הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .
תאי שריר חלקים (SMC) מתווכים את התכווצות דרכי הנשימה ואת העורק התוך-פולמונרי כדי לשנות את ההתנגדות לזרימת האוויר ואת זרימת הדם הריאתית, בהתאמה, ומכאן ממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס של מערכת הריאה. דה-רגולציה של התכווצות SMC תורמת למספר מחלות ריאה, כולל אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי. עם זאת, בשל גישה מוגבלת לרקמות והיעדר מערכות תרבית לשמירה על פנוטיפים של in vivo SMC, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התכווצות SMC ללא פיקוח במחלות אלה נותרים מזוהים במלואם. פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) מציעה מודל ex vivo שעוקף את הקשיים הטכניים הללו. כמקטע רקמת ריאה חי ודק, ה-PCLS שומר על SMC בסביבה טבעית ומאפשר מעקב באתרו אחר התכווצות SMC ואיתות Ca2+ תוך-תאי המווסת את התכווצות ה-SMC. כאן, פרוטוקול הכנה מפורט של PCLS עכבר מסופק, אשר משמר דרכי אוויר שלמות ועורקים intrapulmonary. פרוטוקול זה כולל שני שלבים חיוניים לפני הכפפת אונת הריאה לחיתוך: ניפוח דרכי הנשימה עם אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה דרך קנה הנשימה ומילוי כלי ריאתיים בג’לטין דרך החדר הימני. ה- PCLS שהוכן באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש לבדיקות ביולוגיות כדי להעריך את ויסות ההתכווצות בתיווך Ca2+ של SMC הן בדרכי הנשימה והן בתאי העורקים התוך-פולמונריים. כאשר הוא מיושם על מודלים של עכברים של מחלות בדרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר חקירה תפקודית של SMC, ובכך מספק תובנה לגבי המנגנון הבסיסי של דה-רגולציה של התכווצות SMC במחלות.
תא שריר חלק (SMC) הוא סוג של תא מבני עיקרי בריאה, השוכן בעיקר בדופן המדיה של דרכי הנשימה וכלי הדם הריאתיים. עסקים קטנים ובינוניים מתכווצים כדי לשנות את קליבר הלומינלי, ובכך לווסת את זרימת האוויר והדם 1,2. לכן, ויסות התכווצות של SMCs חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס של אוורור אוויר וזרימת ריאות. לעומת זאת, התכווצות SMC חריגה מעוררת מחלות חסימתיות בדרכי הנשימה או בכלי הדם הריאתיים כמו אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי עורקי. עם זאת, ההערכה התפקודית של SMCs של הריאה אותגרה על ידי גישה מוגבלת לרקמת הריאה, במיוחד אלה דרכי הנשימה הקטנות והמיקרו-ווסלים בחלק הדיסטלי של הריאה 2,3. הפתרונות הנוכחיים משתמשים בבדיקות עקיפות, כגון מדידת עמידות זרימת האוויר על ידי Flexivent כדי לשקף התכווצות דרכי הנשימה, ובדיקת לחץ דם עורקי ריאתי על ידי צנתור לב ימין כדי להעריך את כלי הדם הריאתיים 4,5. עם זאת, לבדיקות עקיפות אלה יש חסרונות מרובים, כגון בלבול על ידי גורמים מבניים, כישלון ללכוד את המגוון המרחבי של תגובות דרכי הנשימה או כלי הדם בכל סולם הריאות 6,7, ובלתי מתאים למחקר המכניסטי של ויסות התכווצות ברמה התאית. לכן, גישות חלופיות המשתמשות בתאים ראשוניים מבודדים, רצועות שריר קנה הנשימה/ברונכי 8,9, או מקטעי כלי דם גדולים10 יושמו עבור מחקר SMC במבחנה. עם זאת, לשיטות אלה יש גם מגבלות. לדוגמה, התאמה פנוטיפית מהירה של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים בתנאי התרבית11,12 הופכת את זה לבעייתי לאקסטרפולציה של ממצאים מתרבית תאים להגדרות in vivo. בנוסף, ייתכן שהפנוטיפ המתכווץ של SMCs בדרכי הנשימה הפרוקסימליות המבודדות או בקטעי כלי הדם של כלי הדם אינו מייצג את ה-SMCs בריאה הדיסטלית 6,7. יתר על כן, מדידת כוח השריר ברמת הרקמה נותרה מנותקת מאירועים מולקולריים ותאיים החיוניים לתובנה מכניסטית לגבי ויסות התכווצות.
פרוסת ריאה חתוכה במדויק (PCLS), מקטע רקמת ריאה חיה, מספקת כלי אקס-ויוו אידיאלי לאפיון SMCs ריאתיים במיקרו-סביבה כמעט in vivo (כלומר, ארכיטקטורה רב-תאית משומרת ואינטראקציה)13. מאז שד”ר פלאקה ופישר הציגו לראשונה את הכנת פרוסות הריאה מריות של חולדה מנופחת אגרוז וריאות אוגר בשנות ה-80של המאה ה-20, 14,15, טכניקה זו קודמה ברציפות כדי לספק ל-PCLSs איכות גבוהה יותר ורב-תכליתיות רבה יותר למחקר ביו-רפואי. שיפור משמעותי אחד הוא שיפור שימור עורקי הריאה על ידי עירוי ג’לטין בנוסף לניפוח הריאות עם אגרוז דרך קנה הנשימה. כתוצאה מכך, הן דרכי הנשימה והן העורקים הריאתיים נשמרים שלמים ב- PCLS להערכת ex vivo 16. יתר על כן, ה- PCLS הוא בר קיימא במשך זמן ממושך בתרבות. לדוגמה, ל-PCLS של עכברים לא היה שינוי משמעותי בכדאיות התאים ובחילוף החומרים במשך 12 ימים לפחות בתרבית, כמו גם, הם שמרו על התכווצות דרכי הנשימה עד 7 ימיםו-17 ימים. בנוסף, PCLS שומר על דרכי אוויר או כלי דם בגדלים שונים לבדיקות התכווצות והרפיה. יתר על כן, ניתן לבחון איתות Ca2+ תוך-תאי של SMCs, הגורם הקובע של התכווצות התאים, באמצעות צבעי כתב Ca2+ המצולמים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי או 2-פוטון13.
בהתחשב ביישום הנרחב של מודל העכבר בחקר הריאות, פרוטוקול מפורט מתואר כאן להכנת PCLS של עכבר עם דרכי נשימה שלמות ועורקים תוך-פולמונריים למחקר ריאות ex vivo . באמצעות ה- PCLSs המוכנים, הדגמנו לאחר מכן כיצד להעריך את תגובות דרכי הנשימה והעורקים הריאתיים לגירויים מכווצים או מרגיעים. בנוסף, מתוארת גם השיטה של טעינת ה- PCLS עם צבע כתב Ca2+ ולאחר מכן הדמיה של איתות Ca2+ של SMCs הקשורים לתגובות מתכווצות או מרגיעות.
הכנת PCLS כוללת מספר שלבים קריטיים. ראשית, חיוני לנפח את אונת הריאה באופן הומוגני כדי למנוע את השונות של נוקשות הרקמה מהתפלגות אגרוז לא אחידה. מכיוון שהאגרוז הנוזלי מתנגש במהירות בצנתרים דקים או בדרכי הנשימה בטמפרטורה הנמוכה מ-37 מעלות צלזיוס, פגם המילוי שנוצר כתוצאה מכך בשדה הריאה הדיסטלי ע?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
1 mL syringe | BD | 309626 | |
15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
3 mL syringe | BD | 309585 | |
50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |