في المختبر نموذج معوي قمي من التهاب الأمعاء والقولون الناخر
Summary
يصف هذا البروتوكول نموذجا لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر القمي (NEC) في طبق باستخدام الأمعاء المعوية الصغيرة ذات القطبية المعكوسة ، مما يسمح بالوصول إلى السطح القمي. نحن نقدم بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي للكشف عن الاضطراب الظهاري المرتبط ب NEC وطريقة لتحديد جدوى المعوية القمية الخارجة الخاضعة لبروتوكول NEC-in-a-dish.
Abstract
التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو مرض مدمر يصيب الأطفال الخدج ، ويتميز بالتهاب الأمعاء والنخر. ظهرت المعوية مؤخرا كنظام واعد لنمذجة أمراض الجهاز الهضمي. ومع ذلك ، فإن الطرق المستخدمة حاليا للتلاعب المعوي إما تفتقر إلى الوصول إلى السطح القمي للظهارة (ثلاثي الأبعاد [3D]) أو تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الاستخدام للموارد (الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد [2D]). غالبا ما تتطلب هذه الطرق خطوات إضافية ، مثل الحقن المجهري ، حتى يصبح النموذج قابلا للترجمة الفسيولوجية. هنا ، نصف بروتوكولا ذا صلة فسيولوجية وغير مكلف لدراسة NEC في المختبر عن طريق عكس القطبية المعوية ، مما يؤدي إلى مواجهة السطح القمي للخارج (القمي للخارج). كما يتم توفير بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي لفحص سلامة الحاجز المعوي وتعبير البروتين الموصل بعد التعرض لعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) أو عديد السكاريد الشحمي (LPS) في ظل ظروف النورموكسيك أو نقص الأكسجين. كما يتم تقييم جدوى المعوية القمية 3D المعرضة ل normoxic أو hypoxic LPS أو TNF-α لمدة 24 ساعة. أظهرت المعوية المعرضة إما LPS أو TNF-α ، بالاشتراك مع نقص الأكسجة ، اضطرابا في البنية الظهارية ، وفقدان تعبير بروتين الوصلة الملتصقة ، وانخفاض في صلاحية الخلايا. يصف هذا البروتوكول نموذجا جديدا ل NEC-in-a-dish من القمي يقدم منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وفعالة من حيث التكلفة لتحديد الأهداف الظهارية المحتملة لعلاجات NEC ودراسة الاستجابة المعوية المبكرة للعلاجات.
Introduction
التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) ، وهو مرض التهابي حاد في الأمعاء الدقيقة يحدث في ما يصل إلى 10 ٪ من الأطفال الخدج ، يرتبط عادة بارتفاع معدلات المراضة والوفيات 1,2. معدلات الوفيات التي تقترب من 50٪ في الرضع ذوي الوزن المنخفض جدا عند الولادة (<1500 جم) ، الذين يحتاجون إلى تدخل جراحي ، ليست غير شائعة3. في حين أن المسببات الدقيقة ل NEC غير مفهومة حاليا ، يعتقد أن عوامل الخطر ، مثل التغذية بالصيغة ، تتضاعف مع الشذوذ الفسيولوجي ، مثل dysbiosis ، وظهارة معوية غير ناضجة ، وحاجز معوي مختل وظيفيا ، في تطور المرض 2,4. على الرغم من الجهود الكبيرة المبذولة ، لم يحدث تقدم يذكر في الوقاية أو العلاج من NEC خلال العقد الماضي5. هناك حاجة إلى طريقة جديدة في المختبر لدراسة NEC واختلال الحاجز الظهاري المعوي المرتبط بها لتعزيز فهم التسبب في المرض ، حيث أن النتائج المستخلصة من النماذج الحيوانية قد ترجمت ، حتى الآن ، بشكل سيئ إلى جانب السرير6.
تم استخدام عدد من النماذج في المختبر للتحقيق في الآليات التي تعمل خلال NEC. خط الخلايا الظهارية المعوية البشرية ، Caco-2 ، هو من بين النماذج الأكثر استخداما في المختبر من NEC 7,8. تحاكي خلايا Caco-2 السمات المورفولوجية لحدود الفرشاة للأمعاء الدقيقة ، ولكن ، كخط خلوي ، لا تتمايز في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في الجسم الحي ، بما في ذلك الخلايا الكأسية المنتجة للمخاط ، المطلوبة لنموذج قابل للترجمة بدرجة عالية. HT-29-MTX ، خلايا سرطان القولون الغدي البشري ، تشمل الخلايا المعوية المختلطة والنمط الظاهري لخلية الكأس ، ولكنها لا تزال تفتقر إلى أنواع الخلايا القائمة على السرداب من الظهارة المعوية9. IEC-6 و IEC-18 عبارة عن خطوط خلوية غير محولة ذات مورفولوجيا غير ناضجة تشبه السرداب اللفائفي ولكنها غير مشتقة من الأنسجة البشرية ، مما يحد من قدرتها الانتقالية. تستمد خطوط الخلايا المعوية FHs 74-Int و H4 من أنسجة الجنين البشري ولا تشكل تقاطعات ضيقة أو طبقات أحادية مستقطبة10,11 ، وبالتالي فهي غير ناضجة مقارنة حتى بأكثر الأطفال الخدج عرضة ل NEC. عادة ، تستخدم نماذج NEC في المختبر علاجات عديد السكاريد الشحمي (LPS) للحث على مستقبلات تشبه الرسوم 4 (TLR4) ، وهي مستقبل رئيسي يبدأ التهاب الأمعاء في NEC12. غالبا ما يستخدم الضرر الذي يتم بوساطة معالجة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، عادة عن طريق بيروكسيد الهيدروجين ، للحث على تلف الأكسدة الشبيه ب NEC وموت الخلايا المبرمج13,14. كمحرك رئيسي لالتهاب الأمعاء ، يستخدم عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، وهو مكون مصب لإشارات TLR4 الالتهابية ، بشكل شائع في هذه النماذج في المختبر لتقليد التسبب في الجسم الحي 15.
نمت شعبية المواد العضوية ، الناتجة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) ، كنموذج في المختبر للأمعاء بسبب قدرتها على تلخيص المجمع في بنية الجسم الحي وتكوين الأنسجة من نوع الخلية التي تستمد منها16,17. نظام مخبري ذي صلة ، enteroids ، هي عضويات مشتقة من سراديب معوية مقطوعة يتم إنشاؤها وصيانتها بسهولة أكبر من المواد العضوية المشتقة من iPSC. عادة ما تزرع الأمعاء في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الخلية (ECM) مع وصول تجريبي يقتصر على سطح الخلية القاعدية. تم تطوير طرق ، مثل الحقن المجهري 18,19 ، للتغلب على هذا الحاجز أمام السطح القمي ، ولكن تراكم الحطام الخلوي المتخادع والمخاط داخل التجويف يجعل الحقن المجهري صعبا وغير متسق من الناحية الفنية. نظرا لأن منصات الحقن المجهري الروبوتية المخصصة لا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع20 ، فإن التباين من مختبر إلى مختبر في القدرة التقنية والتقنية العامة يصبح متغيرات مهمة للتغلب عليها باستخدام بروتوكولات الحقن المجهري. تسمح الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد (2D) المشتقة من الأمعاء ثلاثية الأبعاد المنفصلة ، والتي لا تزال تضم جميع أنواع الخلايا الرئيسية للظهارة المعوية ، بالوصول إلى السطح القمي ولكن كان من الصعب تقليديا الحفاظ عليها بدون طبقة مغذية من الخلايا الليفية العضلية الوسيطة21. في حين يمكن استخدام الدعامات النفاذة لزراعة الخلايا للوصول إلى كل من الجانبين القمي والقاعدي للطبقات الأحادية المعوية دون استخدام الخلايا الليفية العضلية الأساسية ، فإن هذه الإدخالات تتطلب استئصال الغشاء وتركيبه قبل الاستخدام بطرائق مثل المجهر البؤري ، مما يؤدي إلى عملية أكثر تطلبا من الناحية الفنية وصعوبة عند استخدام طرق الفحص المجهري التقليدية22. تم تصميم NEC في المختبر باستخدام المعوية التقليدية ثلاثية الأبعاد 23,24,25 ويدعمالنفاذية 26,27 ، وقد تم تكرار التهاب الأمعاء مؤخرا مع نماذج الأمعاء على رقاقة 28,29. في حين أن نماذج الأمعاء على رقاقة التي تتضمن الموائع الدقيقة هي ، إلى حد بعيد ، النماذج الأكثر تقدما والقابلة للترجمة ، فإن هذه التكنولوجيا باهظة الثمن ومعقدة ولا يمكن لمعظم الباحثين الوصول إليها30.
