Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Verwendung von präzise geschnittenen Lungenschnitten der Maus zur Beurteilung der Kontraktilität der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur in einem nahezu in vivo Milieu.
Abstract
Glatte Muskelzellen (SMC) vermitteln die Kontraktion der Atemwege und der intrapulmonalen Arterie, um den Luftströmungswiderstand bzw. die Lungenzirkulation zu modifizieren, und spielen somit eine entscheidende Rolle in der Homöostase des Lungensystems. Die Deregulation der SMC-Kontraktilität trägt zu mehreren Lungenerkrankungen bei, einschließlich Asthma und pulmonaler Hypertonie. Aufgrund des begrenzten Gewebezugangs und des Mangels an Kultursystemen zur Aufrechterhaltung von In-vivo-SMC-Phänotypen bleiben molekulare Mechanismen, die der deregulierten SMC-Kontraktilität bei diesen Krankheiten zugrunde liegen, jedoch vollständig identifiziert. Die präzisionsgeschnittene Lungenscheibe (PCLS) bietet ein Ex-vivo-Modell , das diese technischen Schwierigkeiten umgeht. Als lebender, dünner Lungengewebeschnitt behält das PCLS SMC in natürlicher Umgebung und ermöglicht die In-situ-Verfolgung der SMC-Kontraktion und der intrazellulären Ca 2 + -Signalgebung, die dieSMC-Kontraktilität reguliert. Hier wird ein detailliertes PCLS-Vorbereitungsprotokoll für die Maus bereitgestellt, das intakte Atemwege und intrapulmonale Arterien bewahrt. Dieses Protokoll umfasst zwei wesentliche Schritte, bevor der Lungenlappen dem Schneiden unterzogen wird: Aufblasen der Atemwege mit Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch die Luftröhre und Auffüllen der Lungengefäße mit Gelatine durch den rechten Ventrikel. Das mit diesem Protokoll hergestellte PCLS kann für Bioassays verwendet werden, um die Ca2+-vermittelte kontraktile Regulation von SMC sowohl in den Atemwegen als auch in den intrapulmonalen arteriellen Kompartimenten zu bewerten. Bei der Anwendung auf Mausmodelle von Atemwegserkrankungen ermöglicht dieses Protokoll die funktionelle Untersuchung von SMC und gibt so Einblick in den zugrunde liegenden Mechanismus der SMC-Kontraktilitätsderegulierung bei Krankheiten.
Introduction
Die glatte Muskelzelle (SMC) ist ein wichtiger struktureller Zelltyp in der Lunge, der sich hauptsächlich in der Medienwand der Atemwege und Lungengefäße befindet. SMCs ziehen sich zusammen, um das luminale Kaliber zu verändern und so den Luft- und Blutfluss zu regulieren 1,2. Daher ist die kontraktile Regulierung von SMCs unerlässlich, um die Homöostase der Luftbelüftung und der Lungenzirkulation aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu provoziert die aberrante SMC-Kontraktilität obstruktive Atemwegs- oder pulmonale Gefäßerkrankungen wie Asthma und pulmonale arterielle Hypertonie. Die funktionelle Beurteilung von Lungen-SMCs wurde jedoch durch den begrenzten Zugang zum Lungengewebe in Frage gestellt, insbesondere zu den kleinen Atemwegen und Mikrogefäßen im distalen Teil der Lunge 2,3. Aktuelle Lösungen greifen auf indirekte Assays zurück, wie z.B. die Messung des Luftstromwiderstands durch Flexivent, um die Verengung der Atemwege zu reflektieren, und die Überprüfung des pulmonalen arteriellen Blutdrucks durch Rechtsherzkatheterisierung zur Beurteilung der pulmonalen Vasokontraktion 4,5. Diese indirekten Assays haben jedoch mehrere Nachteile, wie z.B. strukturelle Faktoren zu verwirren, die räumliche Vielfalt der Atemwegs- oder Gefäßreaktionen in der gesamten Lungenskala nicht zu erfassen 6,7 und sind für die mechanistische Untersuchung der kontraktilen Regulation auf zellulärer Ebene ungeeignet. Daher wurden alternative Ansätze mit isolierten Primärzellen, Luftröhren-/Bronchi-Muskelstreifen 8,9 oder großen Gefäßsegmenten10 für die SMC-Studie in vitro angewendet. Dennoch haben diese Methoden auch Grenzen. Zum Beispiel macht es eine schnelle phänotypische Anpassung primärer SMCs im Kulturzustand11,12 problematisch, Befunde aus der Zellkultur auf In-vivo-Einstellungen zu extrapolieren. Darüber hinaus kann der kontraktile Phänotyp von SMCs in den isolierten proximalen Atemwegs- oder Gefäßsegmenten nicht die SMCs in der distalen Lungedarstellen 6,7. Darüber hinaus bleibt die Muskelkraftmessung auf Gewebeebene von molekularen und zellulären Ereignissen getrennt, die für den mechanistischen Einblick in die kontraktile Regulation unerlässlich sind.
