Bruk av presisjonskuttet lungeskive for å studere kontraktil regulering av luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskulatur

Summary

Den nåværende protokollen beskriver å forberede og bruke musepresisjonskuttede lungeskiver for å vurdere luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskelkontraktilitet i et nesten in vivo miljø.

Abstract

Glatte muskelceller (SMC) formidler sammentrekningen av luftveien og den intrapulmonale arterien for å modifisere henholdsvis luftstrømmotstand og lungesirkulasjon, og spiller dermed en kritisk rolle i homeostase av lungesystemet. Deregulering av SMC-kontraktilitet bidrar til flere lungesykdommer, inkludert astma og pulmonal hypertensjon. På grunn av begrenset vevstilgang og mangel på dyrkningssystemer for å opprettholde in vivo SMC-fenotyper, forblir imidlertid molekylære mekanismer som ligger til grunn for den deregulerte SMC-kontraktiliteten i disse sykdommene fullstendig identifisert. Den presisjonskuttede lungeskiven (PCLS) tilbyr en ex vivo-modell som omgår disse tekniske vanskelighetene. Som en levende, tynn lungevevsseksjon beholder PCLS SMC i naturlige omgivelser og tillater in situ-sporing av SMC-sammentrekning og intracellulær Ca^2+- signalering som regulerer SMC-kontraktilitet. Her er en detaljert mus PCLS forberedelsesprotokoll gitt, som bevarer intakte luftveier og intrapulmonale arterier. Denne protokollen innebærer to viktige trinn før du utsetter lungelappen for kutting: oppblåsing av luftveiene med lavsmeltepunktsagarose gjennom luftrøret og innfylling av lungekar med gelatin gjennom høyre ventrikel. PCLS fremstilt ved hjelp av denne protokollen kan brukes til bioassays for å evaluere Ca^{2 +} -mediert kontraktil regulering av SMC i både luftveier og intrapulmonale arterielle rom. Når den brukes på musemodeller av respiratoriske sykdommer, muliggjør denne protokollen funksjonell undersøkelse av SMC, og gir dermed innsikt i den underliggende mekanismen for SMC-kontraktilitetsderegulering i sykdommer.

Introduction

Glatt muskelcelle (SMC) er en viktig strukturell celletype i lungen, primært bosatt i medieveggen i luftveiene og lungekarene. SMC-er trekker seg sammen for å endre luminalkaliberet, og dermed regulere luft og blodstrøm ^1,2. Derfor er kontraktil regulering av SMC avgjørende for å opprettholde homeostase av luftventilasjon og lungesirkulasjon. I motsetning til dette fremkaller avvikende SMC-kontraktilitet obstruktiv luftvei eller lunge vaskulære sykdommer som astma og pulmonal arteriell hypertensjon. Den funksjonelle vurderingen av lunge-SMCer har imidlertid blitt utfordret av begrenset tilgang til lungevevvet, spesielt de små luftveiene og mikroveslene i den distale delen av lungen ^2,3. Nåværende løsninger benytter seg av indirekte analyser, for eksempel måling av luftstrømmotstand av Flexivent for å reflektere luftveisinnsnevring, og kontroll av pulmonalt arterielt blodtrykk ved høyre hjertekateterisering for å vurdere pulmonal vasokokontraksjon ^4,5. Imidlertid har disse indirekte analysene flere ulemper, for eksempel å bli forvirret av strukturelle faktorer, ikke fange det romlige mangfoldet av luftveier eller vaskulære responser i hele^{lungeskalaen 6,7}, og uegnet for den mekanistiske studien av kontraktil regulering på mobilnivå. Derfor har alternative tilnærminger ved bruk av isolerte primære celler, luftrør / bronkie muskelstrimler ^8,9 eller store vaskulære segmenter¹⁰ blitt brukt for SMC-studien in vitro. Likevel har disse metodene også begrensninger. For eksempel gjør en rask fenotypisk tilpasning av primære SMCer i kulturtilstanden ^11,12 det problematisk å ekstrapolere funn fra cellekultur til in vivo-innstillinger. I tillegg kan den kontraktile fenotypen av SMC i de isolerte proksimale luftveis- eller vaskulære segmentene ikke representere SMC-ene i den distale lungen ^6,7. Videre forblir muskelkraftmålingen på vevsnivå dissosiert fra molekylære og cellulære hendelser som er avgjørende for mekanistisk innsikt i kontraktil regulering.

