정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구
Summary
본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.
Abstract
평활근 세포 (SMC)는기도와 폐 동맥의 수축을 매개하여 기류 저항과 폐 순환을 각각 수정하므로 폐 시스템의 항상성에 중요한 역할을합니다. SMC 수축성의 규제 완화는 천식 및 폐 고혈압을 포함한 여러 폐 질환에 기여합니다. 그러나, 제한된 조직 접근과 생체내 SMC 표현형을 유지하기 위한 배양 시스템의 부족으로 인해, 이들 질환에서 탈조절된 SMC 수축성의 기초가 되는 분자 메커니즘은 완전히 확인된 채로 남아 있다. 정밀 절단 폐 슬라이스 (PCLS)는 이러한 기술적 어려움을 우회하는 생체 외 모델을 제공합니다. 살아있는 얇은 폐 조직 절편으로서 PCLS는 자연 환경에서 SMC를 유지하고 SMC 수축을 조절하는 SMC 수축 및 세포 내 Ca2+ 신호전달의 현장 추적을 허용합니다. 여기에서, 상세한 마우스 PCLS 준비 프로토콜이 제공되며, 이는 온전한 기도 및 폐동맥을 보존한다. 이 프로토콜은 폐 엽을 슬라이스하기 전에 두 가지 필수 단계를 포함합니다 : 기관을 통해 저융점 아가로오스로기도를 팽창시키고 우심실을 통해 젤라틴으로 폐 혈관을 채우십시오. 이 프로토콜을 사용하여 제조된 PCLS는 기도 및 폐내 동맥 구획 모두에서 SMC의Ca2+ 매개 수축 조절을 평가하기 위한 생물 검정에 사용될 수 있습니다. 호흡기 질환의 마우스 모델에 적용될 때,이 프로토콜은 SMC의 기능적 조사를 가능하게하여 질병에서 SMC 수축성 조절 완화의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
Introduction
평활근 세포 (SMC)는 폐의 주요 구조 세포 유형으로, 주로기도와 폐 혈관의 배지 벽에 상주합니다. SMC는 발광 구경을 변경하여 공기와 혈류를 조절하는 계약을 체결합니다 1,2. 따라서 SMC의 수축 조절은 공기 환기 및 폐 순환의 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 대조적으로, 비정상적인 SMC 수축성은 천식 및 폐 동맥 고혈압과 같은 폐쇄성 기도 또는 폐 혈관 질환을 유발합니다. 그러나, 폐 SMCs의 기능적 평가는 폐 조직, 특히 폐 2,3의 원위 부분에서의 작은 기도 및 미세혈관에 대한 제한된 접근에 의해 도전 받고 있다. 현재의 솔루션은 기도 수축을 반영하기 위해 Flexivent에 의한 기류 저항을 측정하고, 폐 혈관 수축을 평가하기 위해 우심 카테터 삽입에 의한 폐 동맥 혈압을 검사하는 것과 같은 간접 분석에 의존합니다 4,5. 그러나, 이러한 간접 분석은 구조적 요인에 의해 혼동되고, 전체 폐 규모6,7에서 기도 또는 혈관 반응의 공간적 다양성을 포착하지 못하고, 세포 수준에서 수축 조절에 대한 기계론적 연구에 부적합하다는 것과 같은 여러 단점을 갖는다. 따라서, 단리된 일차 세포, 기관지/기관지 근육 스트립(8,9) 또는 큰 혈관 세그먼트(10)를 사용하는 대안적인 접근법이 시험관내 SMC 연구를 위해 적용되었다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법에도 한계가 있습니다. 예를 들어, 배양 조건(11,12)에서 일차 SMCs의 빠른 표현형 적응은 세포 배양으로부터 생체내 설정으로 소견을 추정하는 것을 문제시한다. 또한, 단리된 근위 기도 또는 혈관 세그먼트 내의 SMCs의 수축성 표현형은 원위 폐 6,7에서 SMCs를 나타내지 않을 수 있다. 또한, 조직 수준에서의 근육력 측정은 수축 조절에 대한 기계론적 통찰력에 필수적인 분자 및 세포 사건과 분리되어 있습니다.
살아있는 폐 조직 절편인 정밀 절단 폐 절편(PCLS)은 근적외선 미세환경(즉, 보존된 다세포 구조 및 상호작용)13에서 폐 SMC를 특성화하기 위한 이상적인 생체외 도구를 제공한다. Placke 박사와 Fisher 박사는 1980 년대14,15 년대에 아가로스 팽창 쥐와 햄스터 폐에서 폐 조각의 제조를 처음 도입 한 이래로,이 기술은 PCLS에 생물 의학 연구를위한 더 높은 품질과 더 큰 다양성을 제공하기 위해 지속적으로 발전해 왔습니다. 한 가지 중요한 개선은 기관을 통한 아가로오스로 인한 폐 인플레이션 외에도 젤라틴 주입에 의한 폐 동맥 보존의 향상입니다. 그 결과, 기도 및 폐동맥 둘 모두는 생체외 평가(16)를 위해 PCLS에서 온전하게 유지된다. 또한, PCLS는 문화에서 오랜 시간 동안 실행 가능합니다. 예를 들어, 마우스 PCLSs는 배양에서 최소 12일 동안 세포 생존력 및 대사에 큰 변화가 없었으며, 뿐만 아니라,17일까지 7일 동안 기도 수축성을 유지하였다. 또한 PCLS는 수축 및 이완 분석을 위해 다양한 크기의 기도 또는 혈관을 유지합니다. 더욱이, 세포 수축성의 결정인자인 SMCs의 세포내 Ca2+ 신호전달은 공초점 또는2-광자 현미경(13)에 의해 이미지화된Ca2+ 리포터 염료로 검정될 수 있다.
폐 연구에서 마우스 모델의 광범위한 적용을 고려할 때, 생체외 폐 연구를 위해 무손상 기도 및 폐동맥을 갖는 마우스 PCLS를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 여기에 기술되어 있다. 준비된 PCLS를 사용하여, 우리는 수축성 또는 이완제 자극에 대한기도 및 폐 동맥 반응을 평가하는 방법을 후속 시연했습니다. 또한, PCLS를 Ca2+ 리포터 염료로 로딩한 다음, 수축성 또는 이완제 반응과 관련된 SMCs의Ca2+ 신호전달을 이미징하는 방법이 또한 기재되어 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCLS의 준비에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫째, 고르지 않은 아가로스 분포로부터 조직 경화의 변화를 피하기 위해 폐 엽을 균질하게 팽창시키는 것이 필수적이다. 액체 아가로스가 37°C 이하의 온도에서 얇은 카테터 또는 기도에서 빠르게 겔화됨에 따라, 원위 폐 필드의 결과적인 충전 결함은 폐 조직 강성의 불균형을 증가시키고 비브라톰 섹션 동안 조직 찢어짐을 야기할 수 있다. 따?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A)에 의해 지원됩니다.
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
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