वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों के सिकुड़ा हुआ विनियमन का अध्ययन करने के लिए प्रेसिजन-कट फेफड़े के टुकड़े का उपयोग करना
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल लगभग विवो परिवेश में वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों के संकुचन का आकलन करने के लिए माउस परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस तैयार करने और उपयोग करने का वर्णन करता है।
Abstract
चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी) क्रमशः एयरफ्लो प्रतिरोध और फुफ्फुसीय परिसंचरण को संशोधित करने के लिए वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनी के संकुचन की मध्यस्थता करती हैं, इसलिए फुफ्फुसीय प्रणाली के होमोस्टैसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एसएमसी संकुचन का विनियमन अस्थमा और फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप सहित कई फुफ्फुसीय बीमारियों में योगदान देता है। हालांकि, सीमित ऊतक पहुंच और विवो एसएमसी फेनोटाइप में बनाए रखने के लिए संस्कृति प्रणालियों की कमी के कारण, इन बीमारियों में विनियमित एसएमसी संकुचन के अंतर्निहित आणविक तंत्र पूरी तरह से पहचाने जाते हैं। सटीक कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस) एक पूर्व विवो मॉडल प्रदान करता है जो इन तकनीकी कठिनाइयों को दरकिनार करता है। एक जीवित, पतले फेफड़ों के ऊतक अनुभाग के रूप में, पीसीएलएस प्राकृतिक परिवेश में एसएमसी को बरकरार रखता है और एसएमसी संकुचन और इंट्रासेल्युलर सीए2 + सिग्नलिंग के सीटू ट्रैकिंग में अनुमति देता है जो एसएमसी संकुचन को नियंत्रित करता है। यहां, एक विस्तृत माउस पीसीएलएस तैयारी प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जो बरकरार वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनियों को संरक्षित करता है। इस प्रोटोकॉल में फेफड़ों के लोब को टुकड़ा करने की क्रिया के अधीन करने से पहले दो आवश्यक चरण शामिल हैं: श्वासनली के माध्यम से कम पिघलने-बिंदु एगरोज के साथ वायुमार्ग को फुलाना और दाएं वेंट्रिकल के माध्यम से जिलेटिन के साथ फुफ्फुसीय वाहिकाओं को भरना। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए पीसीएलएस का उपयोग वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनी डिब्बों दोनों में एसएमसी के सीए2 +-मध्यस्थता सिकुड़ा हुआ विनियमन का मूल्यांकन करने के लिए बायोएसेस के लिए किया जा सकता है। जब श्वसन रोगों के माउस मॉडल पर लागू किया जाता है, तो यह प्रोटोकॉल एसएमसी की कार्यात्मक जांच को सक्षम बनाता है, जिससे रोगों में एसएमसी संकुचन विनियमन के अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है।
Introduction
चिकनी मांसपेशी कोशिका (एसएमसी) फेफड़ों में एक प्रमुख संरचनात्मक कोशिका प्रकार है, जो मुख्य रूप से वायुमार्ग और फुफ्फुसीय वाहिकाओं की मीडिया दीवार में रहती है। एसएमसी ल्यूमिनल कैलिबर को बदलने के लिए अनुबंध करते हैं, इस प्रकार हवा और रक्त प्रवाह 1,2 को विनियमित करते हैं। इसलिए, वायु वेंटिलेशन और फुफ्फुसीय परिसंचरण के होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए एसएमसी का सिकुड़ा हुआ विनियमन आवश्यक है। इसके विपरीत, विचलित एसएमसी संकुचन प्रतिरोधी वायुमार्ग या फुफ्फुसीय संवहनी रोगों जैसे अस्थमा और फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप को उत्तेजित करता है। हालांकि, फेफड़ों के एसएमसी के कार्यात्मक मूल्यांकन को फेफड़ों के ऊतकों तक सीमित पहुंच से चुनौती दी गई है, विशेष रूप से फेफड़ोंके 2,3 के बाहर के हिस्से में उन छोटे वायुमार्ग और माइक्रोवेसल्स। वर्तमान समाधान अप्रत्यक्ष परख का सहारा लेते हैं, जैसे वायुमार्ग कसना को प्रतिबिंबित करने के लिए फ्लेक्सिवेंट द्वारा एयरफ्लो प्रतिरोध को मापना, और फुफ्फुसीय वाहिकासंकीर्णन 4,5 का आकलन करने के लिए सही हृदय कैथीटेराइजेशन द्वारा फुफ्फुसीय धमनी रक्तचाप की जांच करना। हालांकि, इन अप्रत्यक्ष परखों के कई नुकसान हैं, जैसे संरचनात्मक कारकों से भ्रमित