Presisjonskuttet lungeskive (PCLS), en seksjon for levende lungevev, gir et ideelt ex vivo-verktøy for å karakterisere lunge-SMCer i et nær in vivo mikromiljø (dvs. bevart multicellulær arkitektur og interaksjon)¹³. Siden Dr. Placke og Fisher først introduserte tilberedningen av lungeskiver fra agaroseoppblåste rotte- og hamsterlunger på 1980-tallet^14,15, har denne teknikken blitt avansert kontinuerlig for å gi PCLSer høyere kvalitet og større allsidighet for biomedisinsk forskning. En signifikant forbedring er forbedring av pulmonal arteriell bevaring ved gelatininfusjon i tillegg til lungeinflasjon med agarose via luftrøret. Som et resultat holdes både luftveier og lungearterier intakte i PCLS for ex vivo-vurdering ¹⁶. Videre er PCLS levedyktig i lengre tid i kulturen. For eksempel hadde mus PCLSer ingen signifikant endring i cellens levedyktighet og metabolisme i minst 12 dager i kultur, så vel som de beholdt luftveiskontraktiliteten i opptil 7 dager¹⁷. I tillegg holder PCLS forskjellige størrelser luftveier eller fartøy for sammentrekning og avslapningsanalyser. Videre kan intracellulær Ca²⁺ signalering av SMC, den determinantfaktoren for cellekontraktilitet, analyseres med Ca²⁺ reporterfarger avbildet av et konfokalt eller 2-foton mikroskop¹³.

Med tanke på den omfattende anvendelsen av musemodellen i lungeforskning, er en detaljert protokoll beskrevet her for å forberede mus PCLS med intakte luftveier og intrapulmonale arterier for ex vivo lungeforskning. Ved hjelp av de forberedte PCLSene demonstrerte vi deretter hvordan man evaluerer luftveis- og lungearterieresponsene på konstriktive eller relakserende stimuli. I tillegg beskrives også metoden for å laste PCLS med Ca²⁺ reporterfargestoff og deretter avbilde Ca^2+- signalering av SMC-er assosiert med kontraktile eller relakserende responser.

Protocol

All dyrepleie var i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts General Hospital. Villtype C57/B6 hannmus, 8 ukers alder, ble brukt i denne studien. 1. Eksperimentell forberedelse Forbered arbeidsløsningen. Forbered 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS, med Ca2+ og Mg2+, og pH balansert med 20 mM HEPES, se materialtabell). Bruk HBSS-løsningen til å klargjøre og behan…

Representative Results

Pcls-preparat fra mus som bevarer intakte intrapulmonale luftveier og arterierEn 150 μm tykk PCLS ble observert under det inverterte fasekontrastmikroskopet. I muselunger er ledende luftveier ledsaget av intrapulmonale arterier, som går fra hilus til perifer lunge. En representativ pulmonal luftveisarteriebunt i muse-PCLS er vist i figur 2B. Luftveien kan lett identifiseres av kuboidale epitelceller med aktiv cilial juling som fôrer den indre overflaten av lumen. I mo…

Discussion

Utarbeidelsen av PCLS innebærer flere kritiske trinn. For det første er det viktig å blåse opp lungelappen homogent for å unngå variasjon av vevsstivhet fra ujevn agarosefordeling. Siden væsken agarose raskt gelerer i tynne katetre eller luftveier ved en temperatur under 37 °C, kan den resulterende fyllingsdefekten i det distale lungefeltet øke forskjellen i stivhet i lungevevet og forårsake vevsrivning under vibratomsnittet. Derfor kan det praktiseres å holde den lavsmeltende agaroseoppløsningen ved 42 °C i…

Materials

1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter