Bruke mikrofluidikk og fluorescensmikroskopi til å studere monteringsdynamikken til enkelt actinfilamenter og bunter

Summary

Vi presenterer protokoller for enkle aktinfilamentmikrofluidiske analyser, i kombinasjon med fluorescensmikroskopi, som gjør det mulig for en å nøyaktig overvåke individuelle aktinfilamenter i sanntid mens man sekvensielt utsetter dem for forskjellige proteinløsninger.

Abstract

For å dechiffrere de komplekse molekylære mekanismene som regulerer montering og demontering av aktinfilamenter, er det en stor ressurs å overvåke individuelle reaksjoner lever i godt kontrollerte forhold. For å gjøre det har levende enkeltfilamenteksperimenter dukket opp de siste 20 årene, for det meste ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, og har gitt en trove av viktige resultater. I 2011, for å ytterligere utvide mulighetene for disse eksperimentene og for å unngå tilbakevendende problematiske artefakter, introduserte vi enkel mikrofluidikk i disse analysene. Denne studien beskriver vår grunnleggende protokoll, der individuelle aktinfilamenter er forankret i den ene enden til den passiverte coverlipoverflaten, samsvarer med strømmen, og kan etterfølgende eksponeres for forskjellige proteinløsninger. Vi presenterer også protokollene for spesifikke applikasjoner og forklarer hvordan kontrollerte mekaniske krefter kan brukes, takket være den viskøse dra av den flytende løsningen. Vi fremhever de tekniske forbeholdene til disse eksperimentene og presenterer kort mulige utviklinger basert på denne teknikken. Disse protokollene og forklaringene, sammen med dagens tilgjengelighet av brukervennlig mikrofluidikkutstyr, bør tillate ikke-spesialister å implementere denne analysen i laboratoriene sine.

Introduction

Montering og demontering av aktinfilamenter og aktinfilamentnettverk styres av flere biokjemiske reaksjoner og avhenger av den mekaniske konteksten. For å få innsikt i disse komplekse mekanismene er det uvurderlig å kunne observere individuelle reaksjoner på individuelle filamenter (i tilstrekkelig store antall). I løpet av de siste tiårene har observasjonen av dynamiske aktinfilamenter i sanntid, for det meste ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, dukket opp som en nøkkelteknikk og har gitt en imponerende liste over resultater som ikke kunne ha blitt oppnådd med bulkløsning biokjemiske analyser¹.

For å oppnå dette må man opprettholde fluorescerende merkede aktinfilamenter nær overflaten av mikroskopdekslene mens man utsetter dem for løsninger av aktinbindende proteiner (ABPer), som også kan merkes fluorescerende. Dette gir et middel til å overvåke hendelser som finner sted på individuelle filamenter under godt kontrollerte biokjemiske forhold, og dermed kvantifisere reaksjonshastigheter. En rekke spesifikke begrensninger bør imidlertid vurderes. Kunstig vedlikehold av filamenter nær overflaten, ofte takket være flere forankringspunkter eller ved å bruke et trengselmiddel som metylcellulose, kan endre deres oppførsel (f.eks. forårsaker pauser i polymerisasjonen og depolymerisering²). Det kan være utfordrende å spore konturen til hver filament, spesielt hvis nye filamenter eller filamentfragmenter akkumuleres innen synsfeltet over tid. Reaksjonene skjer i et begrenset volum der konsentrasjonen av aktinmonomerer og ABPer kan variere over tid, noe som potensielt gjør det vanskelig å utlede nøyaktige hastighetskonstanter. Endelig er det vanskelig å fornye eller endre løsningen av ABPer på mindre enn 30 s og vil ofte føre til inhomogent proteininnhold i prøven.

