Het huidige protocol beschrijft het voorbereiden en gebruiken van precisiegesneden longplakken van muizen om de luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spiercontractiliteit in een bijna in vivo omgeving te beoordelen.
Gladde spiercellen (SMC) bemiddelen de samentrekking van de luchtwegen en de intrapulmonale slagader om respectievelijk de luchtstroomweerstand en de pulmonale circulatie te wijzigen, waardoor ze een cruciale rol spelen in de homeostase van het longsysteem. Deregulering van SMC-contractiliteit draagt bij aan verschillende longziekten, waaronder astma en pulmonale hypertensie. Vanwege de beperkte toegang tot weefsel en een gebrek aan kweeksystemen om in vivo SMC-fenotypen te behouden, blijven moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gedereguleerde SMC-contractiliteit bij deze ziekten echter volledig geïdentificeerd. De precision-cut lung slice (PCLS) biedt een ex vivo model dat deze technische problemen omzeilt. Als een levende, dunne longweefselsectie behoudt de PCLS SMC in een natuurlijke omgeving en maakt het in situ tracking van SMC-contractie en intracellulaire Ca2 + -signalering mogelijk die de SMC-contractiliteit reguleert. Hier wordt een gedetailleerd PCLS-voorbereidingsprotocol voor muizen verstrekt, dat intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders behoudt. Dit protocol omvat twee essentiële stappen voordat de longkwab aan snijwonden wordt onderworpen: het opblazen van de luchtweg met laagsmeltpunt agarose door de luchtpijp en het vullen van longvaten met gelatine door de rechter ventrikel. De PCLS bereid met behulp van dit protocol kan worden gebruikt voor bioassays om Ca2+-gemedieerde contractiele regulatie van SMC in zowel de luchtwegen als de intrapulmonale arteriële compartimenten te evalueren. Toegepast op muismodellen van luchtwegaandoeningen maakt dit protocol het functioneel onderzoek van SMC mogelijk, waardoor inzicht wordt verkregen in het onderliggende mechanisme van SMC-contractiliteitsderegulatie bij ziekten.
Gladde spiercel (SMC) is een belangrijk structureel celtype in de longen, voornamelijk woonachtig in de mediawand van luchtwegen en longvaten. SMC’s trekken samen om het luminale kaliber te veranderen, waardoor de lucht- en bloedstroomwordt geregeld 1,2. Daarom is contractiele regulatie van SMC’s essentieel om de homeostase van luchtventilatie en pulmonale circulatie te behouden. Afwijkende SMC-contractiliteit daarentegen veroorzaakt obstructieve luchtweg- of pulmonale vaatziekten zoals astma en pulmonale arteriële hypertensie. De functionele beoordeling van long-SMC’s is echter uitgedaagd door beperkte toegang tot het longweefsel, met name die kleine luchtwegen en microvessels in het distale deel van de long 2,3. Huidige oplossingen nemen hun toevlucht tot indirecte testen, zoals het meten van luchtstroomweerstand door Flexivent om luchtwegvernauwing te weerspiegelen, en het controleren van pulmonale arteriële bloeddruk door rechterhartkatheterisatie om pulmonale vasocontractie te beoordelen 4,5. Deze indirecte testen hebben echter meerdere nadelen, zoals verward worden door structurele factoren, het niet vastleggen van de ruimtelijke diversiteit van luchtweg- of vasculaire reacties in de hele longschaal 6,7, en ongeschikt voor de mechanistische studie van contractiele regulatie op cellulair niveau. Daarom zijn alternatieve benaderingen met behulp van geïsoleerde primaire cellen, luchtpijp /bronchiën spierstrips 8,9 of grote vasculaire segmenten10 toegepast voor de SMC-studie in vitro. Toch hebben deze methoden ook beperkingen. Een snelle fenotypische aanpassing van primaire SMC’s in de kweekconditie11,12 maakt het bijvoorbeeld problematisch om bevindingen uit celcultuur naar in vivo instellingen te extrapoleren. Bovendien vertegenwoordigt het contractiele fenotype van SMC’s in de geïsoleerde proximale luchtweg- of vasculaire segmenten mogelijk niet de SMC’s in de distale long 6,7. Bovendien blijft de spierkrachtmeting op weefselniveau losgekoppeld van moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die essentieel zijn voor mechanistisch inzicht in contractiele regulatie.
Precision-cut lung slice (PCLS), een levend longweefselgedeelte, biedt een ideaal ex vivo hulpmiddel om pulmonale SMC’s te karakteriseren in een bijna in vivo micro-omgeving (d.w.z. bewaarde multicellulaire architectuur en interactie)13. Sinds Drs. Placke en Fisher voor het eerst de bereiding van longplakken van agarose-opgeblazen ratten- en hamsterlongen introduceerden in de jaren1980 14,15, is deze techniek voortdurend geavanceerd om PCLS’en te voorzien van hogere kwaliteit en grotere veelzijdigheid voor biomedisch onderzoek. Een belangrijke verbetering is de verbetering van pulmonale arteriële conservering door gelatine-infusie naast longinflatie met agarose via de luchtpijp. Als gevolg hiervan worden zowel de luchtweg als de longslagader intact gehouden in de PCLS voor ex vivo beoordeling16. Bovendien is de PCLS levensvatbaar voor een langere tijd in cultuur. Bijvoorbeeld, muis PCLS’en hadden geen significante verandering in de levensvatbaarheid van de cel en het metabolisme gedurende minimaal 12 dagen in cultuur, evenals, ze behielden de contractiliteit van de luchtwegen gedurende maximaal 7 dagen17. Bovendien houdt PCLS luchtwegen of bloedvaten van verschillende grootte bij voor contractie- en ontspanningstests. Bovendien kan intracellulaire Ca2+ signalering van SMC’s, de determinante factor van celcontractiliteit, worden getest met Ca2+ reporterkleurstoffen afgebeeld door een confocale of 2-fotonenmicroscoop13.
Gezien de uitgebreide toepassing van het muismodel in longonderzoek, wordt hier een gedetailleerd protocol beschreven voor het voorbereiden van muis PCLS met intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders voor ex vivo longonderzoek. Met behulp van de voorbereide PCLS’en hebben we vervolgens aangetoond hoe we de luchtweg- en pulmonale arteriële reacties op vernauwende of ontspannende stimuli kunnen evalueren. Daarnaast wordt ook de methode beschreven om de PCLS te laden met Ca2+ reporterkleurstof en vervolgens Ca2+ signalering van SMC’s geassocieerd met contractiele of relaxante reacties in beeld te brengen.
De voorbereiding van PCLS omvat verschillende kritieke stappen. Ten eerste is het essentieel om de longkwab homogeen op te blazen om de variatie van weefselstijfheid door ongelijke agaroseverdeling te voorkomen. Aangezien de vloeistof snel in dunne katheters of luchtwegen gels bij een temperatuur onder 37 °C, kan het resulterende vuldefect in het distale longveld de ongelijkheid van longweefselstijfheid vergroten en weefselscheuren veroorzaken tijdens de vibratomsectie. Daarom kan worden geoefend om de laagsmeltende aga…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
1 mL syringe | BD | 309626 | |
15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
3 mL syringe | BD | 309585 | |
50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |