Använda den precisionsskurna lungskivan för att studera kontraktil reglering av luftvägar och intrapulmonell arteriell glattmuskel
Summary
Det nuvarande protokollet beskriver beredning och användning av musprecisionsskurna lungskivor för att bedöma luftvägarna och intrapulmonell arteriell glattmuskelkontraktilitet i en nästan in vivo-miljö .
Abstract
Glattmuskelceller (SMC) förmedlar sammandragningen av luftvägarna och den intrapulmonella artären för att modifiera luftflödesmotståndet respektive lungcirkulationen och spelar därmed en kritisk roll i lungsystemets homeostas. Avreglering av SMC-kontraktilitet bidrar till flera lungsjukdomar, inklusive astma och pulmonell hypertension. På grund av begränsad vävnadstillgång och brist på odlingssystem för att upprätthålla in vivo SMC-fenotyper förblir molekylära mekanismer som ligger till grund för den avreglerade SMC-kontraktiliteten vid dessa sjukdomar fortfarande fullständigt identifierade. Den precisionsskurna lungskivan (PCLS) erbjuder en ex vivo-modell som kringgår dessa tekniska svårigheter. Som en levande, tunn lungvävnadssektion behåller PCLS SMC i naturliga omgivningar och möjliggör in situ-spårning av SMC-sammandragning och intracellulär Ca2+ -signalering som reglerar SMC-kontraktilitet. Här tillhandahålls ett detaljerat PCLS-beredningsprotokoll för mus som bevarar intakta luftvägar och intrapulmonala artärer. Detta protokoll innefattar två viktiga steg innan lungloben utsätts för skivning: blåsa upp luftvägarna med lågsmältpunktsagaros genom luftstrupen och fylla lungkärlen med gelatin genom höger kammare. PCLS framställd med hjälp av detta protokoll kan användas för bioassays för att utvärdera Ca2+-medierad kontraktil reglering av SMC i både luftvägarna och de intrapulmonella artärfacken. När det tillämpas på musmodeller av luftvägssjukdomar möjliggör detta protokoll funktionell undersökning av SMC, vilket ger insikt i den underliggande mekanismen för SMC-kontraktilitetsavreglering vid sjukdomar.
Introduction
Glattmuskelcell (SMC) är en viktig strukturell celltyp i lungan, som främst bor i medieväggen i luftvägar och lungkärl. SMC kontrakterar för att ändra den luminala kalibern och därmed reglera luft- och blodflödet 1,2. Därför är kontraktil reglering av SMC viktigt för att upprätthålla homeostasen för luftventilation och lungcirkulation. Däremot framkallar avvikande SMC-kontraktilitet obstruktiv luftväg eller lungkärlssjukdomar som astma och pulmonell arteriell hypertension. Den funktionella bedömningen av lung-SMC har dock utmanats av begränsad tillgång till lungvävnaden, särskilt de små luftvägarna och mikrovågorna i den distala delen av lungan 2,3. Nuvarande lösningar använder indirekta analyser, såsom mätning av luftflödesmotstånd av Flexivent för att återspegla luftvägsförträngning och kontroll av lungartäriellt blodtryck genom höger hjärtkateterisering för att bedöma lungvasokontraktion 4,5. Dessa indirekta analyser har emellertid flera nackdelar, såsom att de är förvirrade av strukturella faktorer, misslyckas med att fånga den rumsliga mångfalden av luftvägs- eller vaskulära svar i hela lungskalan 6,7 och olämpliga för den mekanistiska studien av kontraktil reglering på cellulär nivå. Därför har alternativa metoder med isolerade primära celler, luftstrupen/bronkimuskelremsor 8,9 eller stora vaskulära segment10 tillämpats för SMC-studien in vitro. Ändå har dessa metoder också begränsningar. Till exempel gör en snabb fenotypisk anpassning av primära SMC i odlingstillståndet11,12 det problematiskt att extrapolera fynd från cellodling till in vivo-inställningar. Dessutom kan kontraktilfenotypen av SMC i de isolerade proximala luftvägarna eller vaskulära segmenten inte representera SMC i den distala lungan 6,7. Dessutom förblir muskelkraftmätningen på vävnadsnivå dissocierad från molekylära och cellulära händelser som är väsentliga för mekanistisk insikt i kontraktil reglering.
Precisionsskuren lungskiva (PCLS), en levande lungvävnadssektion, ger ett idealiskt ex vivo-verktyg för att karakterisera pulmonella SMC i en nära in vivo mikromiljö (dvs. bevarad flercellig arkitektur och interaktion)13. Sedan Drs. Placke och Fisher först introducerade beredningen av lungskivor från agarosuppblåsta rått- och hamsterlungor på 1980-talet 14,15, har denna teknik utvecklats kontinuerligt för att ge PCLS med högre kvalitet och större mångsidighet för biomedicinsk forskning. En signifikant förbättring är förbättringen av lungartärbevarandet genom gelatininfusion utöver lunginflation med agaros via luftstrupen. Som ett resultat hålls både luftvägarna och lungartärerna intakta i PCLS för ex vivo-bedömning 16. Dessutom, PCLS är livskraftig under en längre tid i kulturen. Till exempel hade MUS-PCLS ingen signifikant förändring i cellviabilitet och metabolism under minst 12 dagar i odling, liksom de behöll luftvägskontraktilitet i upp till 7 dagar17. Dessutom håller PCLS luftvägar eller fartyg i olika storlekar för sammandragnings- och avslappningsanalyser. Dessutom kan intracellulär Ca2+ signalering av SMC, den avgörande faktorn för cellkontraktilitet, analyseras med Ca2+ reporterfärger avbildade av ett konfokalt eller 2-fotonmikroskop13.
Med tanke på den omfattande tillämpningen av musmodellen i lungforskning beskrivs här ett detaljerat protokoll för att förbereda mus-PCLS med intakta luftvägar och intrapulmonala artärer för ex vivo lungforskning. Med hjälp av de beredda PCLS:erna demonstrerade vi därefter hur man utvärderar luftvägs- och lungartärsvaren på sammandragande eller avslappnande stimuli. Dessutom beskrivs metoden för att ladda PCLS med Ca2+ reporterfärgämne och sedan avbilda Ca2+ signalering av SMC associerade med kontraktila eller avslappnande svar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förberedelsen av PCLS innebär flera kritiska steg. För det första är det viktigt att blåsa upp lungloben homogent för att undvika variation av vävnadsstyvhet från ojämn agarosfördelning. Eftersom den flytande agarosen snabbt gelerar i tunna katetrar eller luftvägar vid en temperatur under 37 °C, kan den resulterande fyllningsdefekten i det distala lungfältet öka skillnaden i lungvävnadsstyvhet och orsaka vävnadsrivning under vibratomsektionen. Därför kan man öva på att hålla den lågsmältande agaro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH-bidrag, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
- Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
- Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
- Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
- McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
- Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
- Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
- Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
- Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
- Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
- Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
- Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
- Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
- Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
- Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
- Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
- Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
- Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
- Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
- Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
- Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
- Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
- Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
- Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
- Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).
