parçaları birikirse, zor olabilir. Reaksiyonlar, aktin monomerlerinin ve ABP’lerin konsantrasyonunun zamanla değişebileceği sonlu bir hacimde gerçekleşir ve potansiyel olarak doğru hız sabitlerinin elde edilmesini zorlaştırır. Son olarak, ABP’lerin çözeltisinin yenilenmesi veya değiştirilmesi 30 saniyeden daha kısa sürede elde etmek zordur ve genellikle numunede homojen olmayan protein içeriğine yol açacaktır.
10 yıldan biraz daha uzun bir süre önce, bireysel Deoksiribonükleik Asit (DNA) iplikçikleri3’ü incelemek için zaten yapılanlardan esinlenerek, bireysel aktin filamentlerini gözlemlemek ve manipüle etmek için mikroakışkanlara dayanan yeni bir teknik sunduk4. Klasik tek filament tekniklerinin yukarıda belirtilen sınırlamalarını aşmaya izin verir. Bu mikroakışkan tahlillerinde, aktin filamentleri, kapak kayması üzerine adsorbe edilen spektrin-aktin tohumlarından yetiştirilir. Filamentler böylece bir uçtan sadece mikroakışkan odanın dibine sabitlenir ve yapışmadan yüzeyin üzerinde dalgalanır. Filamentler, gelen çözeltilerin akışıyla aynı hizadadır, böylece kontur uzunluklarının izlenmesini kolaylaştırır ve bunları TIRF’nin kullanılabileceği kapak kaymasının üzerindeki sığ bir bölgede tutar. Farklı çözeltiler aynı anda karıştırmadan odaya akar ve filamentler bunlara sırayla ve hızlı bir şekilde maruz bırakılabilir.
Burada, laboratuvarda tek aktin-filament mikroakışkan testleri oluşturmak için bir dizi temel protokol öneriyoruz. Kapaklar ve mikroakışkan odaları önceden hazırlanabilir (yarım gün içinde) ve birkaç biyokimyasal koşulun test edilebileceği deneyin kendisi bir günden daha kısa sürede yapılır.
Aktin filamentlerinin uzunlukları boyunca birden fazla nokta ile yüzeye tutturulduğu veya metilselüloz gibi bir kalabalık ajan tarafından yüzeye yakın tutulduğu standart tek filament yöntemleriyle karşılaştırıldığında, mikroakışkanlar bir dizi avantaj sunar. Yüzeyle etkileşimler minimum olduğundan, bu etkileşimlerin hem uzama hem de depolimerizasyon sırasında neden olabileceği yapay duraklamalardan kaçınılır. Filamentler, birbirlerine paralel olarak akış tarafından hizalanır, izlenmeler…
The authors have nothing to disclose.
B. Ladoux ve R.-M.’ye minnettarız. UV temizleyici ekipmanlarının kullanımı için Mège laboratuvarı ve J. Heuvingh ve 0. du Roure, silikon gofretler üzerinde kalıp hazırlama ve mikroakışkanlar hakkında ipuçları sağlama konusunda aldığımız ilk eğitim için. Avrupa Araştırma Konseyi Grant StG-679116 (A.J.’ye) ve Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin’den (G.R.-L.) gelen fonları kabul ediyoruz.
β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
ImageJ | NIH | N/A | open source software |
Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |