استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة
Summary
يصف هذا البروتوكول إعداد واستخدام شرائح الرئة المقطوعة بدقة للفأر لتقييم مجرى الهواء وانقباض العضلات الملساء الشريانية داخل الرئة في بيئة حية تقريبا.
Abstract
تتوسط خلايا العضلات الملساء (SMC) في تقلص مجرى الهواء والشريان داخل الرئة لتعديل مقاومة تدفق الهواء والدورة الدموية الرئوية ، على التوالي ، وبالتالي تلعب دورا حاسما في توازن الجهاز الرئوي. يساهم تحرير انقباض SMC في العديد من الأمراض الرئوية ، بما في ذلك الربو وارتفاع ضغط الدم الرئوي. ومع ذلك ، نظرا لمحدودية الوصول إلى الأنسجة وعدم وجود أنظمة استزراع للحفاظ على الأنماط الظاهرية SMC في الجسم الحي ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء انقباض SMC غير المنظم في هذه الأمراض لا تزال محددة بالكامل. توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) نموذجا خارج الجسم الحي يتحايل على هذه الصعوبات التقنية. كقسم أنسجة رئوية حي ورقيق ، يحتفظ PCLS ب SMC في المناطق الطبيعية المحيطة ويسمح في الموقع بتتبع تقلص SMC وإشارات Ca2 + داخل الخلايا التي تنظم انقباض SMC. هنا ، يتم توفير بروتوكول إعداد PCLS مفصل للماوس ، والذي يحافظ على الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة. يتضمن هذا البروتوكول خطوتين أساسيتين قبل إخضاع فص الرئة للتقطيع: تضخيم مجرى الهواء باستخدام الأغاروز منخفض الانصهار عبر القصبة الهوائية وملء الأوعية الرئوية بالجيلاتين من خلال البطين الأيمن. يمكن استخدام PCLS المعد باستخدام هذا البروتوكول للمقايسات الحيوية لتقييم تنظيم الانقباض بوساطة Ca2 + ل SMC في كل من مجرى الهواء ومقصورات الشرايين داخل الرئة. عند تطبيقه على نماذج الفئران لأمراض الجهاز التنفسي ، يمكن هذا البروتوكول من التحقيق الوظيفي ل SMC ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة على الآلية الأساسية لإزالة الانقباض SMC في الأمراض.
Introduction
خلية العضلات الملساء (SMC) هي نوع رئيسي من الخلايا الهيكلية في الرئة ، وتقيم في المقام الأول في الجدار الإعلامي للممرات الهوائية والأوعية الرئوية. تتعاقد SMCs لتغيير العيار المضيء ، وبالتالي تنظيم تدفق الهواء والدم 1,2. لذلك ، فإن التنظيم الانقباضي ل SMCs ضروري للحفاظ على توازن تهوية الهواء والدورة الدموية الرئوية. في المقابل ، يثير انقباض SMC الشاذ انسداد مجرى الهواء أو أمراض الأوعية الدموية الرئوية مثل الربو وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي. ومع ذلك ، فقد واجه التقييم الوظيفي ل SMCs الرئة تحديا بسبب محدودية الوصول إلى أنسجة الرئة ، وخاصة تلك الشعب الهوائية الصغيرة والأوعية الدقيقة في الجزء البعيد من الرئة 2,3. تلجأ الحلول الحالية إلى المقايسات غير المباشرة ، مثل قياس مقاومة تدفق الهواء بواسطة Flexivent لتعكس انقباض مجرى الهواء ، وفحص ضغط الدم الشرياني الرئوي عن طريق قسطرة القلب اليمنى لتقييم تقلص الأوعية الرئوية 4,5. ومع ذلك ، فإن هذه الفحوصات غير المباشرة لها عيوب متعددة ، مثل الارتباك بسبب العوامل الهيكلية ، والفشل في التقاط التنوع المكاني للمجرى الهوائي أو الاستجابات الوعائية في مقياس الرئة بأكمله 6,7 ، وغير مناسب للدراسة الميكانيكية للتنظيم الانقباضي على المستوى الخلوي. لذلك ، تم تطبيق طرق بديلة باستخدام الخلايا الأولية المعزولة ، أو شرائط عضلات القصبة الهوائية / الشعب الهوائية 8,9 ، أو شرائح الأوعية الدموية الكبيرة10 لدراسة SMC في المختبر. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لها قيود أيضا. على سبيل المثال ، فإن التكيف الظاهري السريع ل SMCs الأولية في حالة الثقافة11,12 يجعل من الصعب استقراء النتائج من زراعة الخلايا إلى إعدادات الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يمثل النمط الظاهري المقلص ل SMCs في مجرى الهواء القريب المعزول أو الأجزاء الوعائية SMCs في الرئة البعيدة 6,7. علاوة على ذلك ، يظل قياس قوة العضلات على مستوى الأنسجة منفصلا عن الأحداث الجزيئية والخلوية الضرورية للرؤية الميكانيكية لتنظيم الانقباض.
توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS)، وهي قسم أنسجة رئوية حية، أداة مثالية خارج الجسم الحي لتوصيف SMCs الرئوية في بيئة دقيقة قريبة من الجسم الحي (أي البنية والتفاعل متعدد الخلايا المحفوظة)13. منذ أن قدم الدكتوران بلاكي وفيشر لأول مرة إعداد شرائح الرئة من رئتي الفئران والهامستر المنفوخة بالأغاروز في1980s 14,15 ، تم تطوير هذه التقنية باستمرار لتزويد PCLSs بجودة أعلى وتنوع أكبر للبحوث الطبية الحيوية. أحد التحسينات الهامة هو تعزيز الحفاظ على الشرايين الرئوية عن طريق ضخ الجيلاتين بالإضافة إلى تضخم الرئة مع الأغاروز عبر القصبة الهوائية. ونتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على كل من مجرى الهواء والشرايين الرئوية سليمة في PCLS لتقييم خارج الجسم الحي 16. علاوة على ذلك ، فإن PCLS قابل للتطبيق لفترة طويلة في الثقافة. على سبيل المثال ، لم يكن لدى PCLSs الفئران أي تغيير كبير في صلاحية الخلايا والتمثيل الغذائي لمدة لا تقل عن 12 يوما في الثقافة ، وكذلك احتفظت بانقباض مجرى الهواء لمدة تصل إلى 7 أيام17. بالإضافة إلى ذلك ، يحتفظ PCLS بممرات هوائية أو أوعية مختلفة الأحجام لفحوصات الانكماش والاسترخاء. علاوة على ذلك ، يمكن فحص إشارات Ca 2 + داخل الخلايا ل SMCs ، العامل المحدد لانقباض الخلايا ، باستخدام أصباغ مراسل Ca 2+ التي تم تصويرها بواسطة مجهر متحد البؤرة أو2-photon 13.
بالنظر إلى التطبيق المكثف لنموذج الماوس في أبحاث الرئة ، يتم وصف بروتوكول مفصل هنا لإعداد PCLS للفأر مع الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة لأبحاث الرئة خارج الجسم الحي . باستخدام PCLSs المعدة ، أوضحنا لاحقا كيفية تقييم استجابات مجرى الهواء والشرايين الرئوية للمحفزات الانقباضية أو المرخية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا وصف طريقة تحميل PCLS بصبغة مراسل Ca2 + ثم تصوير إشارات Ca2 + ل SMCs المرتبطة بالاستجابات الانقباضية أو المرخية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتضمن إعداد PCLS عدة خطوات حاسمة. أولا ، من الضروري تضخيم فص الرئة بشكل متجانس لتجنب اختلاف تصلب الأنسجة عن توزيع الأغاروز غير المتساوي. نظرا لأن الأغاروز السائل يتدفق بسرعة في القسطرة الرقيقة أو الشعب الهوائية عند درجة حرارة أقل من 37 درجة مئوية ، فإن عيب الملء الناتج في مجال الرئة البعيد يم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة ، K08135443 (Y.B) ، 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
- Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
- Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
- Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
- McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
- Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
- Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
- Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
- Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
- Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
- Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
- Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
- Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
- Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
- Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
- Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
- Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
- Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
- Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
- Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
- Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
- Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
- Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
- Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
- Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).