Precision-cut lung slice (PCLS), ein lebender Lungengewebeabschnitt, bietet ein ideales Ex-vivo-Werkzeug zur Charakterisierung pulmonaler SMCs in einer nahezu in vivo Mikroumgebung (d. h. erhaltene multizelluläre Architektur und Interaktion)13. Seit Dr. Placke und Dr. Fisher in den 1980er Jahren erstmals die Herstellung von Lungenscheiben aus mit Agarose aufgeblasenen Ratten- und Hamsterlungen eingeführt haben14,15, wurde diese Technik kontinuierlich weiterentwickelt, um PCLS eine höhere Qualität und größere Vielseitigkeit für die biomedizinische Forschung zu bieten. Eine signifikante Verbesserung ist die Verbesserung der pulmonalen arteriellen Erhaltung durch Gelatineinfusion zusätzlich zur Lungeninflation mit Agarose über die Luftröhre. Infolgedessen werden sowohl die Atemwege als auch die Lungenarterien im PCLS für die Ex-vivo-Beurteilung intakt gehalten 16. Darüber hinaus ist das PCLS für eine längere Zeit in der Kultur lebensfähig. Zum Beispiel hatten Maus-PCLS für mindestens 12 Tage in Kultur keine signifikante Veränderung der Zelllebensfähigkeit und des Metabolismus, und sie behielten die Kontraktilität der Atemwege für bis zu 7 Tagebei 17. Darüber hinaus hält PCLS unterschiedlich große Atemwege oder Gefäße für Kontraktions- und Entspannungsassays. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Ca 2 + -Signalgebung von SMCs, dem Determinantenfaktor der Zellkontraktilität, mit Ca 2+ -Reporterfarbstoffen untersucht werden, die von einem konfokalen oder 2-Photonen-Mikroskop13 aufgenommen wurden.
Unter Berücksichtigung der umfangreichen Anwendung des Mausmodells in der Lungenforschung wird hier ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Maus-PCLS mit intakten Atemwegen und intrapulmonalen Arterien für die Ex-vivo-Lungenforschung beschrieben. Anhand der präparierten PCLS demonstrierten wir anschließend, wie die Reaktionen der Atemwege und der Lungenarterien auf konstriktive oder relaxante Reize bewertet werden können. Darüber hinaus wird auch das Verfahren beschrieben, das PCLS mit Ca 2 + -Reporterfarbstoff zu beladen und dann die Ca2 + -Signalgebung von SMCs in Verbindung mit kontraktilen oder relaxanten Reaktionen abzubilden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Vorbereitung von PCLS umfasst mehrere kritische Schritte. Erstens ist es wichtig, den Lungenlappen homogen aufzublasen, um die Variation der Gewebesteifigkeit durch ungleichmäßige Agaroseverteilung zu vermeiden. Da die flüssige Agarose bei einer Temperatur unter 37 °C schnell in dünnen Kathetern oder Atemwegen geliert, könnte der daraus resultierende Fülldefekt im distalen Lungenfeld die Disparität der Lungengewebesteifigkeit erhöhen und Geweberisse während des Vibratomabschnitts verursachen. Daher kann ge?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch NIH-Zuschüsse, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) unterstützt.
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
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