For litt over 10 år siden, inspirert av det som allerede var gjort for å studere individuelle Deoxyribonucleic Acid (DNA) tråder³, introduserte vi en ny teknikk basert på mikrofluidikk for å observere og manipulere individuelle aktinfilamenter⁴. Det gjør det mulig å omgå de nevnte begrensningene i klassiske enkeltfilamentteknikker. I disse mikrofluidikkanalysene dyrkes aktinfilamenter fra spektrrin-aktinfrø adsorbert på dekslene. Filamenter er dermed forankret i den ene enden bare til bunnen av mikrofluidisk kammer og svinger over overflaten uten å stikke. Filamenter samsvarer med strømmen av innkommende løsninger, og letter dermed overvåkingen av konturlengden og opprettholder dem i et grunt område over dekslene der TIRF kan brukes. Ulike løsninger strømmes samtidig inn i kammeret uten blanding, og filamentene kan eksponeres for dem sekvensielt og raskt.

Her foreslår vi en rekke grunnleggende protokoller for å sette opp mikrofluidikkanalyser i laboratoriet. Deksler og mikrofluidikkkamre kan tilberedes på forhånd (på en halv dag), og selve eksperimentet, hvor flere biokjemiske forhold kan testes, gjøres på mindre enn en dag.

Protocol

1. Mikrofluidisk kammerpreparat Velg en SU-8 master mold med flere kammermønstre. Typiske kamre er kryssformede med tre viker og ett uttak, 20 μm høyt og 800 μm bredt (figur 1). Slike masterformer kan kjøpes fra eksterne selskaper eller gjøres i akademiske laboratorier (f.eks. Gicquel, Y. et al.5). Plasser tape rundt kanten av formen. Sett ~50 cm lang, 19 mm bred, standard gjennomsiktig kontortape (se Material…

Representative Results

For alle forsøkene beskrevet ovenfor, bør fluorescerende merket aktinfilamenter være tydelig synlige, med god kontrast, som indikerer lav bakgrunnsfluorescens fra overflaten (figur 4, se Tilleggsfil 1 for feilsøking av vanlige problemer). Actin filaments bør heller ikke holde seg til overflaten: Når den dominerende strømningshastigheten er lav, bør aktinfilamentenes laterale svingninger være merkbare når man observerer dem levende og la en tydelig bestemme at de ba…

Discussion

Sammenlignet med standard enkeltfilamentmetoder der aktinfilamenter er forankret til overflaten med flere punkter langs lengden eller opprettholdt nær den av et trengselmiddel som metylcellulose, gir mikrofluidikk en rekke fordeler. Siden interaksjoner med overflaten er minimale, unngås de kunstige pausene disse interaksjonene kan indusere under både forlengelse og depolymerisering. Filamentene er justert av strømmen, parallelt med hverandre, letter overvåkingen og målingen av lengdene. Løsningen rundt filamentene…

Materials

β-Casein	Merck	C6905	Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger)	Ted Pella	15115-2	ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA	Merck	A8549	Used at 1 mg/mL
BSA	Merck	A8022	Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack Teflon holder	Invitrogen	C14784	for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm Thickness #1.5	Menzel Gläser	631-1370
DABCO	Merck	D27802	component in f-buffer
DTT	Euromedex	EU0006-D	component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	21338	To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507	Glass cleaning detergent
ImageJ	NIH	N/A	open source software
Laboport	KNF	811kn.18	vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape	Scotch	7100024666	standard transparent office tape
Micrewtube	Simport	T341-6T	2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S	Fluigent	FLU-S-D-PCKB	Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ	Fluigent	EZ-11000001 EZ-00345001	Pressure controller
Model 42 – UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488	Jena Bioscience	NU-805-488	ATP-ATTO used to label actin
neutravidin	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)	Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer	Dow Corning	1673921	Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing	Merck	Z226661	“Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun	Coilhose Pneumatics	700-S	filtered air
Silicon tubing	VWR	228-0701P	connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler	Prime Bioscience	SC22/15	Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film	Sigma Aldrich	PM996	Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol	VWR	64-17-5
Ultrasonic cleaning bath	VWR	USC200TH	To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator	SP Bel-Art	F42022-0000	to degas the PDMS or solutions