سمحت التطورات الحديثة في تقنيات الأمعاء القمية بالوصول بسهولة إلى السطح القمي للأمعاء ثلاثية الأبعاد دون المخاطرة بتلف السلامة الهيكلية للظهارة في المختبر 31،32،33. تشترك المعوية القمية في تكوين نوع الخلية ووظيفة الحاجز في الظهارة المعوية في الجسم الحي ، ولكن ، على عكس الأمعاء 3D النموذجية ، تواجه الأسطح القمية لهذه الخلايا وسط الثقافة ، مما يسمح بإجراء المزيد من الدراسات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية حول امتصاص العناصر الغذائية ، والعدوى الميكروبية ، والإفراز اللمعاني31. ميزة إضافية من المعوية القمية هي القدرة على توزيع العوامل التجريبية بشكل متجانس على الأمعاء. لا يلزم اختلاف أحجام العلاج بناء على حجم الأمعاء ، كما هو الحال مع الحقن المجهري ، والقدرة على الحفاظ على هذه الأمعاء في ثقافة التعليق تنفي أي تدخل ECM على انتشار العامل التجريبي32.
التهاب الأمعاء والقولون الناخر هو مرض متعدد العوامل ينطوي على أنواع متعددة من الخلايا الظهارية المعوية ومجموعة متنوعة من العوامل البيئية والفسيولوجية المرضية34. تكوين الخلايا المتنوعة من الأمعاء المعوية هو تحسن واضح على الثقافات الأحادية في نمذجة مرض معقد مثل NEC. ومن المثير للاهتمام ، في حين أن التعرض الالتهابي واحد غالبا ما يكون كافيا للحث على حدوث ضرر في المزارع الأحادية في المختبر ، يبدو أن الأمعاء ، كما هو الحال مع نماذج الفئران23 ، تتطلب ما لا يقل عن مكونين التهابيين للحث على تلف يشبه NEC6. هنا ، نقدم نموذجا ل NEC-in-a-dish ، باستخدام المعوية القمية الخارجية بالاشتراك مع نقص الأكسجة (ميزة سريرية مهمة ل NEC6) وإما LPS أو TNF-α ، كنموذج محسن وأكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر لدراسة الاستجابات الظهارية للالتهاب الشبيه ب NEC ، وربما تحديد الأهداف العلاجية. نحن نصف بروتوكولا لعكس قطبية الأمعاء المعوية الصغيرة 3D ، بالإضافة إلى بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي لتحديد اضطراب الحاجز الظهاري وتغيرات التعبير عن البروتين الوصلة. وأخيرا، نعرض أيضا فحصا بسيطا لجدوى الأمعاء لتحديد تأثير نموذج NEC-in-in-a-dish المزدوج الضربة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح التطور الأخير للنماذج المعوية المشتقة من الخبايا الظهارية المعوية بأنسجة مختبرية أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة التسبب في التهاب الأمعاء والقولون الناخر. على الرغم من تضمين جميع أنواع الخلايا المتمايزة الرئيسية في ظهارة الأمعاء ، إلا أن الأمعاء 3D لا تزال تخضع للعدي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم HC من خلال منحة P20GM134973 من المعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم KB من خلال منحة مؤسسة مستشفى الأطفال (CHF) ومؤسسة الصحة المشيخية (PHF). نشكر مختبر البيولوجيا الجزيئية وأبحاث قياس الخلايا في OUHSC على استخدام المرفق الأساسي ، الذي يوفر التصوير البؤري المنسق.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Cover Glass 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate | Sigma-Aldrich | AP182C | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| E-cadherin antibody (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| ImageJ | Fiji | N/A | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
| Leica SP8 Confocal Microscope | Leica Biosystems | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | 566460 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
| Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] | Abcam | ab130751 | |
| Recombinant Human TNF-α protein 100 µg | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
| SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
| TO-PRO-3 Iodide (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | Thermo Scientific | AB0350 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
References
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
- Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
- Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), 7067-7079 (2011).
- Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
- Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
- De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
- Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
- Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
- Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
- Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
- Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
- Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
- Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
- Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
- Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
- Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
- Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
- Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
- Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
- Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
- Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).