होना, पूरे फेफड़ों के पैमाने 6,7 में वायुमार्ग या संवहनी प्रतिक्रियाओं की स्थानिक विविधता को पकड़ने में विफल रहना, और सेलुलर स्तर पर सिकुड़ा हुआ विनियमन के यंत्रवत अध्ययन के लिए अनुपयुक्त। इसलिए, पृथक प्राथमिक कोशिकाओं, श्वासनली / ब्रांकाई मांसपेशी स्ट्रिप्स 8,9, या बड़े संवहनी खंड10 का उपयोग करके वैकल्पिक दृष्टिकोण इन विट्रो में एसएमसी अध्ययन के लिए लागू किए गए हैं। फिर भी, इन तरीकों की सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, संस्कृति की स्थिति11,12 में प्राथमिक एसएमसी का एक त्वरित फेनोटाइपिकल अनुकूलन सेल संस्कृति से विवो सेटिंग्स में निष्कर्षों को एक्सट्रपलेशन करने के लिए समस्याग्रस्त बनाता है। इसके अलावा, पृथक समीपस्थ वायुमार्ग या संवहनी खंडों में एसएमसी का सिकुड़ा हुआ फेनोटाइप डिस्टल फेफड़े 6,7 में एसएमसी का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसके अलावा, ऊतक स्तर पर मांसपेशी बल माप आणविक और सेलुलर घटनाओं से अलग रहता है जो सिकुड़ा हुआ विनियमन में यंत्रवत अंतर्दृष्टि के लिए आवश्यक हैं।
प्रेसिजन-कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस), एक जीवित फेफड़े के ऊतक अनुभाग, फुफ्फुसीय एसएमसी को निकट विवो माइक्रोएनवायरनमेंट (यानी, संरक्षित बहु-सेलुलर वास्तुकला और बातचीत) में चिह्नित करने के लिए एक आदर्श पूर्व विवो उपकरण प्रदान करता है। प्लैक और फिशर ने पहली बार 1980 के दशक 14,15 में एगरोज-फुलाए हुए चूहे और हैम्स्टर फेफड़ों से फेफड़ों के स्लाइसकी तैयारी शुरू की थी, इसलिए इस तकनीक को जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता और अधिक बहुमुखी प्रतिभा के साथ पीसीएलएसएस प्रदान करने के लिए लगातार उन्नत किया गया है। एक महत्वपूर्ण सुधार श्वासनली के माध्यम से एगरोज के साथ फेफड़ों की मुद्रास्फीति के अलावा जिलेटिन जलसेक द्वारा फुफ्फुसीय धमनी संरक्षण की वृद्धि है। नतीजतन, वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनियों दोनों को पूर्व विवो मूल्यांकन16 के लिए पीसीएलएस में बरकरार रखा जाता है। इसके अलावा, पीसीएलएसएस संस्कृति में लंबे समय तक व्यवहार्य है। उदाहरण के लिए, माउस पीसीएलएसएस में संस्कृति में कम से कम 12 दिनों के लिए सेल व्यवहार्यता और चयापचय में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ, साथ ही, उन्होंने 7 दिनों17 दिनों तक वायुमार्ग संकुचन को बनाए रखा। इसके अलावा, पीसीएलएस संकुचन और विश्राम परख के लिए विभिन्न आकार के वायुमार्ग या जहाजों को रखता है। इसके अलावा, एसएमसी के इंट्रासेल्युलर सीए2 + सिग्नलिंग, सेल सिकुड़न का निर्धारक कारक, सीए2 + रिपोर्टर रंगों के साथ एक कॉन्फोकल या 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप13 द्वारा चित्रित किया जा सकता है।
फेफड़ों के अनुसंधान में माउस मॉडल के व्यापक अनुप्रयोग को ध्यान में रखते हुए, पूर्व विवो फेफड़ों के अनुसंधान के लिए बरकरार वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनियों के साथ माउस पीसीएलएस तैयार करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। तैयार पीसीएलएसएस का उपयोग करते हुए, हमने बाद में दिखाया कि संकुचित या आराम उत्तेजनाओं के लिए वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कैसे किया जाए। इसके अलावा, सीए2 + रिपोर्टर डाई के साथ पीसीएलएस लोड करने की विधि और फिर सिकुड़ा हुआ या आराम प्रतिक्रियाओं से जुड़े एसएमसी के इमेजिंग सीए2 + सिग्नलिंग का भी वर्णन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पीसीएलएस की तैयारी में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। सबसे पहले, असमान एगरोज़ वितरण से ऊतक कठोरता की भिन्नता से बचने के लिए फेफड़ों के लोब को सजातीय रूप से फुलाना आवश्यक है। चूंकि तरल एगरोज 37 डिग्री सेल्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच अनुदान, के08135443 (वाईबी), 1 आर01एचएल132991 (एक्सए) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
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