Использование прецизионно разрезанного среза легких для изучения сократительной регуляции дыхательных путей и внутрилегочных артериальных гладких мышц
Summary
Настоящий протокол описывает подготовку и использование прецизионных срезов легких мышей для оценки сократимости дыхательных путей и внутрилегочных артерий гладкой мускулатуры в среде почти in vivo .
Abstract
Гладкомышечные клетки (SMC) опосредуют сокращение дыхательных путей и внутрилегочной артерии для изменения сопротивления воздушного потока и легочного кровообращения соответственно, играя, следовательно, играя решающую роль в гомеостазе легочной системы. Дерегуляции сократимости СМЦ способствует развитию ряда легочных заболеваний, включая астму и легочную гипертензию. Однако из-за ограниченного доступа к тканям и отсутствия систем культивирования для поддержания фенотипов SMC in vivo молекулярные механизмы, лежащие в основе дерегулированной сократимости SMC при этих заболеваниях, остаются полностью идентифицированными. Прецизионный срез легких (PCLS) предлагает модель ex vivo , которая обходит эти технические трудности. Как живой, тонкий участок легочной ткани, PCLS сохраняет SMC в естественной среде и позволяет in situ отслеживать сокращение SMC и внутриклеточную передачу сигналов Ca2 + , которая регулирует сократимость SMC. Здесь представлен подробный протокол подготовки PCLS для мыши, который сохраняет интактные дыхательные пути и внутрилегочные артерии. Этот протокол включает в себя два основных шага перед тем, как подвергнуть долю легкого нарезке: надувание дыхательных путей агарозой с низкой температурой плавления через трахею и заполнение легочных сосудов желатином через правый желудочек. PCLS, приготовленный с использованием этого протокола, может быть использован для биоанализов для оценки Ca2+ -опосредованной сократительной регуляции SMC как в дыхательных путях, так и во внутрилегочных артериальных компартментах. При применении к мышиным моделям респираторных заболеваний этот протокол позволяет проводить функциональное исследование SMC, тем самым давая представление о базовом механизме дерегуляции сократимости SMC при заболеваниях.
Introduction
Гладкомышечные клетки (SMC) являются основным типом структурных клеток в легких, в основном находящихся в медиа-стенке дыхательных путей и легочных сосудов. SMC сокращаются, чтобы изменить просветный калибр, тем самым регулируя воздух и кровоток 1,2. Поэтому сократительная регуляция SMC имеет важное значение для поддержания гомеостаза вентиляции воздуха и легочного кровообращения. Напротив, аберрантная сократимость SMC провоцирует обструктивные заболевания дыхательных путей или легочных сосудов, такие как астма и легочная артериальная гипертензия. Однако функциональная оценка легких SMC была затруднена ограниченным доступом к легочной ткани, особенно к тем небольшим дыхательным путям и микрососудам в дистальной части легкого 2,3. Современные решения прибегают к косвенным анализам, таким как измерение сопротивления воздушного потока Flexivent для отражения сужения дыхательных путей и проверка легочного артериального артериального давления путем катетеризации правого сердца для оценки легочной вазоконтракции 4,5. Тем не менее, эти косвенные анализы имеют множество недостатков, таких как смешение структурных факторов, неспособность охватить пространственное разнообразие дыхательных путей или сосудистых реакций во всей шкале легких 6,7 и непригодность для механистического изучения сократительной регуляции на клеточном уровне. Поэтому для исследования SMC in vitro были применены альтернативные подходы с использованием изолированных первичных клеток, полосок мышц трахеи/бронхов 8,9 или крупных сосудистых сегментов10. Тем не менее, эти методы также имеют ограничения. Например, быстрая фенотипическая адаптация первичных SMC в условиях культуры 11,12 делает проблематичным экстраполяцию результатов из клеточной культуры в условия in vivo. Кроме того, сократительный фенотип SMC в изолированных проксимальных дыхательных путях или сосудистых сегментах может не представлять собой SMC в дистальном легком 6,7. Более того, измерение мышечной силы на тканевом уровне остается диссоциированным от молекулярных и клеточных событий, которые необходимы для механистического понимания сократительной регуляции.
Прецизионно разрезанный срез легкого (PCLS), живой участок легочной ткани, обеспечивает идеальный инструмент ex vivo для характеристики легочных SMC в микросреде, близкой к in vivo (т.е. сохраненной многоклеточной архитектуре и взаимодействии)13. С тех пор, как доктора Плаке и Фишер впервые представили приготовление легких срезов из надутых агарозой легких крыс и хомяков в 1980-х годах 14,15, этот метод постоянно развивался, чтобы обеспечить PSS более высоким качеством и большей универсальностью для биомедицинских исследований. Одним из значительных улучшений является усиление сохранения легочных артерий путем инфузии желатина в дополнение к надуванию легких агарозой через трахею. В результате как дыхательные пути, так и легочные артерии остаются нетронутыми в PCLS для оценки ex vivo 16. Кроме того, PCLS жизнеспособна в течение длительного времени в культуре. Например, у мышиных PSS не было значительных изменений жизнеспособности клеток и метаболизма в течение как минимум 12 дней в культуре, а также они сохраняли сократимость дыхательных путей до 7 дней17. Кроме того, PCLS сохраняет дыхательные пути или сосуды разного размера для анализа сокращения и релаксации. Кроме того, внутриклеточные сигналы Ca2+ SMC, детерминантный фактор сократимости клеток, могут быть проанализированы с помощью репортерных красителей Ca2+, визуализированных конфокальным или 2-фотонным микроскопом13.
Учитывая широкое применение мышиной модели в исследованиях легких, здесь описан подробный протокол подготовки ПКЛС мыши с интактными дыхательными путями и внутрилегочными артериями для исследования легких ex vivo . Используя подготовленные PSCL, мы впоследствии продемонстрировали, как оценивать реакции дыхательных путей и легочных артерий на констриктивные или релаксантные стимулы. Кроме того, описан способ загрузки PCLS репортерным красителем Ca2+ и последующей визуализации сигналов Ca2+ SMC, связанных со сократительными или релаксантными реакциями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подготовка PCLS включает в себя несколько критических этапов. Во-первых, важно равномерно надувать долю легкого, чтобы избежать изменения жесткости тканей от неравномерного распределения агарозы. Поскольку жидкая агароза быстро гелится в тонких катетерах или дыхательных путях при темп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается грантами NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
- Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
- Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
- Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
- McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
- Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
- Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
- Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
- Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
- Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
- Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
- Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
- Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
- Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
- Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
- Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
- Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
- Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
- Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
- Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
- Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
- Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
- Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
- Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
- Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).
