Använda mikrofluidik och fluorescensmikroskopi för att studera monteringsdynamiken hos enstaka aktinfilament och buntar
Summary
Vi presenterar protokoll för enkla aktinfilamentmikrofluidiska analyser, i kombination med fluorescensmikroskopi, som gör att man exakt kan övervaka enskilda aktinfilament i realtid samtidigt som man sekventiellt utsätter dem för olika proteinlösningar.
Abstract
För att dechiffrera de komplexa molekylära mekanismerna som reglerar montering och demontering av aktinfilament är det en stor tillgång att övervaka individuella reaktioner som lever under välkontrollerade förhållanden. För att göra det har levande experiment med enfilament dykt upp under de senaste 20 åren, mestadels med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi, och har gett en mängd viktiga resultat. Under 2011, för att ytterligare utöka möjligheterna med dessa experiment och för att undvika återkommande problematiska artefakter, introducerade vi enkla mikrofluidik i dessa analyser. Denna studie beskriver vårt grundläggande protokoll, där enskilda aktinfilament förankras i ena änden till den passiverade täckglasytan, anpassar sig till flödet och kan successivt utsättas för olika proteinlösningar. Vi presenterar också protokollen för specifika applikationer och förklarar hur kontrollerade mekaniska krafter kan appliceras tack vare den strömmande lösningens viskösa drag. Vi lyfter fram de tekniska försiktighetsåtgärderna för dessa experiment och presenterar kortfattat möjliga utvecklingar baserade på denna teknik. Dessa protokoll och förklaringar, tillsammans med dagens tillgång till lättanvänd mikrofluidikutrustning, bör göra det möjligt för icke-specialister att implementera denna analys i sina laboratorier.
Introduction
Montering och demontering av aktinfilament och aktinfilamentnätverk styrs av flera biokemiska reaktioner och beror på det mekaniska sammanhanget. För att få insikt i dessa komplexa mekanismer är det ovärderligt att kunna observera individuella reaktioner på enskilda filament (i tillräckligt stort antal). Under de senaste decennierna har observationen av dynamiska aktinfilament i realtid, mestadels med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi, framstått som en nyckelteknik och har gett en imponerande lista över resultat som inte kunde ha erhållits med biokemiska analyser av bulklösning1.
För att uppnå detta måste man behålla fluorescerande märkta aktinfilament nära ytan på mikroskopets täckglas medan man utsätter dem för lösningar av aktinbindande proteiner (ABP), som också kan märkas fluorescerande. Att göra det ger ett sätt att övervaka händelser som äger rum på enskilda filament under välkontrollerade biokemiska förhållanden och därmed kvantifiera reaktionshastigheter. Ett antal specifika begränsningar bör dock övervägas. Artificiellt underhåll av filament nära ytan, ofta tack vare flera förankringspunkter eller genom att använda ett trängselmedel såsom metylcellulosa, kan förändra deras beteende (t.ex. orsaka pauser i deras polymerisation och depolymerisation2). Att spåra konturen för varje filament kan vara utmanande, särskilt om nya filament eller filamentfragment ackumuleras i synfältet över tiden. Reaktionerna sker i en ändlig volym där koncentrationen av aktinmonomerer och ABP kan variera över tid, vilket potentiellt gör det svårt att härleda exakta hastighetskonstanter. Slutligen är det svårt att förnya eller ändra lösningen av ABPs på mindre än 30 s och leder ofta till inhomogent proteininnehåll i provet.
För drygt 10 år sedan, inspirerade av vad som redan gjorts för att studera enskilda DNA-strängar (Deoxyribonukleinsyra) 3, introducerade vi en ny teknik baserad på mikrofluidik för att observera och manipulera enskilda aktinfilament4. Det gör att man kan kringgå de ovan nämnda begränsningarna för klassiska tekniker med enfilament. I dessa mikrofluidikanalyser odlas aktinfilament från spektrin-aktinfrön adsorberade på täckglaset. Filament förankras således av ena änden endast till botten av den mikrofluidiska kammaren och fluktuerar ovanför ytan utan att fastna. Filamenten anpassar sig till flödet av inkommande lösningar, vilket underlättar övervakningen av deras konturlängd och bibehåller dem i ett grunt område ovanför täckglaset där TIRF kan användas. Olika lösningar flödas samtidigt in i kammaren utan blandning, och filamenten kan utsättas för dem sekventiellt och snabbt.
Här föreslår vi en serie grundläggande protokoll för att ställa in mikrofluidikanalyser med en aktinfilament i labbet. Coverslips och mikrofluidikkammare kan förberedas i förväg (på en halv dag), och själva experimentet, där flera biokemiska förhållanden kan testas, görs på mindre än en dag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jämfört med vanliga metoder med enfilament där aktinfilament förankras på ytan med flera punkter längs deras längd eller hålls nära den av ett trängselmedel såsom metylcellulosa, erbjuder mikrofluidik ett antal fördelar. Eftersom interaktioner med ytan är minimala undviks de konstgjorda pauser som dessa interaktioner kan inducera under både förlängning och depolymerisation. Filamenten är inriktade på flödet, parallellt med varandra, vilket underlättar deras övervakning och mätning av deras längder….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot B. Ladoux och R.-M. Mège lab för användning av deras UV-renare utrustning, och J. Heuvingh och 0. du Roure för den inledande utbildningen vi fick om att förbereda formar på kiselskivor och ge tips om mikrofluidik. Vi erkänner finansiering från European Research Council Grant StG-679116 (till AJ) och Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin och Conformin (till G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
- Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
- Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
- Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
- Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
- Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
- Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
- Jégou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
- Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
- Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
- Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
- Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
- Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
- Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
- Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
- Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
- Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
- Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
- Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
- Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
- Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).
- Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
- Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
- Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).
