Utilizando la rebanada pulmonar cortada con precisión para estudiar la regulación contráctil de las vías respiratorias y el músculo liso arterial intrapulmonar
Summary
El presente protocolo describe la preparación y utilización de cortes pulmonares cortados con precisión en ratones para evaluar la contractilidad del músculo liso arterial intrapulmonar y de las vías respiratorias en un entorno casi in vivo .
Abstract
Las células del músculo liso (SMC) median la contracción de las vías respiratorias y la arteria intrapulmonar para modificar la resistencia al flujo de aire y la circulación pulmonar, respectivamente, desempeñando así un papel crítico en la homeostasis del sistema pulmonar. La desregulación de la contractilidad de SMC contribuye a varias enfermedades pulmonares, incluyendo el asma y la hipertensión pulmonar. Sin embargo, debido al acceso limitado a los tejidos y la falta de sistemas de cultivo para mantener fenotipos de SMC in vivo , los mecanismos moleculares subyacentes a la contractilidad desregulada de SMC en estas enfermedades permanecen completamente identificados. La rodaja pulmonar cortada con precisión (PCLS) ofrece un modelo ex vivo que evita estas dificultades técnicas. Como una sección de tejido pulmonar delgado y vivo, el PCLS retiene SMC en un entorno natural y permite el seguimiento in situ de la contracción de SMC y la señalización intracelular de Ca2 + que regula la contractilidad de SMC. Aquí, se proporciona un protocolo detallado de preparación de PCLS de ratón, que preserva las vías respiratorias intactas y las arterias intrapulmonares. Este protocolo implica dos pasos esenciales antes de someter el lóbulo pulmonar a corte: inflar la vía aérea con agarosa de bajo punto de fusión a través de la tráquea y rellenar los vasos pulmonares con gelatina a través del ventrículo derecho. El PCLS preparado utilizando este protocolo se puede utilizar para bioensayos para evaluar la regulación contráctil mediada por Ca2+ de SMC tanto en la vía aérea como en los compartimentos arteriales intrapulmonares. Cuando se aplica a modelos de ratón de enfermedades respiratorias, este protocolo permite la investigación funcional de SMC, proporcionando así información sobre el mecanismo subyacente de desregulación de la contractilidad de SMC en enfermedades.
Introduction
La célula del músculo liso (SMC) es un tipo de célula estructural importante en el pulmón, que reside principalmente en la pared media de las vías respiratorias y los vasos pulmonares. Los SMC se contraen para alterar el calibre luminal, regulando así el aire y el flujo sanguíneo 1,2. Por lo tanto, la regulación contráctil de los SMC es esencial para mantener la homeostasis de la ventilación del aire y la circulación pulmonar. Por el contrario, la contractilidad aberrante de SMC provoca enfermedades vasculares pulmonares o obstructivas de las vías respiratorias como el asma y la hipertensión arterial pulmonar. Sin embargo, la evaluación funcional de los SMC pulmonares se ha visto desafiada por el acceso limitado al tejido pulmonar, especialmente aquellas vías respiratorias pequeñas y microvasos en la parte distal del pulmón 2,3. Las soluciones actuales recurren a ensayos indirectos, como la medición de la resistencia al flujo de aire por Flexivent para reflejar la constricción de las vías respiratorias, y la comprobación de la presión arterial pulmonar mediante cateterismo cardíaco derecho para evaluar la vasocontracción pulmonar 4,5. Sin embargo, estos ensayos indirectos tienen múltiples desventajas, como ser confundidos por factores estructurales, no capturar la diversidad espacial de las respuestas respiratorias o vasculares en toda la escala pulmonar 6,7, e inadecuados para el estudio mecanicista de la regulación contráctil a nivel celular. Por lo tanto, se han aplicado enfoques alternativos utilizando células primarias aisladas, tiras musculares de tráquea / bronquios 8,9 o grandes segmentos vasculares10 para el estudio SMC in vitro. Sin embargo, estos métodos también tienen limitaciones. Por ejemplo, una rápida adaptación fenotípica de los SMC primarios en la condición de cultivo11,12 hace que sea problemático extrapolar los hallazgos del cultivo celular a los entornos in vivo. Además, el fenotipo contráctil de las CME en los segmentos aislados de la vía aérea proximal o vascular puede no representar las CME en el pulmón distal 6,7. Además, la medición de la fuerza muscular a nivel tisular permanece disociada de los eventos moleculares y celulares que son esenciales para la comprensión mecanicista de la regulación contráctil.
La rebanada pulmonar cortada con precisión (PCLS), una sección de tejido pulmonar vivo, proporciona una herramienta ex vivo ideal para caracterizar las SMC pulmonares en un microambiente casi in vivo (es decir, arquitectura e interacción multicelular preservada)13. Desde que los doctores Placke y Fisher introdujeron por primera vez la preparación de rodajas pulmonares a partir de pulmones de rata y hámster inflados con agarosa en ladécada de 1980 14,15, esta técnica se ha avanzado continuamente para proporcionar a los PCLS una mayor calidad y una mayor versatilidad para la investigación biomédica. Una mejora significativa es la mejora de la preservación arterial pulmonar mediante infusión de gelatina, además de la inflación pulmonar con agarosa a través de la tráquea. Como resultado, tanto las vías respiratorias como las arterias pulmonares se mantienen intactas en el PCLS para la evaluación ex vivo 16. Además, el PCLS es viable durante un tiempo prolongado en cultivo. Por ejemplo, los PCLS de ratón no tuvieron cambios significativos en la viabilidad celular y el metabolismo durante un mínimo de 12 días en cultivo, así como, retuvieron la contractilidad de las vías respiratorias durante un máximo de 7 días17. Además, PCLS mantiene vías respiratorias o vasos de diferentes tamaños para ensayos de contracción y relajación. Además, la señalización intracelular de Ca2+ de las SMC, el factor determinante de la contractilidad celular, se puede ensayar con colorantes reporteros de Ca2+ fotografiados por un microscopio confocal o de 2 fotones13.
Teniendo en cuenta la amplia aplicación del modelo de ratón en la investigación pulmonar, aquí se describe un protocolo detallado para preparar PCLS de ratón con vías respiratorias y arterias intrapulmonares intactas para la investigación pulmonar ex vivo . Utilizando los PCLS preparados, posteriormente demostramos cómo evaluar las respuestas arteriales respiratorias y pulmonares a estímulos constrictivos o relajantes. Además, también se describe el método de carga del PCLS con colorante reportero Ca2+ y luego la obtención de imágenes de la señalización ca2+ de los SMC asociados con respuestas contráctiles o relajantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparación de PCLS implica varios pasos críticos. En primer lugar, es esencial inflar el lóbulo pulmonar de manera homogénea para evitar la variación de la rigidez del tejido por la distribución desigual de la agarosa. A medida que la agarosa líquida se gelifica rápidamente en catéteres delgados o vías respiratorias a una temperatura inferior a 37 ° C, el defecto de llenado resultante en el campo pulmonar distal podría aumentar la disparidad de rigidez del tejido pulmonar y causar desgarro del tejido dura…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está respaldado por subvenciones de los NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
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